第九章-新型生物制药技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,新型生物制药技术,苟兴华,第一节 核酸药物及其制药技术,反义核酸（Antisense nucleic acid)和核酶(Ribozyme),RNA干扰(RNAi)药物,核酸药物的修饰和给药,DNA疫苗(DNA vaccine)技术,反义核酸,反义RNA分子,：可以和目标基因的mRNA互补的,一段寡聚核苷酸分子,，它影响mRNA正常功能；,反义DNA分子：,类似于反义RNA分子，可以,抑制基,因表达,的分子；,RNA-DNA嵌合分子：,经化学修饰的寡聚核苷酸类似物,：Oligo,反义核酸,作用机理,与前体RNA结合干扰RNA剪切和成熟,与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译,与mRNA形成dsRNA，诱导RNase H对其降解,与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物，,影响DNA复制,特点,双链RNA（如siRNA）作用强烈；,与核酶连接作用更强。,核酶（Ribozyme),核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜热四膜虫中首先发现。,目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种,发卡状核酶,锤头状核酶,型内含子核酶,RNaseP,核酶,丁型肝炎病毒核酶,RNA干扰药物,RNA干扰（RNA interference，RNAi）,是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程，其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。,RNAi的作用原理,双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：,启动阶段 执行阶段,RNAi的作用原理,启动阶段,当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体”,（RNA-induced silencing complex，RISC）,执行阶段,当目标mRNA与RISC中的siRNA,完全配对,时，RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达,启动阶段原理图,启动阶段,RISC,RISC前体,Dicer,（21-23bp）,siRNA,执行阶段原理图,执行阶段,核酸酶切割,胞内其它,AAAAAAA,切割,RISC,AAAAAAA,mRNA,核酸酶切割,胞内其它,AAAAAAA,切割,RISC,AAAAAAA,mRNA,siRNA药物,长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的,小双链RNA即siRNA,，则,不会诱导干扰素反应,，,却能在细胞中激活RISC,，,发挥抑制基因表达的作用,。,siRNA的作用,体外实验和动物模型研究证明,siRNA药物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。,siRNA还可以治疗一些非感染性疾病,：美国正在开发一种治疗老年性黄斑变性的siRNA药物,siRNA药物优点与缺点,优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物,具有目标基因专一,性强,与反义RNA相比，siRNA药物的,作用机制更加明确，,效果更加肯定,缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因,此,对于目标RNA的突变很敏感。,个别位点的突变会使,效果大打折扣,在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株,siRNA的设计和制备,siRNA的制备,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,正义链,反义链,混合,双链RNA,Dicer酶加工,Dicer酶加工,siRNA,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,Dicer酶加工,siRNA,Dicer酶加工,siRNA,Dicer酶加工,siRNA,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,双链RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,Dicer酶加工,双链RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,siRNA,Dicer酶加工,双链RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,siRNA的设计和制备,siRNA的设计,应选取,对于疾病发生具有至关重要作用，而对细胞的其他功能影响不大的,保守基因,作为目标基因，再根据目标基因的序列设计siRNA,Tom Tuschl根据实验提出了一个,设计siRNA的原则,：,选择转译起始密码子后,50-100碱基,的范围，以,AA,作为正义链的第1，2个核苷酸，,GC比为50,左右,，同时在,正义链和反义链的3,-,都有TT两个核苷酸的突变,siRNA的设计和制备,siRNA的制备,siRNA,Dicer酶加工,双链RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,siRNA,Dicer酶加工,双链RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法,：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒,大规模的化学合成方法：,可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性,大规模的化学合成方法：,可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性,大规模的化学合成方法：,可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性,核酸药物的修饰和给药,人体内存在大量的,核酸酶,，在体内应用反义RNA，siRNA等新型核酸药物治疗时，一个,关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降解并被有效地运输到靶细胞,。,RNA的化学修饰,是一个有效的途径,修饰磷酸二酯键,修饰核酸,修饰骨架,化学修饰,修饰骨架,化学修饰,修饰核酸,修饰骨架,化学修饰,修饰磷酸二酯键,修饰核酸,修饰骨架,邓子新Nature Chemical Biology 2007.,核酸药物的修饰和给药,增强核酸药物有效运送到靶组织的方式：,用,脂质体等材料包埋,核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加入,有助于膜融合的分子,如氯喹,，可以进一步提高它们进入细胞的效率,在核酸分子上,连接一段可以进入细胞的肽段,即转导肽,不同的应用目的应采用不同的给药方式：局部注射、静脉注射，有报道表明核酸药物还可以通过皮肤给药,DNA疫苗,不同于传统的蛋白质疫苗，DNA疫苗是,通过基因重组技术把编码抗原蛋白的基因序列克隆到质粒,，并在基因的,上游加上细胞可以识别的启动子,，形成一个表达载体。将这个,表达载体DNA直接导入宿主细胞,，由细胞的基因转录、转译系统直接合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到防病治病目的,DNA疫苗原理,DNA疫苗较传统蛋白疫苗的优点,构建生产方便，适合作为快速反应的疫苗,免疫原经过适当的加工，优于基因工程生产的抗原蛋白,可引起体液免疫和细胞免疫双重效果,DNA,疫苗的表达载体进入细胞并由细胞产生蛋白，产生的蛋白,一方面作为一种外源蛋白，被细胞识别并由并由,型主要组织相容性复合体呈递到细胞表面诱导体液免疫,;,另一方面蛋白被分泌到胞外诱导,B,细胞产生相应的抗体,4.,安全性好,第二节 基因治疗技术,基因治疗的关键是将正确的基因导入人体,基因导入的方式有两种方式：,离体基因导入,和,体内基因导入,患者,移植,细胞扩增,基因修正的细胞,筛选,目标组织细胞,基因转入,基因载体,载体,离体基因导入方式,：,治疗基因,患者,注射或其他方法,载体扩增,基因载体,载体,体内导入方式,：,治疗基因,基因治疗的方法,非生物法导入基因,常用的方法,是用脂质体包裹DNA分,子，,此外,也将基因连接到一些高分子材料上,生物法导入基因 生物法导入基因,主要利用病毒作为基因,载体,将基因导入目标细胞，但近年也有利用细胞内寄生,菌进行基因导入的实验研究,常用的病毒载体有：腺病毒,腺相关病毒,反转录病毒,基因治疗的现状与挑战,基因治疗在短短的20年里取得了很大的进步，确定了一批可以用基因治疗手段治疗的疾病，在动物模型等方面取得了良好的效果，同时已经有许多治疗方案进入临床试验,但在快速发展过程中也出现了一些问题。特别是1999年美国宾州大学在进行鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的基因治疗期临床试验时，一名18岁的患者接受高剂量腺病毒载体治疗后不幸死亡的案例，以及2002年末在法国接受腺苷脱氨酶导入治疗严重复合免疫缺陷征的两名患病儿童次年发生了由反转录病毒载体引发的白血病的案例。因此各国对基因治疗采取了更加慎重的态度，制订了更加严格的研究规范,肿瘤的基因治疗,肿瘤的基因治疗与遗传病的基因治疗不同，不强调基因长期表达和持续发挥作用，而是要求快速杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长和转移。因此对肿瘤基因载体的要求也就不同，不强调基因整合，而是强调通过基因治疗调动多种途径杀伤肿瘤细胞。这些途径包括：,1.通过治疗基因抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡,2.选用在肿瘤细胞可复制的病毒载体，通过病毒感染,杀伤肿瘤细胞,3.通过诱导免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞,4.通过病毒载体表达药物前体的转化酶基因,第三节 基于细胞的治疗技术,一、免疫细胞治疗技术,二、基于干细胞的治疗技术,免疫细胞治疗技术,细胞免疫在疾病预防治疗中的关键作用,基于T细胞的免疫治疗,基于天然杀伤细胞的免疫治疗,基于树突状细胞的免疫治疗作用,细胞免疫在疾病预防治疗中的关键作用,免疫细胞类型繁多，主要有,T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核吞 噬细胞、树突状细胞、天然杀伤细胞、颗粒细胞等,在免疫功能正常的个体中，免疫细胞保持高度的活性，但由,于病原体感染或肿瘤细胞的一些特性，,会形成免疫逃逸、耐受等现象,。此时可以,通过人为激活免疫细胞的方法,来加强对特定目标的识别，起到治疗疾病作用,目前作为治疗手段的免疫细胞主要有：,NK细胞、T细胞、树突状细胞,基于T细胞的免疫治疗,T细胞根据功能分为,辅助性T细胞（T,H,细胞）,和,细胞毒性T细胞（T,C,细胞）,T,H,细胞表面带有分子标记,CD4,，能识别抗原，分泌多种淋巴因子，其功能是调节免疫系统增强免疫能力。,T,C,是效应T细胞，表面带有分子标记,CD8,，在抗原刺激下大量增值，并与靶细胞结合发挥杀伤靶细胞的功能。,在一些病毒感染中，病毒感染的细胞表面虽带有明显的的抗原，但T细胞不能有效的识别并清除它们。如果在患者体内接入经病毒抗原激活的T细胞，就可以有效的清除感染细胞。,对于肿瘤也有类似的情况，,主要的治疗方法：肿瘤浸润淋巴细胞法、细胞因子诱导的杀伤细胞法。,基于天然杀伤细胞的免疫治疗,NK细胞对被感染细胞和肿瘤细胞有很强的,广谱杀伤能力,，作用迅速且没有抗原专一性。它的,表面有MHC-的抑制性受体，优先杀伤很少表达或不表达MHC-类的靶细胞，,因此肿瘤细胞就是NK细胞的作用对象,NK细胞除了能杀伤细胞外，还能,释放INF-,和GM-CSF,（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）等细胞因子，促进包括T细胞反应在内的获得性免疫反应对抗肿瘤,LAK细胞是最早用于细胞免疫治疗的一类细胞,基于树突状细胞的免疫治疗作用,抗原呈递是免疫识别和免疫应答的关键步骤，具有抗原呈递功能的细胞包括：巨噬细胞、树突状细胞（DC细胞）、微皱褶细胞（M细胞）、B淋巴细胞，,而DC细胞是目前已知的一种最重要的抗原呈递细胞,由于DC的抗原呈递功能，可以,人为地让DC负载一些肿瘤抗原,，将这些细胞植回患者体内以,打破对肿瘤的免疫耐受,，提高免疫系统对肿瘤细胞的专一性识别和清除能力,基于干细胞的治疗技术,胚胎干细胞,动物实验显示,由胚胎干细胞产生的各种细胞,，包括血细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞和肌肉细胞等,移植入体内可发挥相应的功能,在疾病治疗方面 它可以分化为各种类型的组织细胞，在适合的条件下甚至可能发育为完整的器官，,干细胞技术的发展有可能解决器官移植供体来源短缺的难题,基于干细胞的治疗技术,成体干细胞,来源广泛，且可从自体获得，可避免异体免疫排斥反应。,骨髓移植就属于成体干细胞的造血干细胞的移植,，除此之,外其他具有应用前景的成体肝细胞还有：,1.上皮干细胞,2.神经干细胞,3.胰腺干细胞,