单抗的发展与应用.ppt

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,2006 Accenture.All rights reserved.,*,*,Footnote,Source:Source,Roadmap,Subject Title,Unit of Measure,MASTER STAMP,*,Footnote,Source:Source,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,2006 Accenture.All rights reserved.,2006 Accenture.All rights reserved.,1,轻链（,L,）由约,214,个,amino acid,组成，分两种：,Kappa,（,）和,Lambda,（,），重链由,450-550,个,amino acid,组成，根据其抗原性差异可分为,5,种：,链、,链、,链、,链和,链。由此将免疫球蛋白分为,M,、,G,、,A,、,D,和,E,。,2006 Accenture.All rights reserved.,2,1,抗体技术的发展,抗体技术的发展,第一代,多克隆抗体,第二代,细胞工程抗体,第三代,基因工程抗体,单克隆抗体技术的发展,第,1,代单抗技术：鼠源性单克隆抗体,第,2,代单抗技术：嵌合性单克隆抗体,第,3,代单抗技术：人源化单克隆抗体,第,4,代单抗技术：全人源化单克隆抗体,2006 Accenture.All rights reserved.,3,1,细胞工程单克隆抗体,2006 Accenture.All rights reserved.,6,4,抗体库技术,抗体库按基因的来源可分为,：鼠源性抗体库，人源性抗体库和驼源性抗体库,抗体库展示技术,：噬菌体表面展示技术，酵母表面展示技术，核糖体展示技术,抗体库技术的优点：,1,不需要进行细胞融合，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。,2,扩大了筛选容量，可达到,10,6,以上的克隆，而杂交瘤技术一般只能筛选约,1000,个克隆。,3,可直接克隆到抗体的基因，便于进一步构建各种基因工程抗体。,4,得到的抗体可以进行原核表达，降低制备成本。,5,构建抗体库时由于,H,链和,L,链,V,区基因在体外随机组合，因而可以获得新的特异性抗体。,已有的噬菌体抗体库：抗,HIV,，麻疹病毒，破伤风类毒素，呼吸道合抱病毒，乙肝病毒，单纯疱疹病毒糖蛋白和,TNF-,等的抗体库。,2006 Accenture.All rights reserved.,7,构建方法,1,动物免疫,2,血清效价检测,3,淋巴细胞的分离纯化,4,总,RNA,提取,5,第一链,cDNA,反转录合成,6,轻、重链基因的扩增,7 scFv DNA,的组装与扩增,8 scFv DNA,片段的,Sfi I/Not I,酶切,9 pCANTAB5E scFv,重组质粒的构建,10,重组噬菌体的制备,11,库容量的滴定,12,单链抗体噬菌体抗体库的富集淘选,4.1,噬菌体展示技术构建和筛选,scFv,图片来源：苏州康宁杰瑞生物科技有限公司,2006 Accenture.All rights reserved.,8,4.2,噬菌体展示技术构建和筛选,Fab,抗体,构建方法,淋巴细胞分离、总,RNA,提取及,cDNA,的合成与,scFv,抗体库的构建相同,1 PCR,扩增,Fd,及轻链基因,2 PCR,扩增产物的纯化,3,轻链基因的克隆,4,重链,Fd,基因的克隆及噬菌体抗体库的建立和鉴定,5 Fd,基因的克隆及抗体库的建立,6,抗体库的富集和筛选,2006 Accenture.All rights reserved.,9,4.3,酵母表面展示技术,酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术之后发展起来的真核展示系统，不仅能筛选噬菌体抗体库的全部抗体，而且能筛选新型抗体，是噬菌体抗体库筛选抗体的两倍。,酵母存在,MATa,和,MAT 2,种交配型单倍体细胞。酵母表面展示技术有两种：,a,凝集素展示系统是将目的蛋白的,C,端与,a,凝集素的,Aga2,亚基的,N,端融合；,凝集素展示系统是将目的蛋白的,N,端与,凝集素的,C,端融合。,凝激素展示系统原理图,2006 Accenture.All rights reserved.,10,5,特殊基因工程抗体,1.7.1,双特异性抗体,BsAb,图片来源：武汉友芝友生物制药有限公司,利用基因重组和抗体工程技术，由大容量抗体库的构建及优化系统，高通量抗体筛选系统，体内体外抗体验证系统三大部分组成，制备高效的肿瘤治疗性抗体，对乳腺癌，淋巴瘤和结肠癌进行针对性的治疗。,细胞工程,BsAb,将,2,株分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞融合得到四源杂交瘤，就可以同时分泌具有两种亲代单克隆抗体结合特性的,BsAb,。其合成、组装与分泌过程和天然免疫球蛋白的产生过程相同，稳定性及药代动力学特征也与天然抗体相似。,2006 Accenture.All rights reserved.,11,6,人鼠嵌合单克隆抗体,为了消除人抗鼠抗体（,HAMA,）反应，使单抗更好的用于疾病治疗，人们设计了嵌合抗体。在基因水平上将鼠源单克隆抗体的,V,区和人抗体的,C,区连接起来，并在合适的宿主细胞中表达的抗体，成为人,-,鼠嵌合抗体。,Pr,鼠,V,L,人,C,L,人,C,H,免疫球蛋白基因载体的构建,L,链嵌合载体,共转染细胞,抗体分泌细胞,Pr,鼠,V,H,H,链嵌合载体,嵌合抗体的构建,已上市销售的人鼠嵌合抗体,：,Rituximab CD20,抗肿瘤、类风湿,Cetuximab EGFR antagonist,抗肿瘤,Clotinab,abciximab GPb a receptor,抗凝，心血管,antagonist,Infliximab TNF-antagonist,类风湿，克隆氏病等,Basiliximab IL-2 receptor antagonist,抗移植排斥,2006 Accenture.All rights reserved.,12,全人源化单抗,人源化技术的难点在于它需要大量的学科集成，非常复杂，因为任何氨基酸改变都会影响蛋白质结构、活性，而这方面又没有太多规范可以遵循，因此需要大量的实践和探索。这是单抗药物研发的核心技术,，也是未来的发展方向。,两个难点：一是抗体人源化技术，二是哺乳动物细胞规模化培养。,已上市的人源单抗：,Panitumumab EGFR antagonist,直肠癌,Adalimumab TNF antagonist,类风湿，克隆氏病等,Ustekinumab IL-12,IL-23 antagonist,银屑病,7,全人源化单克隆抗体,全人源化单抗的两条技术路线：,转基因小鼠技术,，,噬菌体展示技术,2006 Accenture.All rights reserved.,13,转基因小鼠技术,目前主要是人外周血淋巴细胞,-,严重联合免疫缺陷（,hu-PBL-SCID,）转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。,hu-PBL-SCID,转基因小鼠,将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的淋巴细胞导入严重联合免疫缺陷（,severe combined immunodeficiency,，,SCID,）小鼠，作为暂时的人免疫系统发挥有限的功能。然后取鼠的脾细胞与人骨髓瘤细胞杂交就可以获得分泌人抗体的杂交瘤细胞,转染色体小鼠,通过基因敲出技术使小鼠自身基因失活并导入新基因，创造出携带人抗体,H,、,L,链基因簇而自身抗体基因失活的转基因小鼠。此种小鼠所携带的人,DNA,片段具有完备的功能，可以有效的进行同种型转换和亲和力成熟。,亲和力成熟,：在抗原刺激下，抗体,V,区发生高频突变，具有高亲和力抗体的细胞群体获得优势而进一步扩增，同时经过类别转换，即不再表达,链、,链，而表达,、,或,而成熟。,2006 Accenture.All rights reserved.,14,2,抗体的市场和应用,单抗从最初的鼠源单抗过渡至人源化单抗直到现在的全人单抗,单克隆抗体的发展使抗体制备技术进入了一个全新的时代,其相关的药物已广泛应用到生物医学中的许多领域,如肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植、戒毒、血液性疾病、感染性疾病、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊断和治疗。,目前美国和欧盟已批准上市抗体药物,34,个，全球有近,300,家公司正在研究抗体药物，其中，临床研究抗体项目有,100,多个，在研项目超过,300,个。我国已批准上市抗体药物,18,种，其中进口,10,种，国内企业获得抗体新药证书,8,个，实现销售,4,种，临床研究抗体药物,13,种。（截止到,2012.12,）,2011,年全球抗体药物的市场规模为,671,亿美元。预计到,2020,年,生物技术药物占全部药品销售收入的比重将超过,1/3,。,据全球医药市场预测机构,EvaluatePharma,对,2012,年销售前,15,位药品的估计,今年生物技术产品全面崛起,其中销售前十强中,单克隆抗体药物占据五席。,名称,阿达木单抗,英利昔单抗,利妥昔单抗,曲妥珠单抗,贝伐珠单抗,排名,1,4,5,8,9,国内商品名,修美乐,类克,美罗华,赫赛汀,安维汀,所属企业,雅培,强生、默沙东,罗氏,罗氏,罗氏,2011,年销售额,79,亿美元,81.6,亿美元,61.4,亿美元,53.5,亿美元,54.1,亿美元,预计,2012,年销售额,94.8,亿美元,76.7,亿美元,69.4,亿美元,60.8,亿美元,59.8,亿美元,2006 Accenture.All rights reserved.,15,国内主要抗体公司,成都华神集团股份有限公司制药厂,华兰生物工程股份有限公司,上海兰生股份有限公司,北京天坛生物制品股份有限公司,上海中信国建药业股份有限公司,百泰生物药业有限公司,北京天广实生物技术有限公司,大连亚维药业有限公司,美恩生物技术有限公司,武汉生物制品研究所,上海张江生物技术有限公司,上海亚联抗体医药有限公司,国外主要抗体药物公司,瑞士罗氏公司,瑞士诺华公司,雅培制药公司,美国辉瑞公司,美国强生公司,Nov Immune,公司,Med Immune,公司,Micromet,公司,德国费森忧思集团,Macro Genic,公司,2006 Accenture.All rights reserved.,16,Thank you,！,