基因工程工具酶培训课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程工具酶,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程工具酶,*,基因工程工具酶,一 概述,核酸酶,定义：,水解磷酸二酯键，使核苷酸链断裂的,蛋白酶,分类：,DNase,：,水解,DNA,的核酸酶,RNase,：,水解,RNA,的核酸酶,外切酶：,从核酸分子末端一个接一个降解核苷酸,内切酶：,从核酸分子内部切割，使核苷酸分子断成,小片段,2,基因工程工具酶,细菌的,R-M,体系：,定义：,限制,-,修饰体系，细菌可识别自身,DNA,和外源,DNA,，降解外源,DNA,对外源,DNA,有抵抗力,原理：,修饰酶从,SAM,（,s-,腺苷甲硫氨酸）上转,移甲基到特定识别位点的特定碱基上，使,DNA,甲基化，保证内源,DNA,不被限制酶降解,生物意义：,保证内源,DNA,不被限制酶降解，快速降解未被甲,基化的外源,DNA,DNA,复制过程中的甲基化：,模板链是甲基化的，使子代,DNA,（半甲基化）不被限制酶降解，甲基化酶再将新合成链甲基,化，使子代,DNA,完全甲基化，防止被内切酶降解,3,基因工程工具酶,二 限制性内切酶（,限制酶,）,命名：,酶来源的微生物,属名：,第一个字母,种名：,前两个字母,株名,：,abcd,该株中该酶编号：,某株微生物中可能编码了,多种内切酶,例：,H,aemophilus,in,fluenzae,的,d,株中发,现的第,种内切酶,-,Hind,4,基因工程工具酶,限制酶识别位点特征：,专一性,大多有,4-8bp,：,主要是,6bp,的，富含,CG,大多为回文序列：,反向重复序列,易切割出粘,性末端片段,切割位点在识别序列内：,识别位点甲基化不,利于切割,AT,CG AT,TA GC,TA,5,基因工程工具酶,限制酶识别序列出现几率及酶切片段估算,假设：,四种碱基出现概率相同（,实际上,CG,出现概率比,AT,大，但无影响,）,一般酶切识别序列,6bp,：,每,4,6,=4096,个核苷酸中酶切位点有一次出现机会,内切酶识别序列出现几率：,1/4096,（,每,4096,个核酸酶中出现一次,）,长,49000bpDNA,中有：,12,个内切酶识别位点,（,49000/4096,）,6,基因工程工具酶,切割方式：,成黏性末端：,切割位点在识别序列中心轴两,侧,3,黏性末端：,3,末端比,5,长,5,黏性末端：,5,末端比,3,长,成平齐末端：,切割位点在识别序列中心轴处,切割位点的标记：,、,/,7,基因工程工具酶,同位酶、同裂酶与同尾酶,同位酶：,同裂酶：,来源不同，但有相同的识别序列，,切割,DNA,后产生相同末端的一组限制,酶,同尾酶：,来源不同，识别序列也不同，但,切,割,DNA,后产生相同末端的一组限制酶,8,基因工程工具酶,酶活影响因素,DNA,纯度：,杂质会降低酶活,DNA,甲基化：,DNA,甲基化后稳定，不易切割,DNA,分子结构：,线性,DNA,易切，超螺旋难切；,CG,多难切,星活性：,酶的特异性改变而呈现的活性,9,基因工程工具酶,缓冲液：,时间与温度：,t=1-1.5h;T=37,O,C,反应体积与甘油浓度：,保存时,50%,甘油防冻,融，反应时,50%,；酶体积在总反应体积,1/10,以内，防酶活被抑制；,反应体积：,20-100ul,酶活单位定义：,10,基因工程工具酶,示例：典型的切反应酶,11,基因工程工具酶,三种限制酶,型：,不适用于基因工程。只在肠道,菌中发现,型：,基因工程的工具酶,型：,切割位点不在识别位点，一般离识别位点,25 bp,27 bp,，对分子克隆操作亦无实用意义,12,基因工程工具酶,三,DNA,连接酶,作用机理：,利用,NAD+,或,ATP,能量，催化多段,DNA3,-OH,与,5,-P,成,3,，,5,-,磷酸二,酯键,步骤：,酶,+AMP+ATP,酶,-AMP+ADP,酶,-AMP-P-DNA,酶,+AMP+DNA-P-DNA,特点：,能量来源：,所有真核生物的,DNA,连接酶都是利,用,ATP,提供能量。细菌的,DNA,连接酶都是依赖,NAD+,的,。,只修复切口，不修复缺口,13,基因工程工具酶,分类,T,4,DNA,连接酶：,可,连接双链,DNA,片段的,平齐末,端,、黏性末端,大肠杆菌,DNA,连接酶：,NAD+,供能，只连接黏性,末端,14,基因工程工具酶,反应条件：,T,：,16,o,C,原因：,温度,37,O,C,最宜，但温度过高会氢键断裂,缓冲液：,Tris-HCl50-100mmol/L,维持,pH,稳定,MgCl,2,：,10mmol/L,，,激活剂,ATP,：,0.5-1,PTT,：,5mmol/L,，巯基试剂，,防被氧化,pH,：,7.5,V,：,10-20uL,t,：,4-16h,酶活单位：,1IU=,最适条件下，,15,o,C,反应,1h,，完全连接,1ugDNA,所需酶量,15,基因工程工具酶,四,DNA,聚合酶（,DNAPol,）,定义：,催化以,DNA,或,RNA,为模板合成,DNA,的,一类酶,特点：,将四种,dNTP,连续加到双链,DNA,的引,物链,3,-OH,末端上，催化核苷酸聚,合，形成新,DNA,链,DNAPol,在,DNA,链,与核苷酸（,dNTP,）之间,16,基因工程工具酶,分类,大肠杆菌,DNAPol,：,三活性：,5,3,聚合，,3,5,外切，,5,3,外切,3,5,外切：,校正,5,3,外切：,切除突变,DNA,、引物,反应条件：,17,基因工程工具酶,应用：,缺口平移制探针、,3,-,粘端的末端标,记,合成,cDNA,的第二链,18,基因工程工具酶,切口移位法标记,DNA,在,DNase,的作用基础上产生链内切口，应用此,酶的,5,3,聚合酶活性和,5,3,外切核酸酶活,性的同步联合反应,，使切口沿,DNA,链从,5,-,端,向,3,-,端移动。若用于聚合反应的原料,dNTP,带,有放射性核素,32P,，就能使生成的双链带有,标记物,19,基因工程工具酶,Klenow,：,定义：,DNAPol,被木瓜蛋白酶水解成的,2/3,大,亚基,酶活：,5,3,聚合，,3,5,外切,应用：,随机引物标记核酸探针,、,5,-,粘端补平,或,3,端标记,、,合成,cDNA,的第二链,、,DNA,序列分析,、,3,-,端的末端标记,21,基因工程工具酶,22,基因工程工具酶,23,基因工程工具酶,24,基因工程工具酶,T4DNAPol,：,定义：,T4,噬菌体中发现的，可标记平齐末端,的,DNA,聚合酶,两活性：,5,3,聚合，,3,5,外切,（对单链,DNA,作用更强）,基因工程中的作用：,平齐末端标记,，,3,末端,隐蔽,25,基因工程工具酶,T7DNAPol,：,特点：,持续合成能力最强,酶活：,5,3,聚合，,3,5,外切,应用：,引物延伸、双脱氧终止法对长,DNA,测序,26,基因工程工具酶,反转录酶：,基础知识：,见分子生物学，以,RNA,为模板，生,成无内含子的,cDNA,分类：,AMV-,逆转录酶,：,Mo-MLV-,逆转录酶,：,应用：,27,基因工程工具酶,TaqDNAPol,：,耐高温：,最适温度,7580,，,95,可维持活,性,40min,用于,PCR,无,3,5,外切校正活性：,PCR,循环次数太多会,导致,DNA,损伤积累,激活剂：,Mg,2+,，低浓度,Mn,2+,中也有活性,抑制剂：,Ca,2+,28,基因工程工具酶,反应条件,Tris-HCl,：,维持,pH7.5,Mg,2+,：,激活剂,EDTA,：,使,DNase,去激活，防止,DNA,被水解,29,基因工程工具酶,五,RNA,聚合酶,30,基因工程工具酶,六 其它,DNA,修饰酶,碱性磷酸酶,：,切去,5,磷酸,31,基因工程工具酶,核酸外切酶：,32,基因工程工具酶,S1,核酸酶：,降解,ssDNA,、,ssRNA,，对,ssDNA,活,性高,作用：,切,ssDNA,成平齐末端,33,基因工程工具酶,DNase/RNase,：,水解,DNA,、,RNA,，要用,EDTA,去激活，防止目的基因被,水解,RNase,分布广：,操作时要带手套，防止引入,RNase,水解了目的,RNA,RNase,分类：,RNaseA,、,T1,、,H,DNase,分类：,、,、,34,基因工程工具酶,T4,多聚核苷酸激酶：,35,基因工程工具酶,末端脱氧核苷酸转移酶：,36,基因工程工具酶,本章总结,37,基因工程工具酶,