第1章-新概念疫苗与基因免疫.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫机制,特异性免疫,非特异性免疫,(,固有免疫:皮肤等屏障、吞噬细胞、补体、溶菌酶等,),自然的,人工的,自然主动免疫,自然被动免疫,人工主动免疫,人工被动免疫,疫,苗,一、传统疫苗的研究及应用,疫苗凡具有免疫原性、接种于机体可产生特异性主动免疫力，可抵御感染等疾病的发生或流行，统称为疫苗。,第1节 疫苗新概念及新概念疫苗,细菌制备的制剂称为“菌苗”；,把病毒及立克氏体等制备的制剂称为“疫苗”；,以细菌代谢产物毒素制备的制剂称为“类毒素”。,能诱发自动免疫的制剂统称为“疫苗”,减毒活疫苗,是指通过各种手段降低病原体的毒力，并以降低毒力后的病原体做疫苗，如脊髓灰质炎疫苗(糖丸)及BCG等；,复制型重组疫苗,又称载体疫苗,(vector vaccine),，是将保护型的靶抗原编码基因通过细胞内重组或体外,DNA,操作等方式插入无毒、弱毒活或减毒的病毒,(,痘苗病毒、腺病毒等,),或细菌,(,伤寒杆菌疫苗株、,BCG,等,),中,；,灭活疫苗,是毒性病原体经灭活后使其丧失感染性，但仍保留免疫原性的疫苗。这类疫苗株不能在体内复制或繁殖。比如最近开发的,H1N1甲流,灭活疫苗，猪链球菌畜用灭活疫苗等,；,纯化蛋白亚单位疫苗,是分离、纯化病原体中一种或几种蛋白为靶抗原,(,有保护保用的抗原,),，诱导机体产生中和性抗体,如HBV,疫苗,；,重组亚单位疫苗,是用重组,DNA,技术，将编码靶抗原的基因插入表达载体中，在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达这些抗原，经纯化后获得的亚单位蛋白结构,；,疫苗的“,活,”或“,死,”决定了其诱生免疫应答的类型,死疫苗,不能有效地进行,MHC-I,类抗原加工呈递,故死疫苗一般不会诱导有效的,CMI；,活疫苗,可有效地进行,MHC-I,类抗原呈递，诱生细胞免疫。,但其常受到个体条件的限制；,活疫苗中常含有潜在致病性的生物活性成分；,活疫苗的贮存和运输的成本都较为昂贵。,二、疫苗新概念,传统疫苗,新型疫苗,成分不同,死疫苗/减毒活疫苗/重组亚单位疫苗,编码抗原蛋白核酸或激发免疫应答的细胞,机制不同,中和性抗体,保护性抗体、细胞免疫应答,作用不同,预防作用,预防和治疗,(,治疗性疫苗,),疫苗,(,vaccine,),最初是指接种牛痘苗预防天花的痘苗，其名来源于拉丁语中的雌牛,(,vacca,),。,三、新概念疫苗,核酸疫苗,T细胞疫苗,树突状细胞疫苗,疫苗的三次革命,Pasteur在100年以前所开创的以炭疽和狂犬病疫苗为代表的,第一次疫苗革命,在技术上是细胞水平的研究和开发；,从20世纪70年代的中期开始，形成了以基因工程制备的乙型肝炎表面抗原为代表的分子水平的,第二次疫苗革命,；,上一世纪90年代初开始兴起的DNA疫苗被称为,第三次疫苗革命,。,(一)核酸疫苗,核酸疫苗(nucleic acid vaccine),又称核酸免疫或基因免疫,是将含有编码特定外源抗原蛋白质的,基因,序列克隆到合适的,质粒载体,上，制备成,核酸表达载体,。通过肌肉,注射,等方法将其导入机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，表达产物与MHC结合,而,被递呈，从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答反应，即刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞，分别介导,体液免疫应答,和,细胞免疫应答,。,(二)T细胞疫苗,(,T Cell Vaccine,TCV,),用化学或物理方法灭活的致病性T细胞，其失去致病能力，但保持了致病性T细胞的免疫特征。TCV免疫动物后能够诱导机体产生针对致病性T细胞的免疫应答。可以消除或减轻这些细胞的致病作用或反应能力，表现为对自身免疫性疾病的防治作用和诱导同种移植物质延长存活。,TCV是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种。,近年来，将依据MHCI类分子特异的多肽结合基序(MHC binding motif)合成的多肽，在体外诱导产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，用于治疗病毒性疾病。,1.治疗某些自身免疫疾病,自身反应性T细胞自身免疫疾病,灭活自身反应性T细胞接种机体,自身反应性T细胞自身免疫疾病,小鼠变态反应性脑脊髓炎；人类多发性硬化症,2.TCV与移植排斥反应,同种器官组织移植后，受体免疫系统识别供体MHC抗原，引起细胞免疫应答，触发了同种排斥反应，其中T细胞发挥着重要作用。如果把同种反应性T细胞看作是致病性T细胞，制备成TCV并接种于动物后，可以诱导抗原特异性的同种免疫耐受或免疫反应低下。,3.治疗某些病毒性疾病,病毒感染的清除：抗体+,CTL,过继免疫治疗如LAK细胞、CD3-AK细胞,(,CD3 McAb activated killer cells,),均为非特异杀伤细胞，靶向性差；,直接接种单个或多个含CTL表位的多肽,(,多肽疫苗,),，虽然可诱导机体产生特异性CTL应答，但常常滴度不高,。,较短的TL多肽表位易被血清蛋白酶所降解,CTL多肽疫苗,CTL,应答弱,较短的TL多肽更易被血清蛋白酶所降解,将几个多肽交联,？,加大抗原肽的量,？,T细胞疫苗,是用多肽在体外诱生产生,特异性CTL,，后者被克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将MHCI类限制的CD8,+,T 细胞输入机体，诱导细胞免疫应答。,TCV的可能机制：,1.抗独特型T细胞的作用,(,抗克隆型的调节性T细胞,),:,可通过识别靶细胞TCR的克隆型决定簇来调节自身反应性T细胞,。,2.,抗活化型T细胞的作用：,活化T细胞标记：粘附分子、ergotype分子等；,活化T细胞作为抗原递呈细胞，诱导出抗活化型T细胞(anti-activated T cell,),：该类细胞介导的抵抗作用弱，持续时间短，对靶细胞的杀伤作用不受MHC限制。,4.Th1/Th2转换的作用。,3.抗活化T细胞抗体的作用；,TCV免疫调节中的非特异性因素；,以及对其作用机理的进一步阐明。,？,(,三,),树突状细胞疫苗,DC是专职抗原递呈细胞，能有效地将抗原递呈给T淋巴细胞，从而诱导CTL活化。荷载,抗原,的DC具有疫苗功能，故称树突状细胞疫苗。,荷载,抗原：,病毒抗原、HLA限制的CTL表位基因，也可以是肿瘤细胞，还可以是编码肿瘤抗原的基因,。,2010年5月：第一个癌症治疗疫苗前列腺癌疫苗,(,DC疫苗,),用,抗原或抗原多肽,体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主，进行免疫治疗；,利用,DC与肿瘤细胞融合,成为新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗；,利用病毒载体等将带有肿瘤或病毒特异抗原的编码,基因转染DC,，使之DC细胞内持续表达相应特异抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应。,常用的研究方法：,四、未来疫苗学的发展方向及展望,(一)针对感染性疾病的新疫苗,1.核酸疫苗的发展：,如何提高其在人体诱生特异性免疫应答的效率,？,2.,治疗性疫苗的发展,：,能限制或根除已经呈现并确立的感染源或疾病。,部分依赖于DNA,(,即基因疫苗或核酸疫苗,),。,(二)针对非感染性疾病的新疫苗,1.,癌症,：,特异性肿瘤抗原免疫反应,，特异性地削减肿瘤细胞：黑色素瘤gp100基因和结肠直肠癌CEA-B7.1基因等。,2.,自身免疫性疾病,：,类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、食物过敏、,I型糖尿病,、阿兹海默病以及对古柯碱和尼古丁上瘾的疫苗,。,(三),新的疫苗传递技术,1.透皮性免疫预防；,2.转基因可食性植物递送疫苗；,3.可控性递送储存系统。,疫苗抗原包裹于由,生物降解性聚合物,如多糖多乳酸组成的,微球体,中，可定位于免疫系统中的多种细胞或可在注射位置形成储存场所，允许抗原随时间缓慢释放。,一、概述,五、基因免疫中目的基因的来源,六、基因免疫的注射途径和方法,二、基因免疫可能的分子机制,九、常用研究方法举例,第2节 基因免疫,三、基因免疫的载体结构,七、免疫保护效果评价,八、核酸疫苗安全性评价,四、CpG的免疫佐剂效应在基因免疫中的作用,一、概述,1.什么是基因免疫？,基因免疫,(,gene immunization,),又称DNA免疫,(,DNA immunization,),、核酸疫苗,(,polynucleotide vaccine,),、DNA疫苗、体细胞转基因免疫,(,somatic transgene immunization,),、遗传免疫,(,genetic immunization,),。,指将靶抗原编码基因置于,真核表达调控元件,的调控下，将该重组质粒DNA直接进行动物体内接种，并以与自然感染类似的方式呈递抗原，诱生特异性体液和细胞免疫应答的新理论和技术。,又称为裸DNA免疫,(,naked DNA immunization,),。,DNA Vaccines,The Third Vaccine Revolution,Plasmid vaccine,Plasmid yield antigenic protein,antigenic peptides,Memory T cell,Activated,cytotoxic T cell,Memory B cell,Antibodies,cellular immunity humoral immunity,基因免疫不仅已广泛地应用于抗病毒、细菌、真菌、寄生虫等抗感染免疫中，同时也发现在肿瘤免疫及自身免疫性疾病中起重要作用；,常规基因免疫：,将靶抗原编码基因置于常规的病毒启动子,(,可以在真核细胞内启动表达,),、增强子等调控元件的调控下，经肌肉接种免疫；,目前具有特异性靶向性、高表达水平、表达可调节性和选择性诱导某一特定类型免疫应答的,新一代基因免疫,。,2.基因免疫系统的建立,20世纪90年代初期建立，,质粒DNA可在体内肌细胞中以环状、非整合、非复制状态存在达1个月之久，而转基因产物的活性在体内可检测到达2个月之久。,美国的Wolff及Vical于1989年偶然发现:,1992年，Tang等，,首次证实编码抗原基因的质粒DNA注入小鼠体内不仅可表达相应的转基因产物，同时还可诱生基因产物特异的抗体应答。,将CMV启动子表达的人生长激素,(,hGH,),基因以基因枪注射的方式注入小鼠耳皮内，36周在小鼠体内可测到高水平的抗hGH特异性抗体应答。,这一研究成为开创基因免疫的先驱工作,基因免疫成了抗感染免疫等领域的新的研究热点。,基因免疫免去了繁琐的蛋白纯化步骤和免疫佐剂的辅助；,基因在体内的表达及诱生免疫的过程，模拟了自然状态下机体感染外源病原生物后，其在体内表达抗原及诱生免疫的过程。,基因疫苗可在体内合成与自然感染状态下表达的蛋白具有相同的构象和翻译加工方式的蛋白抗原；,内源合成的蛋白可有效地被MHC-I类分子呈递，模拟病原体繁殖后在体内表达抗原，诱生CTL的过程；,转基因在体内细胞表达的产物可在细胞裂解或凋亡时被释放至细胞外，或与凋亡细胞一同为APC摄取，被MHC II分子呈递。,3.基因免疫的优势,重组质粒DNA在宿主体内存在时间长，产生持久免疫，能刺激黏膜免疫，诱导免疫记忆；,基因免疫采用的质粒DNA没有毒力回复的危险，较活疫苗更为安全；,同一个质粒可通过患联或并联的方式克隆多个目的基因，可实现一种疫苗预防多种疾病的目的；,DNA的制备、贮存极为方便和廉价，也更易进行基因水平上的操作和改造，从而更有利于制备多抗原基因疫苗；,基因免疫可能在一些特殊领域里有常规疫苗所不具备的应用价值，如新生儿免疫。,4,.基因免疫的应用前景,由于基因免疫操作上简便、易行以及诱导免疫应答的相对高效性,基因免疫已在,抗感染免疫,及,非感染性疾病如肿瘤、自身免疫性疾病,中广泛应用。,二、基因免疫可能的分子机制,基因被注入肌肉组织或皮下后，是如何被细胞摄取?,在细胞内表达的蛋白是如何递呈的?,微量抗原pg(10,-12,g)至ng(10,-9,g)，怎样诱导出宿主的免疫应答?,(一),质粒DNA直接转染体细胞,肌细胞结构特点:,多核细胞、肌织网；,T小管系统,细胞外液并能伸到细胞内部，伸入到细胞内部的肌膜为,浆膜小体,(caveolae),。,在电镜下是肌膜凹陷形成的小泡状结构,外源基因的内化是由浆膜小体介导的胞饮过程,DNA被摄入肌细胞过程：,DNA受体蛋白,经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)固定在浆膜小体表面并聚集成丛；,DNA与受体结合后，浆膜小体在开口处闭合并脱离肌膜；,DNA与受体在浆膜小体内分离，沿浓度梯度经浆膜小体到达胞浆(,通过XX载体？,)。,(二)基因免疫中抗原呈递的分子机制,专职APC:巨噬细胞、树突状细胞、B细胞。,1.MHC II类应答的机制：,质粒DNA在转染的靶细胞中表达的蛋白抗原通过细胞分泌或细胞裂解的途径释放，,为APC所摄取,，并与,MHCII,类分子在晚期内体内结合，被呈递于APC表面。,激活Th细胞,Th1：IL-2/IFN-r，参与CMI,Th2：IL-4/IL-10，辅助HI,MHC II类应答,Ingestion,Secretion,Lysed,release,输入淋巴管,生发中心,Th,Th,APC,Th,B,Th2,Antigenic peptide,Expressing,MHC-II molecule,Specific antibody,2.MHC I 类应答的机制：,Muscle,injection,Endogenous,Protein antigen,内源性途径,CTL,CD8,+,MHC-I,BCR,CTL,CD8,+,MHC-I,CD4,+,MHC-II,Th,外源性途径,Endogenous,peptide,Exdogenous,protein,三、,基因疫苗的载体结构,1.,多克隆位点,(multiple cloning site,MCS),；,如BamHI:GGATCC,CCTAGG,MCS中的酶切位点必须是唯一的,2.选择的标记基因,Amp抗性基因：用Amp筛选E.coli,Neomycin抗性基因：用G418等筛选稳定转染细胞株。,3.,启动原核和真核的复制、转录及表达的元件,(1)复制起始点,f1,ori,(f1,噬菌体,复制起始点),pUC,ori,(来自pBR322质粒的复制起始位点)-E.coli复制,SV40,ori,(SV40病毒复制起始点)，-真核细胞中复制,3.,启动原核和真核的复制、转录及表达的元件,(2)启动子/增强子,T7(噬菌体)启动子,-启动原核表达Amp,抗性,;,CMV(巨细胞病毒)启动子,-启动,真核,表达:,(,目的基因/neomycin抗性),3.,启动原核和真核的复制、转录及表达的元件,(3)多聚腺苷poly(A)加尾终止信号,poly(A)-复制终止信号,BGHpA牛生长激素poly(A)；,SV40p(A)即SV40病毒poly(A)。,四、CpG的免疫佐剂效应在基因免疫中的作用,细菌DNA可激活B细胞、NK细胞、单核细胞等分泌细胞因子，而哺乳动物DNA则无此作用。,细菌DNA中包含许多以高频率出现的,非甲基化,CpG,寡核苷酸序列，由5-嘌呤-嘌呤-,C-G,-嘧啶-嘧啶-3(如,AA,CG,CT,CGACC寡核苷酸)。,CpG具有,免疫佐剂作用,，可激活多种细胞分泌细胞因子。,CpG在细菌基因组和质粒中的频率为1/16；而脊椎动物为1/50;,甲基化：原核甲基化不足5%；真核甲基化达70-80%。,CpG具有,免疫佐剂作用,-刺激分泌细胞因子,必须与抗原共同注射于相同的部位才表现出免疫辅助作用,CpG,序列=,ISS,序列,胞嘧啶核苷磷酸鸟苷,(Immunostimulatory sequences,ISS),五、基因免疫中目的基因的来源,(,一,),完整抗原编码基因的基因免疫；,(,二,),以抗原表位为基础的基因免疫；,(,三,),表达文库,(,expression library,),基因免疫。,(一),完整抗原编码基因的基因免疫,已知的病原微生物中抗原性较强的蛋白抗原均可作为基因免疫的靶抗原,例如流感病毒血凝素,(,HA,),、神经氨酸酶,(,NP,),、HIV包膜蛋白gp120、结核杆菌的Ag85B等;,抗原编码基因:,已知的病原微生物中抗原性较强的蛋白抗原,PCR,encoded,完整抗原基因免疫后在体内可有效地模拟活疫苗的作用。,与重组疫苗或亚单位疫苗,显著不同,的是：,转基因在宿主细胞中可合成与天然抗原有类似空间构象及糖基化方式的蛋白，并与细胞内MHCI和II类分子结合，呈递于APC表面，从而诱生有效的,细胞免疫应答,和,可识别构象依赖性抗原表位,的,抗体,。,完整抗原基因免疫,对一些高度变异的病毒，如流感病毒、HIV等有特别有利的方面。,由于这类病毒高度变异的特点，传统的蛋白疫苗，如重组疫苗、亚单位疫苗或减毒疫苗等仅能对同株或有限的几株病毒起保护作用，且很少有交叉保护作用。,基因疫苗的优势在于,可利用病毒基因中,保守蛋白的序列,来诱生针对这些蛋白中的抗原表位,(,如流感病毒NP,),的强大的免疫应答,(,如CTL,),，从而在多种不同病毒株或亚株间诱生有效的交叉保护免疫。,(二),以抗原表位为基础的基因免疫,抗原表位,是抗原分子中被免疫细胞识别、与免疫细胞表面抗原受体结合、诱生特异性免疫应答的最基本的结构和功能单位。,1.抗原表位为基础的基因免疫的优点；,2.单抗原表位的基因免疫；,3.复合抗原表位的基因免疫；,4.以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫。,1.抗原表位为基础的基因免疫的优点,可以用不同功能的T、B细胞抗原表位组成复合免疫分子，从而有目的地诱生各类不同的免疫应答；,避免了天然蛋白中抑制性抗原表位或抑制性成分引起的免疫抑制现象；,通过抗原表位为基础的基因免疫，可避开易发生变异的表位。,2.单抗原表位的基因免疫,用单一抗原表位基因构建重组载体，来进行DNA免疫。,Gene encoding the,Epitope,(P53:128145),Express the,Epitope,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,CTL,在单抗原表位前，通常在抗原表位序列前加上一些引导序列，如腺病毒,E3引导序列,与表位序列融合。,引导外源多肽进入内质网加工,Ciemik等,p53蛋白的CTL表位(128145)+E3引导序列,HIVgp160中的CTL表位,(,P18B,),+E3引导序列,诱生出保护性CTL应答:与,E3引导序列,融合表达的表位，基因诱生免疫应答的作用大大强于单用抗原表位的基因免疫。,以抗原表位为基础的细胞内靶向性基因免疫可增强诱生特异性免疫应答的精确性。,3.复合抗原表位的基因免疫,多种抗原表位,基因同时克隆在一个载体里面，来进行DNA免疫研究最多的方式。,Thomoson等将流感病毒、鼠巨细胞病毒、腺病毒、疟原虫等共10个CTL表位串联表达于真核细胞表达质粒DNA中。,Genes encoding the,Epitopes,NP(147155),PP89(168176),LCMV(118126),Express the,Epitopes,CTL,COOH,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,NH,3,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,4.以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫,B细胞表位,是天然的，,*位于分子的表面或转折处,*为构象依赖性表位,*是抗原分子的三级结构,T细胞表位,是抗原提呈细胞加工提呈的抗原肽，呈线性排列,免疫球蛋白分子的互补决定区CDR具有,外显性,(,总是暴露在外，随时准备与相应抗原决定簇结合,),；,空间限构,(,限定的空间构型即其空间构型不会因为编码蛋白的后续修饰如糖基化而改变,),。,外源B细胞抗原表位,直接克隆表达于CDR中,利用CDR限定的空间构型,，保证表位的构型正确及免疫原性的稳定，,并,利用CDR结构外显,的特性，使表位的可接近性,(,accessibility,),好，提高表位被吞噬及呈递的效率。,以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫,以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫,CDR,B cell Epitope,Vector containing Ig gene,Gene encoding Ig,Fab,CDR,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,B cell Epitope,CDR,B cell Epitope,B cell,BCR,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,病原菌,(三)表达文库基因免疫,expression library immunization,ELI,ELI技术允许免疫系统自我选择。,ELI技术基本指导思想是将目的抗原的编码基因,随机克隆,于载体。,将含有成千上万个DNA片段的质粒DNA直接免疫动物，再以相应的病原体感染这些动物，观察是否有保护作用。如有，则可将这成千上万种混合的质粒DNA分组，再免疫，作保护性感染实验。,有保护后再分组直至选出,单一保护性DNA片段,。,病原体,一个基因,具有所有基 因的文库,常规基因免疫,ELI,病原体,具有所有基因的文库,YES,NO,YES,NO,YES,NO,NO,NO,ELI特殊应用价值,可从有效的表达文库中分离出有保护作用的组分，制备成特异性基因疫苗或重组蛋白疫苗。,对于某些抗原成分不明确的病原体，传统的蛋白免疫或基因免疫的应用受到限制，可利用,ELI,使机体的免疫系统自行筛选有效的抗原基因产物；,工作量非常大，但价值也大。,六、基因免疫的免疫途径和方法,1.肌肉免疫,(一),免疫途径,2.皮内免疫,3.脾脏免疫,4.其他胃肠外免疫,1.肌肉免疫,已知,肌细胞,摄取外源裸DNA和表达转基因产物的效率和持久性是其他组织细胞的1001000倍。,Wolff等以PCR和Southern杂交证实质粒DNA可在骨骼肌中存在达1年以上。,已在多种动物体内证实肌内基因免疫是诱生特异性体液和细胞免疫的有效途径。,股肌、腓肠肌和胫前肌,是肌内免疫中较多采用的肌肉。,作为外源DNA和外源蛋白的储存库，可少量而长期释放外源蛋白,肌细胞参与基因免疫诱生免疫应答的可能机制,肌细胞不是传统意义上的APC，只表达MHC I类分子，不表达MHC II类分子，且不表达B7等共同刺激分子。,肌细胞摄取局部注射的质粒DNA后被激活，激活的肌细胞表达转基因产物，这些内源性合成的蛋白抗原，可由,MHC I类分子直接呈递于肌细胞表面,。,在注射局部存在的免疫细胞如树突细胞、巨噬细胞等APC细胞，通过APC细胞提供其表面的同刺激分子，与呈递抗原的肌细胞共同激活T、B细胞，诱生免疫应答。,另一方面，激活的肌细胞寿命短暂，很快凋亡，释放出细胞内的转基因产物，为APC摄取；或者含外源基因产物的凋亡肌细胞整个为APC吞噬，经加工，,MHC II,类分子呈递，诱生体液和细胞免疫应答。,2.皮内免疫,采用基因枪将金颗粒包裹的DNA注射至表皮内。,皮肤作为基因免疫的靶组织具有一定的优势：,皮肤组织里具有一些专职的APC，如LG细胞、树突细胞和巨噬细胞等。,直接摄取基因疫苗，并让靶基因在细胞内表达，并提呈抗原肽给免疫细胞。,3.脾脏免疫,是以,免疫球蛋白基因为载体,的基因免疫采用的一种特殊的免疫方式。,脾脏有较多的B细胞,(,尤其是生发中心,),；,将表达,外源抗原基因,的,免疫球蛋白H链基因,表达质粒DNA直接注射到小鼠的脾脏中，即直接靶向至B细胞，表达,含外源抗原的免疫球蛋白,“,抗原化抗体,”。,B细胞同时担负了外源基因的摄取、抗原的表达、经MHC I类或II类分子共同呈递,三重功能,。,4.其他胃肠外免疫,静脉、,皮下、,腹腔、,粘膜免疫。,(二)免疫方法,3.基因枪免疫,1.裸DNA免疫,2.脂质体包裹DNA直接注射,4.繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法,1.裸DNA免疫,以生理盐水溶解质粒DNA，直接注入体内。,肌内或皮内注射；,静脉注射：肺、脾外源基因表达率最高；,腹腔内注射：可转染脾脏中T淋巴细胞及骨髓来源的造血干细胞；,气溶胶吸入方式或滴鼻方式：粘膜处产生高滴度SIgA抗体，血清中也可检出特异性IgG。,2.脂质体包裹DNA直接注射,阳离子脂质体,：由带阳离子的类脂GAP、DOSPA、DOTAP等磷酰脂胆碱，再加上中性类脂DOPE组成。,阳离子脂质体通过中和DNA表面的负电荷，有利于DNA分子接近靶细胞；,脂质体可与细胞表面的磷脂分子层融合，介导DNA分子进入细胞内；,DNA-脂质复合体表面所带的正电荷使之避免与溶酶体结合而被核酸酶降解；,脂质体还具有帮助DNA进入淋巴系统，定居于区域淋巴结；,中性类脂则起着增强脂质体稳定性、降低毒性、提高转染的作用。,脂质体本身是一种免疫佐剂,；,1,g,质粒DNA与,8nmol,的脂质体混合可以最大限度地表达外源蛋白。,3.基因枪免疫,质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入表皮内。,基因枪注射的优势：,给予极少量的DNA,(,10ng,),，就足以诱生与10 100,g裸DNA肌肉免疫效果相当的免疫应答。,肌肉注射:IgG(IgG2a)、IFN-a(+)及CTL活性(+)，IL-4(-)Th1细胞激活为主；,基因枪注射:IgG(IgG1)、IFN-a(+)及CTL活性(+)，IL-4(+),Th1、Th2细胞混合型激活方式。,效果最好！,基因枪免疫的缺点：,3.基因枪价格昂贵：BIORAD公司；,1.基因枪接种所诱导的免疫应答持续时间较短；,2.随环境温度上升，金颗粒上包被的DNA会脱落，从而影响免疫效果；,4.包被DNA金颗粒制备繁琐。,4.繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法,选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其,繁殖基因,去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。,缺陷型,减毒沙门氏菌、李斯特菌、BCG将DNA疫苗靶向带入巨噬细胞。,质粒DNA从吞噬体内胞浆内：,1.DNA,主动逸出而进入胞浆,；,2.,细菌,改变吞噬体隔室,结构,DNA,进入胞浆,；,李斯特菌产生的,李斯特溶素,，就可在吞噬体膜上打孔，有利于DNA跑到胞浆中来，以启动目的蛋白抗原的表达。,繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：,细胞靶向性：-,巨噬细胞,。,效率低：-,吞噬体与吞噬溶酶体融合后，大部分DNA还是会被消化掉的，损失较大。,(三)接种剂量与周期,1.接种剂量,小鼠,：,50,100ug/次,。,2.接种周期,最佳免疫接种次数为3次，,最佳间隔接种时间为3周。,七、免疫保护效果的评价,(一),细胞免疫的评价,(二),体液免疫的评价,(一),细胞免疫的评价,细胞免疫(,cell-mediated immunity,CMI,)主要针对胞内寄生菌、寄生虫、病毒、移植物等。,CD4,+,Th1细胞活化产生细胞因子起作用；,CD8,+,CTL特异性杀伤靶细胞。,1.淋巴细胞增殖功能检测,淋巴细胞增殖实验又称为淋巴细胞转化实验，T、B淋巴细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在体外经特异性抗原或非特异性有丝分裂原刺激，会产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆丰富、空泡出现、核仁明显、染色质疏松，淋巴细胞转变成淋巴母细胞。,PHA,-非特异淋转；,特异性抗原,-仅使已经相应抗原致敏的T细胞发生转化，通过两者比较，就可以了解核酸疫苗接种后，淋巴细胞被激活的情况。,形态计数法、,3,H-TdR(,3,H胸腺嘧啶苷)掺入法、MTT(四甲基偶氮唑蓝)法。,2.T细胞介导的细胞毒作用,DNA疫苗活化(或致敏)的CTL再次遇到带有特异抗原的靶细胞时，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用。,该作用是受,MHCI,类分子限制的，即CTL识别的抗原要靠与MHCI类分子结合，同时必须是自已本身的MHCI类分子。机体内大多数有核细胞都有MHCI分子，都有可能成为本身CTL的靶细胞。,从经相应,DNA疫苗,免疫的小鼠脾脏分离单核细胞作为效应细胞(,CTL,)，选择来源于,同一品系(遗传背景相同),、带有,特异抗原,的肿瘤细胞系作为靶细胞，来进行细胞毒实验。,方法：,51,Cr释放试验、乳酸脱氢酶释放试验等。,3.细胞因子检测,Th1,型细胞因子：IL-2、IL-12、IFN-r等，促进细胞免疫；,Th2,型细胞因子：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，促进体液免疫等。,免疫学方法，如ELISA等；,生物学方法，即细胞因子活性检测；,分子生物学方法，如分子杂交、RT-PCR等。,4.特异性致敏淋巴细胞检测,酶联免疫斑点试验,(,enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT,),ELISPOT,(二),体液免疫的评价,核酸疫苗诱导抗原特异性B细胞分化为浆细胞，产生特异性抗体，抗体再发挥中和抗原等生物学效应。,通过,抗体的检测,来评价DNA疫苗诱导的体液免疫水平。,用已知抗原测特异性抗体：,如双向琼脂扩散试验、ELISA法、免疫荧光法、放射免疫法、Western blot等。,八、核酸疫苗的安全性评价,质粒DNA整合到真核细胞染色体中,1.是否会导致肿瘤的发生？,随机插入,同源重组,逆转录病毒基因插入,在体外转染时发生，在体外转化细胞长期表达的基础(例如G418筛选整合细胞)，其发生率为10,-4,。,同源重组的发生率极低(10,-7,),到目前为止，在组织标本中检测质粒DNA时，还没有发现有基因组整合的证据，尚无因使用DNA制剂而导致基因整合的报道。因此，基因疫苗是安全的。,2.长期表达抗原的问题,PCR跟踪发现，质粒DNA可在肌肉内持续存在1个月以上。,长期表达外源抗原可能产生意外的不良后果，理论上可产生,耐受性,、,自身免疫,、,超敏反应,等。,将核酸疫苗接种,新生小鼠,诱导了耐受性，在,成年动物,接种DNA疫苗未见诱导免疫耐受状态。,但是，如果是,弱抗原,的基因疫苗接种成年动物，诱导免疫耐受是有可能的，所以,尽量选择免疫原性较强的目的基因。,3.抗DNA抗体的形成,质,粒DNA免疫原性非常弱,，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，至少目前没有检测到,抗DNA抗体,的报道。,4.其他问题,质粒上通常还有抗生素抗性基因，对人体的影响？,不用抗生素抗性基因，又如何筛选呢？,如何彻底去除内毒素的污染？,质粒DNA能否保持环状等？,应用前景非常乐观,九、常用研究方法举例,鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究。,免疫学杂志，2005;21,(,3,),:208-211,1.目的,：获得含有鼠疫杆菌F1和V抗原(两种保护性抗原)编码基因的重组质粒pcDNATE/F1-V，并测定其诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力。,2.方法和结果,(1),PCR扩增目的基因片段、构建重组载体；,A.从GenBank中查出F1、V蛋白编码基因序列,必须是完整ORF序列：,ATG,开始,有TAA、TAG、TGA、CTG、ACT、GAG等终止密码结尾。,B.用引物设计软件设计引物,(,同进两端引相应的酶切位点,),;,C.将目的基因经酶切后克隆入相应的MCS,两基因共同位于同一真核表达调控序列和起始密码子下。,实际上是一粘端连接构建,融合基因,的例子,融合基因的构建,(2),基因表达功能的鉴定；,A.转染真核细胞,(,COS-7,),：一般用脂质体与重组质粒混合，转染指数生长期的COS-7细胞,(,50%80%的细胞融合度,),；,B.Western blot或DOT-EIA检测转染细胞中的目的基因的表达;,C.在没有特异抗体的情况下，有时也可用逆转录PCR检测靶基因的mRNA，以确定其是否表达。,(3),动物试验,提取大量质粒，选用合适的途径注射给试验动物,(4),免疫指标检测,A.ELISA检测血清效价：用重组融合蛋白,(,用相同靶基因构建的另一原核表达系统表达及纯化的蛋白,),作包被抗原，检测血清相应抗体的效价；,B.抗体亚型分类：用重组融合蛋白作包被抗原，选用不同的亚型的二抗，检测特异性的IgG1、IgG2及IgM;,C.ELISPOT法检测动物脾淋巴细胞分泌IFN-的能力.,ELISPOT法,常规制备免疫小鼠脾细胞，将ELISPOT板用抗IFN-抗体包被，再用该板来增养一定量的脾细胞，用重组融合蛋白,(,最好是用天然抗原，比如鼠疫杆菌培养液等,),刺激脾细胞，洗板显色后观察斑点形成数。,(5),统计学分析,统计分析各组的差异。,试验动物保护性试验,