重组DNA技术讲解课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,重组DNA技术讲解,*,重组DNA技术讲解,重组,DNA,技术,（,recombinant DNA technology,）,又称,分子克隆,（,molecular cloning,）或,DNA,克隆（,DNA cloning,）或基因克隆（,gene cloning),技术，是指在体外,利用酶学方法,将目的,DNA,片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组,DNA,分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一,DNA,分子的大量拷贝。,2,重组DNA技术讲解,第 一 节,重组,DNA,技术中常用的,工具酶,Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology,3,重组DNA技术讲解,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,反转录酶,合成,cDNA,；替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,末端脱氧核苷酰转移酶,在,3,羟基末端进行同聚物加尾,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；,DNA,序列分析；填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,Taq,DNA,聚合酶,常用于,PCR,；产物的,3,末端带有,A,，可用于,T-A,克隆,多核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,4,重组DNA技术讲解,一、限制性核酸内切酶用于切割,DNA,定义,:,限制性核酸,内切,酶,(restriction endonuclease,RE),是识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,限制性核酸内切酶是重组,DNA,技术中重要的工具酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,5,重组DNA技术讲解,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；,第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属,种,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,（一）重组,DNA,技术中通常使用,型限制酶,6,重组DNA技术讲解,（二）,型限制性内切酶具有一些共性和特性,1.,具有特定的识别和切割位点,限制性内切酶,识别位点,限制性内切酶,识别位点,Apa,I,GGGCCC,CCCGGG,Sma,I,CCCGGG,GGGCCC,Bam,H I,GGATCC,CCTAGG,Sau,3A I,GATC,CTAG,Pst,I,CTGCAG,GACGTC,Not,I,GCGGCCGC,CGCCGGCG,Eco,R I,GAATTC,CTTAAG,Sfi,I,GGCCNNNNNGGCC,CCGGNNNNNCCGG,II,型限制性内切酶的识别位点举例（,示切割位点）,7,重组DNA技术讲解,2.,识别的核苷酸序列通常为回文结构（,palindrome,）,8,重组DNA技术讲解,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,黏端切口,3.,切割双链,DNA,分子后产生黏端或平端,（,sticky end,）,（,blunt end,）,9,重组DNA技术讲解,同尾酶,（,isocaudarner,）,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的黏端，,这样的酶彼此互称为同尾酶,。这两个相同的黏端称为,配伍末端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,4.,不同的酶可以产生同样的末端,10,重组DNA技术讲解,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,CCCGGG,GGGCCC,C,CCCGG,CCGGG,G,+,Xma,CCCGGG,GGGCCC,CCC,GGG,GGG,CCC,+,Sma,能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（,isoschizomer,）或同裂酶。,5.,不同的酶可以识别同一个序列,11,重组DNA技术讲解,6.,切割会受其他因素的影响,限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。,缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。例如，,Eco,R I,在正常情况下识别“,-GAATTC-,”序列，但在甘油浓度大于,5%,（,v/v,）或反应温度较低时识别序列可变为“,-AATT-,”或“,-,嘌呤嘌呤,AT,嘧啶嘧啶,-,”，这种现象称为星号活性（,star activity,），以,Eco,R I*,表示。,12,重组DNA技术讲解,二、,DNA,连接酶用于催化,DNA,片段连接,DNA,连接酶（,DNA ligase,）：催化两个相邻的,3-OH,和,5-,磷酸基团形成,3,，,5-,磷酸二酯键，从而使,DNA,片段或单链断裂形成的缺口连接起来。,连接酶的作用机制,13,重组DNA技术讲解,1.,大肠杆菌染色体编码的,DNA,连接酶,需,NAD,+,作为辅因子,2.,大肠杆菌,T4,噬菌体,DNA,编码的,T4 DNA,连接酶,需,ATP,作为辅因子,DNA,连接酶的来源,14,重组DNA技术讲解,三、重组,DNA,技术中还需使用其他常用工具酶,（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团,（二）反转录酶以,RNA,为模板合成,cDNA,（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给,DNA,末端加尾以构成,黏,性末端,（四）,DNA,聚合酶,I,主要用于合成,DNA,（五）,DNA,聚合酶,I,大片段保留了有用的酶活性,（六）,Taq,DNA,聚合酶常用于,PCR,（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链,5,羟基末端磷酸化,15,重组DNA技术讲解,来自于大肠杆菌（,bacterial alkaline phosphatase,，,BAP,）或小牛肠（,calf intestinal alkaline phosphatase,，,CIP,）。用于脱去,DNA,（,RNA,）,5,末端的磷酸基团，使,5-P,成为,5-OH,，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。,（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团,P,5,OH,3,OH,3,P,5,OH,5,OH,3,OH,3,OH,5,16,重组DNA技术讲解,（二）反转录酶以,RNA,为模板合成,cDNA,反转录酶,（,reverse transcriptase,）,反转录酶催化的,cDNA,合成,RNA,RNA,5,3,AAAAAA,AAAAAA,TTTTTT,5,3,cDNA,cDNA,随机引物,Oligo-dT,17,重组DNA技术讲解,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端转移酶,（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给,DNA,末端加尾以构成黏端,18,重组DNA技术讲解,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,DNA polymerase I,）是基因工程中常用的,DNA,聚合酶。其除具有,53,聚合酶活性外，还有,35,及,53,核酸外切酶活性。因其具有,53,核酸外切酶活性而常用于,DNA,探针的,缺口平移法,（,nick translation,）标记。,（四）,DNA,聚合酶,I,主要用于合成,DNA,19,重组DNA技术讲解,DNA,聚合酶,I,用枯草杆菌蛋白酶（,subtilisin,）裂解后产生的大片段，也称为,Klenow,片段,（,Klenow fragment,）。其保留了,53,聚合酶活性及,3 5,外切酶活性，失去了,5 3,外切酶活性。,Klenow,片段的主要用途有：补齐双链,DNA,的,3,末端，使其转变成平端；或通过补齐,3,端而使,3,末端标记；在,cDNA,克隆中，用于第二股链的合成；用于,DNA,序列分析。,（,五）,DNA,聚合酶,I,大片段保留了有用的酶活性,20,重组DNA技术讲解,（六）,Taq,DNA,聚合酶常用于,PCR,Taq,DNA,聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定性，常用于,PCR,。该酶具有,53,聚合酶活性及,53,外切酶活性，但没有,35,外切酶活性，因而无,35,校对活性。,另外，,Taq,DNA,聚合酶具有末端转移酶作用，能在所合成,DNA,链的,3,末端加上一个单独的腺苷酸残基（,A,）。,21,重组DNA技术讲解,（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链,5,羟基末端磷酸化,常用的是,T4,多核苷酸激酶（,T4 polynucleotide kinase,），该酶含,5,多核苷酸激酶和,3,磷酸酶活性，能催化,ATP,的,-,位磷酸向,DNA,和,RNA,的,5-,羟基转移。,该酶常用于：,DNA,或,RNA,的,5,末端标记；使没有,5-,末端磷酸的,DNA,片段磷酸化，以供连接和克隆之用。,22,重组DNA技术讲解,第二节,目的,DNA,的获取,Preparation of Interested DNA,23,重组DNA技术讲解,一、,化学合成法可直接合成目的,DNA,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列,应用：一般用于小分子肽类基因的合成,24,重组DNA技术讲解,*,化学合成法获取目的,DNA,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,色 苯丙 蛋 赖,25,重组DNA技术讲解,第一步：构建,基因组,DNA,文库,（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组,DNA,序列的随机克隆群体，以,DNA,片段的形式贮存了所有的基因组,DNA,信息）。,第二步：筛选含有目的基因的克隆。,二、,从基因组,DNA,文库中获取目的,DNA,26,重组DNA技术讲解,组织或细胞染色体,DNA,基因片段,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶或机械剪切,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,片段的集合,*,从基因组,DNA,文库获取目的基因,27,重组DNA技术讲解,三、从,cDNA,文库中获取目的,DNA,第一步：构建,cDNA,文库,（包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部,mRNA,经反转录而合成的,cDNA,序列的克隆群体，它以,cDNA,片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。,第二步：筛选含有目的,cDNA,的克隆。,28,重组DNA技术讲解,cDNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有,cDNA,片段的集合,29,重组DNA技术讲解,从,基因组,DNA,文库或,cDNA,文库中筛选目的,DNA,的策略,1.,菌落或噬斑原位杂交,2.,针对表达文库，可用抗原,-,抗体或配体,-,受体结合的原理（亲和筛选法）筛选,30,重组DNA技术讲解,如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用,PCR,反应，从基因组,DNA,或,cDNA,中获得目的基因，可不必要经过复杂的,DNA,文库构建过程。,PCR,是一种高效快速的体外,DNA,聚合程序,四、经,PCR,获取目的,DNA,31,重组DNA技术讲解,酵母单杂交系统,五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码,DNA,A.,无转录因子：报告基因不表达,“,诱饵”,DNA,序列,B.,有转录因子：报告基因表达,C.,有转录因子,AD/DNA,结合蛋白融合蛋白：报告基因表达,转录因子的,AD,转录因子,DNA,结合蛋白,报告基因,报告基因,报告基因,.,32,重组DNA技术讲解,第三节,重组,DNA,技术中的,DNA,载体,DNA Vectors in Recombinant DNA Technology,33,重组DNA技术讲解,载体（,vector,）,是为携带感兴趣的外源,DNA,，实现外源,DNA,在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子,按功能分,克隆载体（,cloning vector,）,表达载体（,expression vector,）,按基本元件的来源不同,质粒载体,噬菌体载体,黏粒载体,病毒载体,人工染色体载体等,载体概述,34,重组DNA技术讲解,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为,表达载体。,35,重组DNA技术讲解,一、克隆载体用于外源,DNA,的克隆和无性繁殖,（一）克隆载体应具备的主要特点,至少有一个复制起点（,origin of replication,ori,）,至少有一个选择性标志（,selection marker,）,有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（,multiple cloning sites,，,MCS,）,应有较高的拷贝数。,pBR322,质粒图谱,36,重组DNA技术讲解,1.,质粒,(plasmid),特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,（二）常用克隆载体有多种,37,重组DNA技术讲解,pUC,系列质粒图谱,38,重组DNA技术讲解,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用于,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用于基因组,DNA,克隆）,cos,位点,:,噬菌体,DNA,为线性双链分子，两端各有一条由,12,个碱基组成、彼此完全互补且,5,单链突出的序列（即粘性末端），称,cos,位点,2.,噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,39,重组DNA技术讲解,3.,穿梭载体（,shuttle vector,）,人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源,DNA,序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,40,重组DNA技术讲解,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体,依据其宿主细胞的不同可分为,:,原核表达载体（,prokaryotic expression vector,）,真核表达载体（,eukaryotic expression vector,）,二、表达载体用于外源,DNA,的表达,41,重组DNA技术讲解,（一）,原核表达载体用于在原核细胞中表达外源基因,从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体是大肠杆菌表达载体。原核表达载体的基本组成如下：,R,：调节序列；,P,：启动子；,SD,：,SD,序列；,TT,：转录终止序列,大肠杆菌表达载体,42,重组DNA技术讲解,Lac,启动子（乳糖启动子）,Trp,启动子（色氨酸启动子）,Tac,启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子）,P,L,和,P,R,启动子（,噬菌体的左向和右向启动子）,T7,启动子,1.,启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被,RNA,聚合酶所识别：,目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种,43,重组DNA技术讲解,2.SD,序列提供核糖体结合位点,mRNA,在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位点（,ribosome binding site,）的存在。,SD,序列（,Shine-Dalgarno sequence,）位于转录起始位点上游,8,13 bp,处，为富含嘌呤的短片段，其能与核糖体,30S,小亚基中的,16S rRNA 3,端的部分序列互补结合。,SD,序列作为核糖体结合位点，保证了翻译起始复合物的形成。,44,重组DNA技术讲解,3.,转录终止序列有助于外源基因的高效表达,尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中都带有转录终止序列。,转录终止序列长短不一，短的只有几十,bp,，长的可达几百,bp,。,转录终止序列有助于使,RNA,聚合酶重点转录克隆的外源基因，控制所转录,RNA,的长度，提高,RNA,稳定性。,位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。,45,重组DNA技术讲解,4.,几种常见的原核表达载体各有特点,依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为,（,1,）非融合型表达载体,（,2,）融合型表达载体,（,3,）分泌型表达载体,46,重组DNA技术讲解,（,1,）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白,非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。,使用强启动子,tac,，紧接,tac,启动子的是多克隆位点，目的基因克隆于启动子和,SD,序列下游。在多克隆位点下游包含一个很强的,rrnB,核糖体,RNA,的转录终止子，其作用是为了稳定载体系统，因为上游强的,tac,启动子控制的转录必须由强终止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性有关的基因表达。载体的其余部分来自,pBR322,。,使用,pKK223-3,时，应配套使用,LacI,q,宿主菌，在无,IPTG,诱导时，,tac,启动子受阻遏，当加入,IPTG,后，便可去阻遏，从而使外源基因表达。,47,重组DNA技术讲解,将一段特殊的蛋白质（或短肽）的基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表达可形成融合蛋白（,fusion protein,）。表达该类蛋白的载体称为融合型表达载体，如,pGEX,系统。,pGEX,系统包括多种载体，如,pGEX-lT,、,pGEX-2T,、,pGEX-3X,、,pGEX-4T,、,pGEX-5X,、,pGEX-6P,等。该系统载体使用强启动子,tac,，紧接启动子的是,SD,序列及其下游的,GST,基因，然后是多克隆位点。用,IPTG,可诱导目的基因的表达，表达产物与,GST,融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化,。,（,2,）融合型表达载体用于表达融合蛋白,48,重组DNA技术讲解,该类载体的优点是能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。,在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有编码信号肽的序列（通常置于,SD,序列下游）。,分泌型载体既可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。,pIN,系列载体是较常用的分泌型表达载体，可使所表达的蛋白分泌到宿主菌的周质腔中。该系列载体以,pBR322,为基础构建而成，带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即,lpp,（脂蛋白基因）启动子，其中编码信号肽的序列取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因,ompa,（外膜蛋白基因）。,（,3,）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达,pIN,系列载体有,3,种，即,pIN-ompA1,、,pIN-ompA2,和,pIN-ompA3,，分别适用于使用不同密码子框架的目的基因的插入，克隆位点分别为,Eco,R,、,Hind,和,Bam,H,。,49,重组DNA技术讲解,（二）真核表达载体用于在真原核细胞中表达外源基因,真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表达载体中还具有：,真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、,poly A,加尾信号等,真核细胞复制起始序列,真核细胞药物抗性基因,50,重组DNA技术讲解,Ori,Pro,：原核复制起始序列；,P,：启动子；,MCS,：多克隆位点；,TT,：转录终止序列；,ori,euk,：真核复制起始序列。注：不是所有真核表达载体都有整合序列,真核表达载体的基本组成,51,重组DNA技术讲解,真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很大。某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如,Rous,肉瘤病毒基因组长末端重复序列（,long terminal repeats,，,LTR,）、,SV40,病毒早期基因的启动子和增强子、人类巨细胞病毒（,CMV,）启动子等。这些启动子和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表达载体中被普遍使用。,52,重组DNA技术讲解,真核表达载体带有的,poly A,加尾信号可保证新转录的,mRNA,能有效地加上,poly A,。,为,mRNA,加上,poly A,依赖于,mRNA 3,末端的,AAUAAA,和其下游的,GU,或,U,富含区。,尽管全长,cDNA,克隆可能已带有,AAUAAA,序列和一段,poly A,，但这些序列仍不足以保证,poly A,的有效形成。因此，载体中必须带有,poly A,加尾信号。,常用的来自,SV40,的,poly A,加尾信号为,237 bp,，其中同时含有针对早期和晚期转录子的切割和,poly A,加尾信号。两套信号作用的方向相反，并分别位于不同的,DNA,链上，对,mRNA,的加工均很有效。,53,重组DNA技术讲解,酵母表达载体,昆虫表达载体,哺乳类细胞表达载体,根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要分为,：,54,重组DNA技术讲解,（,1,）酵母表达载体适于在酵母细胞中表达外源蛋白,根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵母载体分为五类，,YIp,：酵母整合型质粒,YRp,：酵母复制型质粒,YCp,：酵母着丝粒型质粒,YEp,：酵母游离型质粒,YLp,：酵母线性质粒,除,YLp,外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵母细胞中复制与扩增。,55,重组DNA技术讲解,根据在转化酵母细胞中的复制机制，又可将酵母载体分为两个基本类型：,整合型载体，如,YIp,包含一个酵母,ura3,标志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复制的元件，其需通过质粒,DNA,与酵母,DNA,同源序列重组而整合至酵母基因组中,。,自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞中有自我复制能力而得名，属于这类载体的有：,YRp,、,YEp,和,YCp,。,56,重组DNA技术讲解,（,2,）昆虫表达载体可在昆虫细胞中表达真核基因,昆虫表达载体主要有两类：,杆状病毒表达载体。载体的启动子为多角体蛋白,(polyhedrin),基因的启动子，所使用的外泌信号序列来自蜜蜂的,milittin,序列，其可在宿主细胞（如,Sf9,或,Sf20,）中高水平表达外源蛋白。,果蝇表达载体。载体上的启动子有,Ac5,（果蝇黑素激动蛋白,5C,基因）启动子和,MT,（果蝇黑素金属硫蛋白基因）启动子，所使用的外泌信号序列为,Bip,序列，其可连续表达或诱导表达外源蛋白。,57,重组DNA技术讲解,（,3,）哺乳类细胞表达载体适宜在哺乳类细胞中表达真核基因,据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体,据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体,DNA,，可将其分为整合型和非整合型载体,整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达,最常用的哺乳类细胞表达载体是,病毒载体,58,重组DNA技术讲解,一个理想的病毒表达载体，通常应具备以下条件：,使用安全，对宿主细胞无毒副效应；,能容纳较大的外源,DNA,片段且转染效率高；,所产生的病毒效价高；,外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达,病毒的靶向性强；,外源基因的表达具有可控性。,然而，遗憾的是，到目前为止，还没有任何一个病毒载体能满足以上全部理想条件。,59,重组DNA技术讲解,目前，常用的病毒表达载体包括如下多种：,反转录病毒（,retrovirus,RV,）载体,RV,属,ssRNA,病毒。,构建,RV,载体时，将,RV,的,DNA,插入,pBR322,质粒，同时删除,RV,的三个编码基因，保留两端的,LTR,和病毒颗粒包装序列,，再加入供筛选的标记基因。,5LTR,具启动子和增强子活性并具转录起始信号，,3LTR,具转录终止信号。,RV,载体具有较高整合和表达外源基因的能力，广泛用于转基因动物和基因治疗研究，但因其随机整合，其安全性问题需加以考虑。,60,重组DNA技术讲解,慢病毒（,lentivirus,LV,）载体,LV,载体是以,HIV-1,（,I,型人类免疫缺陷病毒）为基础发展起来的表达载体；,与一般,RV,载体不同的是，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力；,该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而获得持久表达；,该载体宿主细胞较广，在表达目的蛋白和小干扰,RNA,方面都有广泛应用,。,61,重组DNA技术讲解,腺病毒（,Adenovirus,AV,）载体,AV,属线性,dsDNA,病毒；,目前，普遍使用的是,AV,第三代载体，载体中去除了所有,AV,的编码基因，仅保留了,5,和,3,末端反向重复序列（,inverted terminal repeats,，,ITR,）及病毒包装序列,，病毒载体外壳的包装需要辅助病毒提供编码序列；,第三代,AV,载体能容纳较大的,DNA,片段，能较长时间地表达外源基因，其毒性和免疫原性都大大降低。,62,重组DNA技术讲解,腺相关病毒（,adenovirus-associated virus,，,AAV,）载体,AAV,属于线性,ssDNA,病毒。,构建,AAV,载体时，用外源基因及其调节序列取代病毒的,rep,和,cap,编码区，仅保留两端,145 bp,的,ITRs,，负责病毒的获救、复制、包装与整合；而辅助质粒则保留所有编码序列而无,ITRs,。两种质粒间无重复序列，重组,AAV,复制和壳化所需的,rep,和,cap,基因，由辅助质粒直接以蛋白表达方式提供，故不会发生野生型病毒序列的重组、复制和包装。当,AAV,载体与辅助质粒共转染辅助病毒（,AV,）感染的细胞时，即能获救、复制并包装成重组,AAV,颗粒。,AAV,载体具有能稳定表达外源基因、特异整合至人的,19,号染色体长臂末端、病毒稳定且宿主范围广、不引发免疫反应等优点,。,63,重组DNA技术讲解,（一）黏粒兼具质粒和噬菌体,DNA,的特性,黏粒（,cosmid,）：又称粘性质粒或装配型质粒，是由,DNA,的,cos,区与质粒重新构建而成的杂合双链环状,DNA,载体。,黏粒的特点：含有质粒的抗性标记基因及复制起点和多克隆位点，可按质粒的方式在宿主菌中进行自主复制；带有,噬菌体,DNA,的,cos,序列，可像,噬菌体,DNA,一样进行体外包装；黏粒本身较小，通常只有几,kb,，但能容纳高达,50 kb,的外源,DNA,片段；非重组体黏粒很小，故不能在体外进行包装，所以有利于后续阳性克隆的筛选；黏粒因缺乏全部,基因，不会产生噬斑，但在选择培养基平板上形成菌落，这一点也与质粒载体一致。,三、特殊载体具有特定用途,黏粒,pJB8,图谱,64,重组DNA技术讲解,（二）,BAC,、,PAC,和,YAC,用于大片段,DNA,的克隆,细菌人工染色体（,bacterial artificial chromosome,，,BAC,）基于,F,质粒构建而成。,BAC,能容纳高达,400 kb,（一般为,50 kb,250 kb,）的外源,DNA,。,基于大肠杆菌,P1,噬菌体的载体（,E.coli,bacteriophage P1-based vector,PAC,）与,BAC,的克隆容量相当。,酵母人工染色体（,yeast artificial chromosome,，,YAC,）载体能携带更大的,DNA,片段，其由酵母线性质粒（,YLp,）发展而来，含有染色体的两个端粒片段，能复制出线性,DNA,，其克隆容量可高达,3 Mb,（一般为,500 kb,2Mb,）。利用重组线性,DNA,转化细胞，可建成包含人全部基因组,DNA,的巨型,YAC,文库。,BAC,、,PAC,和,YAC,的使用为人类基因组物理图谱和序列测定提供了强有力的工具，大大促进了人类基因组计划的完成。,65,重组DNA技术讲解,（三）启动子探针型载体用于分离和分析基因启动子,启动子探针型载体（即通常所说的报告基因载体）是一种快速分离和鉴定基因启动子的工具型载体,包含两个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元包含质粒克隆载体必备的转化系统（复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞）；检测单元则包括一个已失去转录功能且易于检测的遗传标志基因以及多克隆位点。,例如，,pGL3-basic,就是一个典型的启动子探针型载体，它不含启动子，含有一个荧光素酶（,luciferase,，,luc,）标志基因。如果插入片段中含有启动子序列，则,luc,表达，否则，,luc,不表达，故根据,luc,表达与否和表达水平的高低，即可判断插入片段中启动子序列的有无和活性强弱。,启动子探针型载体,pGL3-basic,图谱,66,重组DNA技术讲解,（四）组织特异性表达载体使外源基因在特定组织表达,把某种组织特异性的调控序列（如启动子）构建于表达载体，使外源基因的表达严格受控于该调控序列，就形成了组织特异性表达载体,该类载体为研究特定组织的发育和针对特定组织或器官的基因治疗提供了有效手段,目前研究较多的有乳腺组织特异性表达载体，它是基因工程药物的生物反应器；肿瘤细胞特异性表达载体能在肿瘤细胞内有效表达毒性蛋白，从而特异性杀伤肿瘤细胞；神经组织特异性表达载体，对治疗早老性痴呆具有积极作用,67,重组DNA技术讲解,（五）双启动子和串联启动子表达载体各有特殊用途,一般的表达载体只有一个启动子，为了特殊需要，可给表达载体组装两个启动子，构成双启动子表达载体，旨在方便地研究不同条件下的基因表达情况或分别启动不同基因的表达。,有时为了提高目的基因的表达水平，可将两个或两个以上的相同启动子串联在一起，构成串联启动子表达载体。,68,重组DNA技术讲解,（六）某些表达载体用于表达非蛋白分子,有些表达载体不用于表达蛋白质，而是用于表达小分子干扰,RNA,（,small interfering RNA,，,siRNA,）或微小,RNA,（,micro RNA,，,miRNA,）等。,例如，目前，用于表达,siRNA,的载体已有多种（如,pSilencer2.1-U6 neo,，,mU6pro,等）。,69,重组DNA技术讲解,四、载体上的常用标志或标签,载体上的标志（,marker,）：通常用于重组子或阳性克隆的筛选、鉴定,常见的标志有：,抗生素抗性基因,a.,用于细菌重组子筛选的抗生素抗性基因,b.,用于哺乳类细胞阳性克隆筛选的抗生素抗性基因,酶的编码基因,营养缺陷选择标志,70,重组DNA技术讲解,标签（,tag,）：其编码序列通常构建于表达载体，与目的基因位于同一阅读框内，这样就可使所表达的蛋白上带上标签肽。,标签肽大小不等，小的只有几个氨基酸残基，大的有几十,kD,。,标签肽常用于表达产物的分离、纯化与鉴定。,常用的,tag,序列包括,His,：,6,8,个组氨酸,FLAG,：八肽序列,Strep,：链亲和素，八肽序列,HA,：血凝素，九肽序列,Myc,：十肽序列,T7,：,11,肽序列,S,：,14,肽序列,HSV,：,11,肽序列,VSV-G,：,11,肽序列,GST,SPA,：葡萄球菌蛋白质,A MBP,：麦芽糖结合蛋白,GFP,：绿荧光蛋白,RFP,：红荧光蛋白,VSV,：,vesicular stomatitis virus,，口蹄疫病毒,71,重组DNA技术讲解,第四节,DNA,克隆的基本过程,Procedure of DNA Cloning,72,重组DNA技术讲解,目的,DNA,的分离获取（分）,载体的选择与准备（择）,目的,DNA,与载体连接（接）,重组,DNA,转入受体细胞（转）,重组体的筛选与鉴定（筛）,DNA,克隆的基本过程,73,重组DNA技术讲解,一、分离获取目的,DNA,有多种方法（分）,DNA,克隆的第一步是分离获取目的,DNA,。,目的,DNA,的来源有多种，包括基因组,DNA,、经,mRNA,反转录的,cDNA,、,PCR,扩增产物、化学合成法获得的,DNA,等。,74,重组DNA技术讲解,二、根据,DNA,克隆的目的选择与准备,适宜载体（择）,进行,DNA,克隆的目的主要有二：获得目的,DNA,片段；获得目的,DNA,片段所编码的蛋白质,针对第一种目的，通常选用克隆载体；针对第二种目的，需选用表达载体,选择载体时，还要考虑目的,DNA,的大小、受体细胞的种类和来源等因素,选择载体时还需注意载体内应有适宜的多克隆位点,75,重组DNA技术讲解,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,载体,插入,DNA,片段,宿主细胞,质粒,5,10 kb,细菌，酵母,噬菌体载体,20 kb,细菌,黏粒,50 kb,细菌,BAC,400 kb,细菌,YAC,3Mb,酵母,76,重组DNA技术讲解,三、目的,DNA,与适宜载体连接形成重组,DNA,（接）,（一）黏端连接为最适连接,1.,单一相同黏端连接会产生载体自连,配伍末端的连接情况与,单一相同黏端连接,相似,77,重组DNA技术讲解,载体和目的,DNA,用,Eco,R I,切割,DNA,连接酶,粘性末端,质粒载体,目的,DNA,重组,DNA,错误连接,错误连接,+,+,单一相同黏端连接产生载体自连,78,重组DNA技术讲解,BamH,I,79,重组DNA技术讲解,单一相同黏端连接存在如下缺点：,容易出现载体自身环化,目的,DNA,双向插入载体（即正向和反向插入）,多拷贝现象,采用碱性磷酸酶预处理线性化载体,DNA,，使之去磷酸化，可有效减少载体自身环化,目的,DNA,如果反向插入载体，虽不影响基因克隆，但却影响外源基因的表达,80,重组DNA技术讲解,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,重组体,2.,定向克隆可有效避免载体自连和,DNA,片段的反向插入,定向克隆：将待克隆,DNA,分子和载体分子采用同一对限制性核酸内切酶切割后连接起来，可实现外源,DNA,片段的定向插入，此即定向克隆,81,重组DNA技术讲解,3.,通过其他措施产生黏端进行连接,人工接头法,同聚物加尾法,PCR,法,T-A,克隆法,82,重组DNA技术讲解,人工接头,(,adaptor,或,linker),连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切割产生粘性末端，而后进行黏端连接。,人工接头（,adaptor,/,linker,）：是借助化学合成,和,(,或,),结合退火的方法,而得到的含有一种或一种以上限制性内切酶切点的平端双链寡核苷酸片段。,5-GGTG,AATT,CACC-3,3-CCAC,TTAA,GTGG-5,83,重组DNA技术讲解,人工接头,(,adaptor/linker,),连接,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,84,重组DNA技术讲解,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列，制造出黏端，再进行黏端连接。,加同聚物尾,5-GGTG,AAAAAAA,CACC-3,3-CCAC,TTTTTTT,GTGG-5,同聚物加尾连接,85,重组DNA技术讲解,同聚