生物化学课件第11章转录(已改).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,以一段DNA链为模板合成RNA的过程称为,转录,RNA,DNA,转录（transcription）,转录过程动画,复制和转录的相同点,1、模板都为DNA,2,、,都需依赖DNA的聚合酶,3,、本质都是,形成磷酸二酯键,4,、,方向都为53,5,、,都遵循碱基互补配对原则,RNA生物合成体系,第一节,一、转录的模板,DNA分子上能转录出RNA的区段，称为,结构基因,(structural gene)。,能够转录RNA的那条DNA链称为,模板链,(template strand)，也称作,反义链,。,与mRNA互补,与模板链互补的另一条DNA链称为,编码链,(coding strand)，也称为,有义链,。mRNA一致（除UT）,3,5,5,3,不对称转录,结构基因,模板链,转录产物及方向,5,3,5,3,5,3,5,3,某一基因只能一股链做为模板，另一股链不转录,；,不同的基因模板链并非永远在同一条单链上。,5,3,3,5,模板链,编码链,编码链,模板链,转录方向,转录方向,模板链和编码链的相对性,5,GCAGTACATGTC,3,3,c g t g a t g t a c a g,5,编码链,模板链,mRNA,5,GCAGUACAUGUC,3,转录,N,Ala,Val,His,Val,C,蛋白质,翻译,模板链、编码链与转录及翻译的关系,依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）,。,该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷三磷酸存在的条件下，,不需要引物,，即可从53聚合RNA。,无校读,功能,二、RNA聚合酶（DDRP）,原核生物中的,RNA,聚合酶全酶由五个亚基构成，即,2,。,亚基,与,转录起始点的识别,有关，在转录合成开始后被释放；余下的部分（,2,）被称为,核心酶,，,与,RNA,链的聚合,有关。,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶,原核生物RNA聚合酶亚基的功能,（解链）,利福平与亚基相结合，从而抑制酶的活性,真核生物中的,RNA,聚合酶可按其对,-,鹅膏蕈碱,的敏感性而分为三种，它们均由,1012,个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。,（二）真核生物的RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶,转录产物,对鹅膏蕈碱反应,耐受,（不敏感）,极敏感,（低浓度）,中度敏感,（高浓度）,(C),(B),(A),45SrRNA,HnRNA,5S-rRNA,tRNA,snRNA,RNA聚合酶,存在部位,核仁,核质,核质,线粒体,mtRNA,mtRNA-pol,耐受,（不敏感）,（mRNA前体）,（除5S rRNA外，其它rRNA前体）,三、启动子,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为,启动子（promoter）,。,启动子序列通常由一些带共性的保守序列构成。,（一）原核生物的启动子,开始转录,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,1,-30,-,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,T T G A C A,A A C T G T,-35 区,RNA-pol辨认位点,(recognition site),（一）真核生物的启动子,三种RNA聚合酶对应三种启动子，,RNA聚合酶主要负责蛋白质基因的转录，其启动子结构最为复杂。,真核生物的转录起始点上游,-25bp,区也存在一段富含,TA,的顺序，被称为,Hogness,盒,或,TATA,盒,，能够定位转录起始点。与转录起始点一起构成,核心启动子,。,2.核心启动子上游还可见到其他带共性的序列，如,位于75bp附近的,CAAT盒,，位于,90 bp附近,GC盒,等,。这些元件决定了启动子起始转录的效,率，被称为,上游启动子。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,AATAAA,八聚体,典型的RNA-pol转录基因的启动子,核心启动子,上游启动子,第二节 RNA转录合成的过程,The Process of RNA Biosynthesis,（一）原核生物的转录起始,转录起始需解决两个问题：,RNA,聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域,（启动子）,。,DNA,双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、转录起始,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为,启动子（promoter）,。,开始转录,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,原核生物启动子的保守序列,T T G A C A,A A C T G T,-35 区,RNA-pol辨认位点,(recognition site),5,5,启动子,结构基因,3,3,DDRP的移动,TTGACA,AACTGT,TATAAT,ATATTA,DDRP,-40-35-30-25-20-15-10-5 0 +5 +10+15+20+25,启动子保守序列,开始转录,转录起始点,1,原核生物的转录起始,亚基辨认,-35,区,RNA pol,全酶移向,-10,区，,打开双链,合成第一个磷酸二酯键,5-ppp,G,p,N,-OH-3,转录起始复合物,RNA pol,(,),DNA,pppGpN-OH,亚基脱落,（结合松弛）,（结合紧密）,转录起始不需引物！,5,3,编码链,模板链,OH,G（A）,OH,G（A）,OH,5,-pppG-OH +NTP,5,-pppGpN-OH 3,+ppi,形成第一个磷酸二酯键,+1,+2,原核转录起始,（二）真核生物的转录起始,转录起始上游区段比原核生物多样化,RNA-pol不能直接结合模板,起始过程比原核生物复杂。,真核生物的转录起始,1.转录起始的上游区段：,真核生物的转录起始点上游,-25bp区,也存在一段富含,TA,的顺序，被称为,Hogness,盒,或,TATA,盒,，通常认为是启动子的核心序列。,除此之外，在真核生物中还可见到其他带共性的序列，如,CAAT盒,及,GC盒,等。,在远离受控基因处存在的，能够增强基因转录活性的调控序列称为,增强子（enhancer）,。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件,(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,加尾修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,八聚体,DNA分子中参与转录调控的序列统称为,顺式作用元件,典型的RNA-pol转录的基因,在真核生物中，转录的起始过程较为复杂，现已发现数百种蛋白因子与RNA转录合成有关。,凡是与基因表达调控相关的蛋白因子统称为,反式作用因子（transacting factor）,。,2.转录因子：,在反式作用因子，又被称为,转录因子（transcriptional factor,TF）,。,不同的RNA聚合酶存在相应的转录因子，相应分别称为TF、TF、TF。,RNA聚合酶相关的转录因子包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH等。,真核生物RNA聚合酶转录因子及其功能,真核生物转录起始时，首先由TFD的TBP亚基识别并结合TATA盒，然后在其他转录因子的配合下，与RNA聚合酶组装形成转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC)。,3.转录起始过程：,RNA-pol,TFF,TATA,A,B,由RNA-Pol,催化转录的PIC,H,E,TFF,首先，TFD的TBP亚基在TAF辅助下，,由TFA和B促进及配合，结合在DNA分子的TATA上，,形成TFD-A-B-DNA复合物,TFD,TAF,TBP,最后TFH进入，PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化。,CTD-,TFB作为桥梁并提供表面，促进已与TFF结合的RNApol进入启动子的核心区TATA。,接着TFE进入，靠ATPase活性协同RNApol解开DNA双链局部。,2个亚基组成：,大亚基有解螺旋酶活性,小亚基与原核生物因子同源。,羧基末端结构域,(carboxyl-terminal domain,CTD,),RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序列为,Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser,重复序列片段,这一序列在RNA聚合酶中是独一无二的。,所有真核生物的RNA聚合酶都具有CTD，只是共有序列的重复程度不同。,RNA聚合酶催化第一个磷酸二酯键形成。,RNA聚合酶的,羧基末端结构域,（CTD）被磷酸化修饰，大部分转录因子脱离，聚合酶向下游移动延伸RNA链。,形成转录起始前复合物,(PIC)。,因子从全酶上脱离，余下的核心酶继续沿,DNA,链移动，按照碱基互补原则，不断聚合,RNA,。,1.,亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在,核心酶,作用下，,NTP,不断聚合，RNA链不断延长。,（二）原核生物的转录延长,(NMP),n,+,NTP,(NMP),n+1,+,PPi,二、转录延长,转录复合物:核心酶-DNA-RNA(5pppGpN-OH 3,提供羟基末端),核心酶沿DNA3向5移动，并合成RNA链,暂时形成DNA-RNA杂交体，约为12bp，形成一个转录空泡,转录产物伸出空泡，最远端pppGpN,DNA前方解链；后方重新形成双螺旋,转录空泡,(转录复合物)：,RNA-pol,（核心酶）,DNA,RNA,目 录,转录延长动画,3,5,DNA,RNA聚合酶,核糖体,RNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,（二）真核生物的转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物类似，但由于存在核小体的高级结构，故在转录延长过程中可观察到核小体移位和解聚现象。,转录延长中的核小体移位,核小体,转录方向,RNA-pol,核小体,核小体,RNA-pol,RNA-pol,RNApol前移将遇到核小体,原来绕在组蛋白上的DNA解聚及弯曲,一个区段转录毕，核小体移了位,RNA转录合成的终止机制有两种：,1依赖Rho因子的转录终止：,由终止因子（,因子）识别特异的终止信号，并促使,RNA,的释放。,（三）原核生物的转录终止,三、转录终止,因子是个同六聚体；,因子能结合RNA，与poly C的结合力最强；,因子还有ATP酶和解螺旋酶的活性。,转录终止信号存在于RNA而非DNA模板。,依赖 Rho因子的转录终止,过程：,因子与RNA转录产物结合，并向RNA 3-端滑动RNA聚合酶变构停止转录DNA:RNA杂化链解链释放RNA转录产物,2非依赖Rho的转录终止：,特点：,DNA模板靠近终止处存在连续,A序列,，连续A序列前方富含,GC互补区,及几个插入碱基,RNA终止区,形成发夹样,茎环结构,，3端是,连续U,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU,.3,5UUG,CAGCCUGA,CAAA,UCAGGCUG,AUGGCUGGUGACUUUUU,AGUC,ACCA,GCCU,UUUU,.3,RNA,5,TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT,.3,DNA,UUUUU,.,UUUU,.,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAU,GGCUGGUGAC,UUUUU,AGUCACCAGCC,UUUUU,.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,茎环结构使转录终止的机理,发夹结构改变RNA聚合酶构象，使酶停止移动；,RNA分子要形成自己的局部双链，DNA也要复原为双链，,使RNA/DNA杂化链很不稳定。,3端一连串U，U=A配对最不稳定，RNA易从模板上脱落。,5-AAUAAA-,5,-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3,mRNA,（二）真核生物的转录终止,第三节 真核生物的转录后修饰,Section 3 Post-transcriptional Modification in Eukaryote,一、真核生物mRNA的转录后加工,RNA-pol的转录产物，前体为,核内不均一RNA（hnRNA）。,核内不均一RNA:,存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA。,是mRNA的,初级转录产物,，经过一系列加工步骤才能产生成熟的、有功能的mRNA。,一、rRNA的转录后加工,（一）rRNA前体的加工与核糖体亚基的装配,（一）mRNA前体5,端帽子的形成,功能：,促进mRNA与核蛋白体的结合，保护,mRNA免遭5端外切酶与磷酸酶水解。,帽子结构,(,m,7,GpppGpN),Pi,5 ppGp,磷酸酶,5 pppGp,5 GpppGp,pppG,ppi,鸟苷酸转移酶,5,m,7,GpppGp,甲基转移酶,SAM,帽子结构的生成,帽子结构的几种形式,N,N,N,N,N,H,H,O,H,C,H,O,O,H,N,N,N,N,N,H,H,O,C,H,H,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,P,P,P,P,O,O,O,O,C,H,O,O,P,O,O,O,O,H,O,AAAAAA-,3,H,C,H,3,帽0,C,H,3,帽1,C,H,3,帽0：5m7GpppNp3,C,H,3,帽1：5m7GpppNmp3,帽2：5m7GpppN1mpN2mp-3,在多个位点的甲基化称为帽3,帽1：5Gpppm7Nmp3（第二碱基的N7位）,帽2,帽3,碱基,（二）,mRNA前体,3,端加上,polyA尾巴,功能：,增加mRNA的稳定性，维持mRNA作为翻译模板的活性。,PolyA尾巴的形成,mRNA,5m,7,GpppG AAUAAA 3,H,2,O,核苷酸片段,核酸内切酶,nATP,nPPi,Poly(A)聚合酶,mRNA,5m,7,GpppG AAUAAA OH 3,mRNA,5m,7,GpppG AAUAAA AAA(A)nOH 3,（三）mRNA前体的剪接（splicing）,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,mRNA,DNA,核酸杂交实验,3,5,模板DNA,hnRNA,3,5,全长互补,3,5,模板DNA,成熟mRNA,3,5,局部互补,鼓泡状突出,mRNA的初级转录产物,断裂基因（splite gene）,C,A,B,D,编码区 A、B、C、D,非编码区,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为,断裂基因,。,胰岛素基因、转录产物、翻译产物,胰岛素基因（编码链）,5,3,intron,intron,S,Pre,成熟mRNA,S,Pre,转录后加工产物,前胰岛素原,翻译产物,翻译后加工修饰产物,信号肽 前导序列 B亚基 C肽 A亚基,S,Pre,胰岛素,S,S,S,S,外显子(exon)和内含子(intron),外显子,转录后加工的剪接过程中被保留，,成熟,RNA,中出现的核酸序列。,内含子,转录后加工的剪接过程中被除去的核酸序列。,内含子的分类,I：,主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真,核生物的 rRNA基因；,（自我剪接，需要GTP）,II：,线粒体、叶绿体mRNA基因；,（形成套索结构的自我,剪接）,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为,4,类。,III：,大多数真核生物核mRNA的基因；,(,hnRNA的剪接),（,形成,剪接体,，,形成套索结构的剪接）,IV：,真核tRNA基因,（,需要蛋白质酶参与的剪接）,hnRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接为成熟的,RNA的过程称为剪接。,分支点,内含子,上游外显子,下游外显子,剪接点,剪接点,内含子结构特点：,1.大多数内含子都以5-GU,开始，而其末端则为AG-OH-3,2.分支点保守序列：PyNPyPu,A,Py，其中A为百分之百保守，,在酵母中是UACUA,A,C,剪接机制（简化）,mRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接为成熟的,RNA的过程称为剪接。,分支点,内含子,上游外显子,下游外显子,剪接点,剪接点,内含子结构特点：,1.大多数内含子都以5-GU,开始，而其末端则为AG-OH-3,2.分支点保守序列：PyNPyPu,A,Py，其中A为百分之百保守，,在酵母中是UACUA,A,C,剪接机制（简化）,snRNA,为核内小,RNA,，富含尿嘧啶，故以,U,作分类和命名，如,U1,、,U2,等。,snRNA,与核内蛋白质组装形成,小核蛋白体,（,snRNP,），参与,hnRNA,的剪接加工。,snRNA,hnRNA的剪接过程：,snRNP,剪接体的形成,1、U1snRNA识别mRNA前体5剪接点,2、,U2,snRNA与分支点相结合,3、进一步与U4、U5、U6 snRNP 三聚体相结合，形成剪接体,二次转酯反应,U1-snRNA,UC-CAUACA,UApppmG,U1-snRNP,U2-snRNA,AUGAUGU,pppmG,U2-snRNP,snRNP与,hnRNA,的结合,内含子,可以弯成套索,UACUAac-AG,AG-GUAUGU,外显子1,外显子2,hnRNA,5,3,具体的剪接机制,U1与U2作用使内含子的 5端和 3端带到一起,U1通过与 5剪接点互补而结合,U2识别并结合分支点保守序列,U1、U2、mRNA与 U4U5U6复合物形成一个完整的剪接体,U1、U4脱离，形成活性剪接体，通过两次转酯反应完成剪接,鸡卵清蛋,白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA,剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,二、rRNA的转录后加工,（一）rRNA前体的加工与核糖体亚基的装配,基因,基因,rRNA转录后加工示意图,18S-rRNA,5.8S和28S-rRNA,20S,45SrRNA前体,32S,甲基化、剪切,终产物,rDNA,rDNA（放大）,18S,5.8S,28S,转录,45SrRNA前体,18S,5.8S,28S,18SrRNA,5.8SrRNA,28SrRNA,甲基化,裂解,蛋白质,蛋白质,5srRNA,40S小亚基,60S大亚基,真核细胞45S前体RNA的剪接过程,（二）内含子的自我剪接作用,具有酶促活性的RNA称为,核酶,。,核酶(ribozyme),1982年，美国T.Cech在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，RNA组分有催化活性,可以促进自身的剪接。,1989年分享了诺贝尔化学奖。,G,OH,3,G,5,OH,5,3,G,OH,5,3,E,1,E,2,I,四膜虫rRNA的自我剪接,RNA组分有催化活性,可以促进自身的剪接,G,OH,3,G,5,OH,5,3,G,OH,414,G,399,5,3,395,5,3,E,1,E,2,I,四膜虫rRNA的自我剪接,5,3,L19RNA,核糖核酸酶RNA聚合酶,三、tRNA的转录后加工,主要有以下几种加工方式：,切断。,剪接。,3-,末端,-CCA,序列添加。,化学修饰。,tRNA,前体,RNA pol,TGGCNNAGTGC,GGTTCGANNCC,DNA,tRNA前体的转录合成,tRNA前体的切断和剪接加工,RNAaseD,RNaseP,及内切酶,tRNA核苷酸转移酶,及连接酶,ATP,A-OH,C,C,tRNA3-末端-CCA序列的添加,tRNA的碱基修饰,（2）还原反应,如：U,DHU,（3）核苷内的转位反应,如：U,（4）脱氨反应,如：A,I,如：A,A,m,（1）甲基化,（1）,（1）,（3）,（2）,（4）,RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,四.mRNA的编辑（mRNA editing）,人类apo B基因,mRNA（14500个核苷酸）,肝,apo B100,（分子量为500 000）,肠道细胞,apo B48,（分子量为240 000）,mRNA编辑,第2153位密码子,CAAUAA,