第一章-基因工程绪论1.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,授课计划（,32,学时；,10-17,周）,第一章 绪论（,2,）,第二章 基因工程的工具酶（,4,）,第三章 基因载体的选择与构建（,4,）,第四章 目的基因的制取（,4,）,第五章 重组,DNA,导入受体细胞（,4,）,第六章 重组体的鉴定（,4,）,第七章 聚合酶链反应（,2,）,第八章 基因文库的构建（,4,）,第九章 目的基因的表达（,3,）,1,参考书,基因工程学原理 马建岗,基因工程原理 徐晋麟,基因工程 龙敏南,基因工程概论 张惠展,分子克隆,生物学期刊杂志,网络资源,2,3,看什么看，都是人类的错！,6,A B Z,7,1953,年，,Watson,和,Crick,创立,DNA,双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的,DNA,片段。,目前的分子生物学，在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。,8,本世纪,70,年代初，基因工程学诞生。,特点：以重组,DNA,的技术，在短时间内改造生物遗传特性。它填补了生物种属间不可逾越的鸿沟，,使人类有可能按照需要定向培育生物新品种、新类型乃至创造自然界从未有过的新生物,。,本课程就是讲述在核酸水平上对基因进行研究和操作所涉及的,方法、技术和策略,的原理。,9,2007.11.8,日本研究人员认为，恐惧可能与嗅觉有关。研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物。,10,美国基因科学家称合成拥有人工,DNA,新生命体,把,生殖支原体,(Mycoplasma Genitalium),的,DNA,序列简化了五分之一，染色体含有三百八十一个基因、五十八万碱基对。植入一个活菌细胞中，该细胞将会被新染色体控制，成为一个近乎全新的生命体。,制造设计基因组的技术未来可能会带来非常可观的裨益，譬如用来制造人们目前意想不到的替代能源，像纯粹用蔗糖分解的丁烷和丙烷，或者创造出能吸收二氧化碳的细菌，以纾缓全球暖化。,11,第一章 绪论,一 重组,DNA,技术与基因工程,二 基因工程发展史,三,基因工程的巨大意义,四 基因工程的安全性,五 基因工程的基本过程,基因工程原理,12,一,重组,DNA,技术与基因工程,B,iological,Engineering,生物工程,Gene engineering,基因工程,Recombination DNA technique,重组,DNA,技术,Clone,克隆,are identical organisms,cells,or molecules descended from a single ancestor.,分子克隆,(Molecular cloning),、基因克隆,(Gene cloning),13,1.,重组,DNA,技术,重组,DNA,技术,是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的,DNA,体外操作程序，也称为,分子克隆技术。,因此，供体、受体、载体是重组,DNA,技术的三大基石。,14,2.,基因工程的定义,基因工程,是指重组,DNA,技术的产业化设计与应用，包括,上游技术,和,下游技术,两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即,重组,DNA,技术,）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,15,Generation of DNA Fragment,Joining to a vector or carrier molecule,Introduction into a host cell for amplification,Selection of required sequence,3.General process of genetic engineering,16,What do we need to,make recombinant DNA?,Restriction Enzymes,DNA ligase,A vector,A host,An efficient transduction procedure,17,4.,基因工程的特征,跨物种性,外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。,无性扩增,外源,DNA,在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。,18,二 基因工程的发展历史,1.,基因工程产生的背景,理论基础,:,40,年代，遗传信息的携带者是,DNA,；,50,年代，,DNA,双螺旋模型和半保留复制机制；,50,年代,60,年代，中心法则、操纵子学说、遗传密码,关键技术：,DNA,分子的体外切割与连接；载体的发现。,1975-1977,，,Sanger,发明了快速的,DNA,测序技术,19,2.,基因工程的诞生,1972,年，美国,Berg,和,Jackson,：,SV40(,猴空泡病毒40,)+,第一个重组,DNA,分子,1973,年，斯坦福大学,Cohen,和,Boyer,，第一次成功的基因克隆实验,20,EcoRI,Boyer,和,Cohen,的实验,pSC101,pR,6-5,大肠杆菌,21,pSC101,抗四环素,pR,6-5,抗卡那霉素,DNA,连接酶,重组,DNA,分子,EcoRI,抗卡那霉素基因,22,23,3.,基因工程的发展,1977,年，在大肠杆菌中表达了通过化学合成的人的生长激素抑制素基因,(Somatostatin),。,1978,年，美国的,Genentech,公司开发出利用大肠杆菌生产,人胰岛素,的先进生产工艺，揭开了基因工程产业化的序幕。,24,4.,基因工程的腾飞,80,年代，基因工程研究深入到高等动植物,1982,年，转基因小鼠问世,1983,年，细菌新霉素抗性基因转基因植物获得成功,1990,年，人类基因治疗开始，人类基因组计划开始实施,1997,年，克隆羊出世,2001,年，,HGP,测序基本完成,25,1972,年,P.Berg:,构建第一个,DNA,重组分子,1997,年,动物克隆,:,克隆羊多莉,1977,年，基因工程产品的出现,H.W.Boyer,第一个基因工程产品,(,生长激素释放激素,),1973,年,S.S.Cohen,:,第一个基因克隆实验,2001,年，人类基因组计划,26,5.,基因工程的成就,（,1,）,Itakara,等使化学合成的,激素抑制素基因,与大肠杆菌,一半乳糖,(,苷,),酶基因和,PBR322,质粒重组到一起，然后转化到大肠杆菌中，结果产生含激素抑制素的嵌合型蛋白质，经溴化氰处理后，有活性的激素抑制素便释放出来。,这是真核生物的人造基因首次在原核生物中表达。,27,（,2,）,1978,年，,Gooddel,等使化学合成的,人胰岛素基因,在大肠杆菌中表达；,（,3,）,1979,年，,Gooddel,等使,人生长激素基因,在大肠杆菌中表达成功；,（,4,）,1980,年，,Nagata,等使,干扰素基因,在大肠杆菌中表达成功；,（,5,）,1981,年，从遗传工程菌获得的新产物有动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原以及牛生长激素等。,28,The values of Genetic Engineering,Basic research on gene structure and function,Production of useful proteins by novel methods,Generation of transgenic plants and animals,Medical diagnosis and treatment,29,三、基因工程的巨大意义,农业：转基因植物、动物,医学：基因工程药物、基因诊断、治疗,工业：工业用酶制剂,环境：降解污染物,30,Applications,：,Agriculture,Plants,Improved Nutritional Value-oils,fats,proteins,Disease/Pest Resistance-Bt Corn,Herbicide-resistant(,抗除草剂,)-Round-up ready,Improved Yields,Drought Resistance,Extreme Heat or Cold Resistance,Soil Variety-sandy,salty,Antibiotics,31,转基因植物获得新的性状,32,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,33,中国已经批准进入大田的转基因植物,马铃薯：抗病毒、抗逆、高营养品质,水稻：抗病毒、抗虫、抗除草剂,棉花：抗虫,玉米：抗虫,大豆：抗除草剂,小麦：抗除草剂、高营养品质,番茄：抗病、耐储存,甜椒：抗病,辣椒：抗病毒,烟草：抗病毒、抗虫,番木瓜：抗病毒,矮牵牛：改变花色,杨树：抗虫,微生物：提高固氮效率,34,Bt cotton,Bacillus thuringiensis,苏云金杆菌,toxin is an insecticidal protein,Bt toxins have been used as biopesticides since the 1960s,Bt crops are now being grown internationally:,cotton,maize,potato,35,Applications,：,Agriculture,Animals,Potential Sources of Functionally Modified Foods and Bioreactors,Meat Improvement,Modified Milk and Milk Ingredients,Production of hGH,（,人体生长激素,）,36,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,37,38,2008,年，科学家下村修、马丁,查尔菲、钱永健因为发现和研究绿色荧光蛋白,(GFP),的贡献而获得诺贝尔化学奖，该蛋白现已成为当代生物科学最重要的工具。,追踪蛋白质的活动情况，了解蛋白质在什么时候产生，不同蛋白质在细胞里的互动形态等。钱永健专注於癌细胞的研究工作，利用荧光蛋白的技术，追踪细胞外的蛋白酶，以发展出新的对比剂与治疗方法。,39,Applications,Human Health,Pharmaceuticals produced by genetic engineered organisms are:,Tissue Plasminogen,（血纤维蛋白溶酶原）,Activator(TPA)-dissolve blood clots,stroke/heart attacks,Human Insulin,胰岛素,-Diabetes,，,first commercial recombinant DNA product“Humulin”,Human Growth Hormone-Dwarfism,Human Coagulation,Factor VIII-Hemophilia,血友病,Hepatitis,（肝炎）,B Vaccine-first synthetic vaccine for public use,40,基因工程在医药上的应用,1976,年，,27,岁的风险投资人,Robert Swanson,与,University of California,的教授,Herb Boyer,共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为,Genentech,（,Gen,etic,En,gineering,Tech,nology,）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,41,Genentech,的骄人业绩,1976 Genentech,创立,1977,首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素,1978,克隆了人胰岛素基因,1979,克隆了人生长激素素基因,1982,第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给,Lilly,公司）,1984,第一个,VIII,因子，转让给,Cutter Biological,1985,第一个自己生产的产品（人生长激素）,1987,生产组织纤溶酶原激活剂（,TPA,）,1990,生产,interferon,1,与瑞士,Roche,医药公司合并（,$2.1billion,）,42,安进公司,(Amgen),全球最大生物制药企业之一“安进公司”（,Amgen,）。,1989,年,6,月安进公司的第一个产品,重组人红细胞生成素,(erythropoietin,，简称,EPO,),获得美国,FDA,批准，用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和,HIV,感染治疗的贫血,1991,年,2,月公司第二个产品重组粒细胞集落刺激因子,(filgrastim,，,G-CSF),获得美国,FDA,批准,43,在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为,46kDa,的,糖蛋白,细胞因子。能刺激幼稚红细胞的增生，血红蛋白化和红细胞的成熟。,人体缺氧时，此种激素生成增加，并导致红细胞增生。,EPO,兴奋剂正是根据促红细胞生成素的原理人工合成，它能,促进肌肉中氧气生成,，从而使肌肉更有劲、工作时间更长,.,erythropoietin;erythrogenin;EPO,44,美国已批准上市的基因工程药物（,2000,）,胰岛素,人生长激素,干扰素,白细胞介素,2,粒细胞集落刺激因子,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,红细胞生成素,近种处于各期临床研究阶段，约种处于临床前研究开发阶段,组织溶纤原激活剂,生长激素,促生长素,抗血友病因子,VIII,乙型肝炎疫苗,甲型肝炎疫苗,鼠单克隆抗体,上市,120,余种,45,中国已经批准上市的基因工程药物（,2000,）,rhuINFa1b(,外用）,rhuINFa1b,rhuINFa2a,rhuIFNa2b,rhuINF,rhuIL2,rhuG-CSF,rhuGM-CSF,rSK,rhuEPO,bFGF,（外用）,18,种,46,2000,年生物技术公司销售业绩前,10,名,排名 公司 销售收入（亿美元）,1 Amgen,（安进）,32.0,2 Genentech 13.0,3 Serono 8.46,4 Immunex 8.29,5 Biogen 7.61,6 Genzyme 6.00,7 Chiron 5.85,8 MedImmune 4.96,9 Millennium Pharmaceuticals 1.96,10 GileadSciences 1.50,47,Applications,Human Health,Downs Syndrome,（,21,号染色体三体）,Autoimmune diseases such as insulin-dependent diabetes,Forms of arthritis,关节炎,and anemia,贫血,Chronic diseases of the liver,kidney,and nervous system,The detection and diagnosis of viral diseases and inherited disorders,48,Applications,Human Health,Transgenic Animals for Research,Gene therapy,延长人类寿命：甲状腺素，是一种抗氧化的荷尔蒙，它可以使,UCP2,蛋白质增加活力，由此可减少机体产生的自由基。,49,黑色素瘤的基因治疗,：肿瘤浸润,淋巴细胞,能在肿瘤部位持续存在而无副作用，肿瘤坏死因子（,tumor necrosis factor,，,TNF,）基因导入取自患者自身并经培养的,淋巴,细胞。,50,1.,用转基因植物或动物生产药物,2.,用微生物生产药物,大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等,3.,设计高效高特异性的生物制剂,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,4.,研制疫苗,制造新型疫苗（如,HIV,、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、,SARS,）,应用总结,51,5.,基因诊断,6.,法医鉴定,7.,基因治疗,（仍在探索阶段）,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,遗传病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,52,Applications,：,Environment,Reduced pesticide use,Lower energy requirements,Cleaner water,Biodegradable plastics,bioremediation,53,喷洒工程菌清除石油污染,54,基因工程在工业中的应用,1.,纤维素的开发利用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,2.,酿酒工业,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒，或用酿酒酵母生产蛋白质等。,55,基因工程技术的商业化特点,1.,技术密集型,（,1,）产品来源于实验室。,（,2,）科学家往往就是公司的领导人,2.,市场扩张迅速,2000,年产值和销售额已超过,200,亿美元。,1992,年日本的总销售额达,4000,亿日元。,20,世纪末世界的的总销售额达,6000,亿美元。,56,3.,投入巨大,美国不少于,100,亿美元。日本,1997,年,5000,多亿日元。,80,年代初，加拿大联邦政府出资参与建立的,Allelix,生物技术公司，注册资本高达一亿美元！,4.,风险太高,前期的资金投入是极其巨大的，非一般企业所能承受。,全世界只有不超过,100,家生物技术公司有自己的产品，其中真正盈利的公司很少。,57,5.,产品不断增加,制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。,6.,研究专一、产品专一,7.,医学生物技术产业进展最快,已取得的成果中,60%,是医学领域的。,8.,专门为基因工程实验提供研发试剂的公司,58,四、基因工程的安全性,“,基因漂移,”,转基因食品的安全性,基因工程与生态环境平衡,基因工程研究的伦理学问题,我国的,基因工程安全管理办法,59,Environmental Impact,Transgenic organism dominates/loss of diversity,Unintended transfer of traits to wild or,“,undesirable,”,species,Food Safety,Transfer of unintended toxin,allergen to food,Antibiotic resistant human pathogens,Patent rights,right to know,Who owns the genes?,60,对环境的影响,重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状，有可能给现有的生态环境带来不良影响。,新型病毒的出现,制造带有抗生素抗性基因或致病毒能力基因的新型微生物，有可能在人类或其它生物体内传播。,癌症扩散,将肿瘤病毒或其它动物病毒的,DNA,引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,人造生物扩散,新组成的重组,DNA,生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,61,“Ethical”Concerns,Playing Creator/God;altering“natural”life,Discrimination against people with“bad”genes(insurance;employment;having children),Economic Concerns,For profit only?By whom?,Control by large corporations vs.small farms,Trade restrictions,基因工程研究的伦理学问题,62,重组,DNA,研究的安全准则,公众的担忧,1973,年，美国公众第一次公开表示担心应用重组,DNA,技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,63,专家的态度,1974,年美国国立卫生研究院（,NIH,）考虑到重组,DNA,的潜在危险，提请,Paul Berg,博士组成一个重组,DNA,咨询委员会。,这个由,11,名分子生物学和重组,DNA,权威学者组成的委员会在同年,7,月发表公开信，要求在没有弄清楚重组,DNA,所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停几类试验（,带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒,）。,64,制定安全规则,1976,年,6,月,23,日，,NIH,正式公布了“重组,DNA,研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。,1979,年、,1981,年、,1989,年,NIH,又做了多次修改，放宽了许多限制。,65,基因工程的安全措施,（,1,）实验室的物理安全：分,4,级：,P1P4,级,P1,级实验室：一般装备良好的普通微生物实验室。,P2,级实验室：在,P1,级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。,P3,级实验室：全负压的实验室，同时装备安全操作柜。,P4,级实验室,专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。,具有最高安全防护措施。,66,（,2,）实验室的生物安全,分,3,级（大肠杆菌）：,EK1EK3,级。,EK1,级的大肠杆菌,在自然环境中一般都要死亡。,EK2-EK3,级大肠杆菌,在自然环境中无法存活。,（,3,）载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。,容易构建，如,pBR322,。,67,五 基因工程的基本过程,(1),从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的,DNA,片段。,(2),在体外，将带有目的基因的,DNA,片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组,DNA,分子。,(3),将重组,DNA,分子引入到受体细胞,(,亦称宿主细胞或寄主细胞,),。,(4),带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体,(,菌落,),。,(5),从细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组,DNA,分子的细胞克隆。,(6),将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析。,(7),将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,68,基因工程分为上游技术和下游技术，一般把分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术，而把生物化学研究技术和应用称为基因工程下游技术。,一般把,“,分、切、连、转,”,的步骤作为上游技术，而把,“,筛,”,的过程作为下游技术。上、下游技术必须相互依存才具有生命力。,我国在上游技术方面与发达国家差距较小，下游技术方面则差距较大。,69,基因工程研究的基本技术路线,70,