DNA的粗提取与鉴定公开课一等奖课件省赛课获奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题1,DNA的粗提取与鉴定,课题目的:,理解DNA的理化性质,理解DNA的,粗提取,以及DNA,鉴定,的,原理,重点难点:,DNA的,粗提取,和,鉴定,的,原理,课题1 DNA的粗提取与鉴定,一.基础知识,一)提取DNA的办法,2、DNA粗提取的基本思路：,1、提取生物大分子的基本思路：,选用一定的物理或化学办法分离含有不同物理或化学性质的生物大分子（如蛋白质、核酸）。,运用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差别，提取DNA，去除其它成分。,3.DNA的理化性质,在NaCl溶液浓度在0.14 mol/L时,DNA溶解度最小；低于(或高于)0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的减少(或增加)而逐步增大。,DNA的,不溶于,酒精，某些蛋白质溶于酒精,（1）溶解性,看图思考：1、在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,2、如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,1）DNA在NaCl溶液中的溶解度,2）DNA在酒精溶液中的溶解度,4.DNA的其它特性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在80以上才会变性,洗涤剂能够崩溃细胞的细胞膜，但对DNA没有影响,二)DNA的鉴定原理,DNA,二苯胺,试剂,沸水浴,溶液变,蓝色,二苯胺试剂的配制,称取,1.5g,二苯胺，溶于,100ml,冰醋酸中，再加入,1.5ml,浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在,10ml,的上述溶液中再加入,0.1ml,体积分数为,0.2%,的乙醛溶液。,参考资料（教材57页）,一)实验材料的选用,选材原则：DNA含量高、材料易得、便于提取,二)破碎细胞，获取DNA的滤液,1、动物细胞,加蒸馏水让细胞吸水胀破,过滤得滤液,搅拌可,加速,细胞破裂,想一想：1、如何避免血液凝固？,2、为什么不是使用的鸡全血？,二.实验设计,思考：教材55页提供的材料，这些材料与否都适合做实验？哪些材料成功的可能性较大？,如选择鸡血细胞液,洗涤剂能溶解细胞膜，使膜崩溃，利于释放DNA,食盐重要成分是NaCl，有助于DNA的溶解,细胞内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少；造成看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色。,二)破碎细胞，获取DNA的滤液,1、动物细胞,加蒸馏水让细胞吸水胀破,过滤得滤液,2、植物细胞,加洗涤剂和食盐,充足搅拌研磨,过滤得滤液,旁栏思考：,1、这里洗涤剂和食盐分别起什么作用？,2、如果研磨不充足，会对实验成果产生如何的影响？,三)去除滤液中的杂质,1.杂质,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,2.去除办法,阅读P55方案一：为什么重复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；,用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。,因此，通过重复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多个杂质。,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是运用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；,方案三运用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离,四)DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数为95)，静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一种方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。,1、,DNA,的析出,2、DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入2mol/L 的NaCl溶液5mL于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4mL试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液与否有蓝色。,DNA析出其它办法,实验普通规定采用预冷的95的乙醇，从理论上分析，预冷的乙醇溶液含有下列优点。一是克制核酸水解酶活性，避免DNA降解；二是减少分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有助于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。此时悬浮于溶液中的DNA丝状物相对含杂质较少，如果出现的丝状物较少，能够将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。,DNA的纯化尚有许多其它办法。例如，添加质量分数为25的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随即，加入氯仿-异丙醇混合液（体积比为241），通过离心将蛋白质及其它杂质除去,取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。另外苯酚能够快速使蛋白质变性，克制核酸酶的活性。运用苯酚解决后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变,性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将两者分开。,DNA的鉴定办法,（1）二苯胺法,（2）紫外灯照射法：,紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸取高峰在260 nm处)。,（3）电泳法（详见课题二）,此办法适合鉴定纯度较高的DNA。,1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，避免血液凝固。,2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续环节的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，造成DNA分子不能形成絮状沉淀。,3、二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果,操作提示,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 m1,L,的,NaCI,溶液,40,mL,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,5,.,滤取含,DNA,的黏稠物,6,.,将,DNA,的黏稠物再溶解,2 mol,L,的,NaCl,溶液,20 mL,7,.,过滤含,DNA,的,NaC,l,溶液,8,.,提取含有杂质较少的,DNA,冷却的,95,的酒精,50 mL,A,:,(1),向试管中加入,0,.,015 mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2),加入,DNA,(3)4 mL,二苯胺试剂,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,0,.,015mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺试剂,以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,加入柠檬酸钠溶液的目的是避免血凝固,加速血细胞破裂,溶解,DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大程度地释出,使含,DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽量多的溶解于溶液中,除去含,DNA的滤液中的杂质,提取,DNA,A出现蓝色 B无变化,四.成果分析与评价,可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,（二）分析DNA中的杂质,（三）不同实验办法的比较,选用不同的实验材料，,同种材料采用不同办法，多方面比较实验成果，如DNA纯度、DNA颜色、二苯胺显色深浅等，看哪种实验材料或提取办法的效果更加好。,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，阐明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色阐明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,（一）与否提取出了DNA,五.课题延伸,1、不同种的材料DNA的含量同样多吗？,2、同一种材料使用不同的办法提取，提取到的DNA含量同样多吗？,