植物逆境生理第八章植物热激反应及其信号转导途径.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章植物热激反应及其信号转导途径,第一节植物的热胁迫,第一节植物的热胁迫,一、高温逆境与植物外观形态及生长发育的关系,二、耐热性与细胞膜系统稳定性及植物器官结构、超微结构的关系,三、高温对蛋白质代谢与保护酶系统的影响,四、与植物耐热性相关的其它物质,五、高温对光合、呼吸及蒸腾作用的影响,第一节植物的热胁迫,气候预测表明，温室效应将导致全球性气温上升，整个种植业面临高温挑战，因此有关植物抗热性的研究变得日趋重要。通常情况下，将由高温引起植物伤害的现象称为热害,(heat injury),。植物对高温胁迫的适应则称为抗热性,(heat resistance),。但热害的温度很难定量，因为不同类型植物对高温的忍耐程度有很大差异。根据植物对温度的反应可分为如下几类：,1,）喜冷植物：如某些藻类、细菌和真菌，生长温度在零上低温,(0,20),，当温度在,15,20,以上即受高温伤害；,2,）中生植物：如水生和阴生的高等植物，地衣和苔藓等，生长温度为,10,30,，超过,35,就会受伤；,3,）喜温植物：其中,花粉粒总数。而不耐热基因型较耐热基因型在高温下产生更多的“畸形”花粉粒，“畸形”花粉粒在花药开裂前已萌发，外形小，内含物少，用,TTC,染色已丧失活力。植物的外观形态也可作为鉴定植物耐热性的指标。,二、耐热性与细胞膜系统稳定性及植物器官结构、超微结构的关系,细胞膜系统是热损伤和抗热的中心，细胞膜的热稳定性反映了植物耐热能力。,1977,年,Sullivan,首次将电导法用于测定细胞膜热稳定性，此后该法被普遍应用。目前人们大多将细胞膜热稳定性和高温半致死温度、时间作为植物抗热性的鉴定指标。但也有不同的报道，如,在对大白菜的研究中发现电导率与耐热性的关系并不显著；利用电导法测定黄瓜的耐热性存在滞后性。细胞膜稳定性与膜脂的脂肪酸饱和程度有关，植物体内脂肪酸的高度饱和有利于提高膜的相变温度。高温会加剧膜脂过氧化作用，甚至会损伤植物细胞膜系统，此过程的产物之一是丙二醛,(MDA),，它常被作为膜脂过氧化作用的一个主要指标，但对其能否作为一项耐热性的筛选指标尚未达成一致意见。,通过对高温下植物微观结构变化的观测，可以为耐热育种提供细胞学的理论依据。萝卜耐热品种比感热品种叶表皮气孔密度大，体积小，开度小，部分呈关闭状态，叶片厚，叶肉细胞,排列紧密且很少出现质壁分离现象。耐热品种叶柄内维管束总面积是感热品种的,1.5,倍以上且有发达的形成层和厚壁组织，故其保水能力强。耐热品种叶片和栅栏组织较厚，栅栏组织,/,海绵组织比例及气孔密度较大。尽管甘蓝叶片的蜡粉密度及结构与它对光的反射有关，但对其抗热性无影响，通过扫描电镜观察到耐热品种叶片表面蜡粉晶粒致密，故认为耐热性可能与蜡粉晶粒的结构和数量有关，并进而影响结球能力。在对甘蓝的研究中发现高温下核膜、核仁、核质都会受到不同程度的破坏，特别是核仁逐渐消失，核内聚集很多染色较深的纤维状颗粒，细胞壁周围和叶绿体内也出现了这种,物质，这可能是细胞受高温胁迫的重要标志之一，同时他指出叶片中不同细胞器对高温的敏感程度不同。,高温引起的植物体结构上的变化必然会使植物体的某些功能发生改变，从这些变化中找出与耐热性相关的结构特征，既可以为耐热育种提供理论依据又可以从生物物理学的角度来对植物耐热性进行深层次的探讨。但目前这方面的研究大多仅限于对高温逆境下植株结构变化的观察，而对于这些变化发生的原因及产生的后果均未见报道。,三、高温对蛋白质代谢与保护酶系统的影响,高温胁迫使蛋白质降解，游离氨基酸含量增加，特别是引起脯氨酸大量积累。由于各种胁迫都可引起脯氨酸积累，所以有人认为可将其作为逆境胁迫的一个鉴定指标。高温胁迫引起的膜脂过氧化过程中,O,-,、,H,O,等有毒物质的产生速度与保护酶系统在高温下的活性共同决定着植物的耐热性。热胁迫时过氧化物酶,(POD),活性先下降后升高，且耐热品种无论在高温或是常温条件下,POD,活性均较感热品种高，这可能与,POD,具有很好的热稳定性有关。甘蓝的,POD,在,38,下热激,10 min,仍能保持较高活性，在研究大白菜时发现热激后,POD,活性下降，过氧化氢酶,(CAT),活性提高，超氧化物歧化酶,(SOD),活性先提高后下降。尽管,SOD,可清除,O,2,，减轻膜脂过氧化对细胞内其它部位的伤害，但这种保护作用是有限的；抗坏血酸过氧化物酶,(APX),活性过低造成的,H,O,过量积累，不仅抑制了,SOD,的活性，而且使膜脂过氧化，蛋白质交联，,DNA,降解。植物中的,H,O,主要是由,APX,清除的，而,CAT,的作用不大，其原因可能是,CAT,酶促反应具有较高的,K,m,值而无法使,H,O,浓度降到不足以伤害细胞的阈值以下。,从以上研究可知，高温条件下植物体内生化代谢变化复杂，常因研究者采用的材料、方法不同而得出不同的结果，这一现象还有待于进一步研究。,四、与植物耐热性相关的其它物质,乙烯的产生可以提高植物对热胁迫的抵抗能力。高温胁迫可使辣椒中乙烯含量发生变化，花对乙烯的敏感性以及花内的乙烯含量与抗热性有关，但前者可能对异常落花的影响更大；脱落酸,(ABA),在提高植物的抗性方面作用显著，但蔓生菜豆中高温胁迫与,ABA,并无相关性，同时他发现吲哚乙酸,(IAA),从花芽内的输出量与植物耐热性有关，但,ABA,在高温条件下可使叶温升到抑制蒸腾作用的程度，从而加重高温伤害。水杨酸,(SA),可抑制,CAT,的活性，使,POD,活性提高，促进,SOD,基因的表达。植物可以通过改变,SA,的含量来传递逆境信息，使未遭受逆境的部位获得,抗性。泛肽可以通过产生热激蛋白,(HSPs),对细胞进行保护，但在,40,以上高温条件下的蛋白质代谢过程中泛肽并没有参与。此外，由于多胺与植物逆境胁迫反应关系密切，高等植物也可通过多胺来调节一系列生理反应，以适应热胁迫，但这方面研究较少。激素等植物内源次生化合物在蔬菜作物抵御逆境胁迫中具有十分重要的作用，但由于其含量甚微，目前仍有许多问题尚待研究和探讨，尤其对其发生作用的分子机理应加以深入研究。,五、高温对光合、呼吸及蒸腾作用的影响,高温会损伤叶绿体、线粒体的结构，使光合色素降解，抑制光合作用，促进呼吸作用。高温下气孔导度、气孔限制值、表观量子效率及羧化效率均下降，细胞间隙,CO,浓度上升。由此可知，叶片光合机构遭破坏的非气孔因素是净光合速率降低的主要原因，而且，高温处理初期净光合率下降以气孔限制因素为主，随着时间的延长，则以非气孔限制为主。气孔开放被抑制可能是矿质元素间的拮抗作用所致。热激导致的净光合率下降的原因可能是光合磷酸化受阻，尽管,RuBP,羧化酶本身是热稳定的，但随光合磷酸化下降它对光能的活性也下降。,同时，他认为光合器官的热稳定性与类囊体膜超微结构有关，甘蓝热敏品种在,38,39,高温胁迫下叶绿体膜断裂、解体，类囊体片层松散、排列紊乱、基质片层模糊不清，说明热胁迫下微观结构的稳定性同抗热性是密切相关的。番茄、茄子、马铃薯等在高温胁迫下光合系统,I(PSI),发生不可逆性抑制，而光合系统,II(PSII),对热胁迫有较强的抵抗力。高温胁迫对,PS,中心除了瞬时钝化作用外，还存在间接的、较为缓慢的钝化作用。其原因可能是高温胁迫激活了类囊体膜上的脂肪酶，使富含不饱和脂肪酸的类囊体膜脂降解，形成自由的不饱和脂肪酸，从而钝化反应中心。,高温对光合、呼吸、蒸腾作用的影响目前已经基本清楚，且三者间存在着相互作用，但对于其作用机理仍存在争议，因为各种生理过程均涉及到复杂的生化变化，并与细胞及各种细胞器的物理结构的变化有关。,从上述可以看出，高温对植物造成的伤害是多方面的，但最主要的是对胞内酶的破坏，造成细胞正常的代谢受阻，导致生长发育中止或者引起细胞死亡。但是植物体对高温胁迫的响应并不是完全被动的，会发生相应的适应反应来降低胁迫造成的伤害，以维持基本的生理代谢；甚至通过开启某些基因的表达对高温产生抗性。这一过程中最显著的生理变化是：,正常的蛋白合成受到抑制，细胞转向合成热激蛋白。大量的研究工作业已证实主要的热激蛋白都具有“分子监护蛋白”,(molecular chaperone,，,CPN),的功能，这从一个侧面解释了为什么热激蛋白的合成可以赋予生物体耐高温的能力，从另一角度讲，大部分监护蛋白具有热激诱导特征。因此热激蛋白和监护蛋白是从不同角度对同一类蛋白的描述。,Ritossa,于,1962,年首先在果蝇中发现这种现象，十几年后,Tissieres,发现热激蛋白。现已证明，从细菌到人，所有生物都可对热激产生反应，而且除温度外，其它许多因子例如氨基酸类似物、高盐浓度、厌氧、水分胁迫、低温、,重金属离子、亚砷酸盐、乙醇、营养饥饿、,2,4-D,、,ABA,等都可以诱导热激反应，合成的,HSPs,参与生物的许多代谢过程。目前对,HSPs,的功能、结构、基因表达的调控等都进行了许多研究，积累了大量的资料。,第八章植物热激反应及其信号转导途径,第一节植物的热胁迫,第二节 植物的热激蛋白家族,第二节 植物的热激蛋白家族,一、,HSPs的分类和定位,二、热激反应的特点,三、热激蛋白的功能,第二节 植物的热激蛋白家族,在高于正常生长温度,5,以上时，生物体大部分正常蛋白质的合成和,mRNA,的转录被抑制，同时迅速合成一些新的蛋白质称之为热激蛋白,(heat shock proteins,，,HSPs),，这种现象叫做热激反应,(heat shock response,，,HSR),。,一、,HSPs,的分类和定位,按照,SDS,电泳的表观分子量大小可以把植物,HSPs,分为五大类：,HSP 110,，,HSP 90,，,HSP 70,，,HSP 60,以及小分子量热激蛋白,smHSPs,。,HSP 60,以上的又统称,HMW HSPs(high molecular weight HSPs),或,laHSPs(large HSPs),。,smHSPs,包括细胞质,类,smHSPs,、细胞质,类,smHSPs,、叶绿体,smHSPs,、线粒体,smHSPs,和内膜,smHSPs,等。除热激外，正常生活的细胞中也有,HSPs,，这类,HSPs,是组成型表达的，称为,HSC(heat shock cognate protein),。,HSC,和诱导型,HSP,在结构和功能上都很难区分，统称,HSP,。,Ubi(Ubiquitin,，遍在蛋白,),是一种依赖,ATP,促进细胞蛋白质水解的小分子量热激蛋白。,PDI(protein disulphide 2 isomerase,，蛋白质二硫键异构酶,),也被认为是一种热激蛋白。每一类,HSPs,在结构上都具有不同程度的保守性，它们,在生物体正常的生理代谢或胁迫响应中担负不同的功能。一种植物体一般含有几类,HSPs,，但在胁迫条件下可能只有一种,HSPs,起主导作用。目前发现热激蛋白定位于细胞的多种细胞器，包括细胞质、叶绿体、线粒体和内膜系统。,二、热激反应的特点,（一）,HSPs,的保守性,HSP,是目前发现的最保守的蛋白质之一。首先，亲缘关系很远的原核生物和真核生物，他们的,HSP,有很高的同源性，例如真核生物,HSP 70s,和大肠杆菌的,HSP 70,即,DnaK,蛋白的同源性大于,65%,。其次，不同物种相同细胞器如细胞质,HSP 70,之间的同源性比同一物种不同细胞器,的,HSP 70,之间的同源性高，玉米、矮牵牛、拟南芥、大豆、豌豆、绿藻等细胞质,HSP 70,氨基酸的同源性达,75.0%,，但如和番茄,HSP 70(,定位于内质网,),一起比较，则同源性只有,54.9%,。同样，豌豆、大豆、拟南芥、小麦,4,种细胞质,I,类,smHSPs,氨基酸之间的同源性也较高，为,68.2%,85.1%,。这似乎反应了不同细胞器,HSP 70,之间很早的分歧,(divergence),。第三，同种植物不同类型的,HSPs,的同源性较低，例如豌豆,HSP 18.1,、,HSP 17.7,、,HSP 22.7,和,HSP 21,分别属于不同类型，它们之间的同源性低于,50%,。,HSPs,的高度保守性说明他们在生物生命活动中具有重要的作用。,（二）热激反应的短时性,Northern,杂交分析表明，热激时,3,5 min,就可检测到大豆幼苗,HSP mRNAs,的积累，,1,2 h,达到高峰，,6 h,后显著下降，,12 h,就检测不出了。放射性标记显示，氨基酸渗入,HSPs,在,4 h,达到高峰，随后下降。但,28,和,40,加入,Aze(,三甲叉亚胺甲酸，氨基酸类似物,)12 h,后,HSPs,合成仍不变，似乎,Aze,和高温诱导,HSP,合成的机理不同。植物,HSP 110,比其它,HSPs,合成的时间更短，主要在热激的第一小时合成。,（三）热激蛋白的多样性,HSPs,的种类很多，分子量从,15 kD,110 kD,或更高，定位于多种细胞器。如前所述，通常根据分子量的大小分为,laHSPs,和,smHSPs,两类。,laHSPs,在动物中较多，而植物中较少，大多数植物常见的,laHSPs,为,68,、,70,、,83,、,92 kD,等。此外，分子量更大的如番茄的,HSP 95,、大麦的,HSP 99,、小麦的,HSP 103,、棉花的,HSP 100,、烟草的,HSP 100,和,120,、以及大豆的,HSP 110,等。植物热激蛋白的显著特点是,smHSPs,相当多，如大豆有,27,种分子量在,15,25 kD,之间的,smHSPs,，其中,6,种是增加合成，,21,种是诱导合成。已研究过的植物大多,smHSPs,都在,20,种左右。,三、热激蛋白的功能,（一）热激蛋白具有分子伴侣作用,分子伴侣,(molecular chaperones),是指与新生肽链的折叠，寡聚蛋白质的组装和蛋白质的跨膜运输有关的一类特殊蛋白质分子。,HSP 60,最早被称为分子伴侣，目前已经证明,HSP 90,、,HSP 70,、,smHSPs,都具有分子伴侣作用。哺乳动物,HSP 90,具有改变或保持蛋白质构象的作用，主要在于使甾类激素受体保持一种特殊的构象，以便接受合适的受体信号。所有,HSP 70,都和,ATP,结合，可以用,ATP,亲和层析分离，具有微弱的,ATP,酶活性。,HSP 70,最保守的区域在,N,末端,(1,305 AA),，也是和,ATP,结合的部位。推测,HSP 70,在依赖,ATP,的蛋白质的折叠和装配中起作用。酵母和,HSP 70,即,SSA,蛋白可以促进跨内质网和线粒体膜运输。体外装配的内质网和线粒体蛋白运输系统加入,HSP 70,或,HSC 70,则运输能力增强，其原因是,HSP 70,使新生蛋白质处于非折叠状态或保持适合运输的形式。,HSC 70,和新生肽结合，促进许多蛋白质的正确折叠。热激诱导的,HSP 70,的量比细胞中原有的少得多。热激时,HSP 70,和热变性蛋白结合，当热激恢复时，通过水解,ATP,促使蛋白质的折叠和组装，从而恢复活性。所有高等真核生物高温胁迫时产生的,HSP 70,主要定位于核仁，恢复时再从新分布于细胞质中。,线粒体,HSP 60,主要参与核编码的运输入线粒体的蛋白质的加工、定位和装配。研究表明,HSP 60,影响线粒体膜上,F12-ATP,酶复合体的装配和线粒体蛋白,Fieske Fe/S,和,cyto b2,的正确加工和定位。在酵母中进一步研究了,HSP 60,和新运进的线粒体未装配的蛋白质的相互作用模式：首先未折叠的蛋白质和高分子量的,HSP 60,连接，蛋白质的折叠在复合体的表面进行并需要,ATP,，然后在另外线粒体蛋白组分,(,很可能是,Gro ES,同源物,),参与下并水解,ATP,把折叠的蛋白质释放出来。叶绿体,HSP 60,同源物最初称为,Rubisco,连接蛋白，由核基因编码，在非热激条件下含量很高，目前尚未有热激诱导其表达的报道。,豌豆离体,HSP 60,由分子量约,61 kD,和,60 kD,的两种亚基组成,720 kD,的复合体，主要参与,Rubisco,全酶的装配。植物,Rubisco,全酶由,2,类,16,个亚基组成：,8,个由叶绿体基因编码的大亚基和,8,个由核基因编码的小亚基，新合成的大亚基首先和,HSP 60,结合才能装配成全酶。应用突变体研究证明,GroEL,参与细胞蛋白质的折叠和装配。酵母,HSP 60,基因位点缺失,(defective locus),条件致死突变体的线粒体蛋白不能正确装配。,在热激和热激恢复时，,15,18 kD,的,HSPs,在细胞质和细胞器之间穿梭,(shuttle),，起着分子伴侣的作用，具有保护细胞不受高温伤害，修补被损伤的蛋白质的作用。,（二）热激蛋白与生物的耐热性,许多研究表明,smHSPs,的表达和耐热性有关。热激条件下，大豆中,I,类,smHSPs,的含量可达到总细胞蛋白的,1%,以上，并且和耐热性的获得一致。用生物工程技术使拟南芥的热激转录因子表达，并诱导细胞质,I,类,smHSPs,组成型表达，同时耐热力提高。热激时，大豆、酵母、番茄及其它植物形成热激颗粒,(heat shock granules,，,HSGs),。热激下大豆细胞形成高度有序的结构复合体，至少由,15,种,15,18 kD,的,I,类,smHSPs,组成。尽管水稻、豌豆、绿豆合成的,smHSPs,的数量不同，,pI,和分子量不一样，但都形成大小相近的,270,310 kD,的复合体。这种复合体有高度的热稳定性、不受高盐浓度和去垢剂的影响，和耐热性有密切关系。,HSPs,的抗热性和细胞内的可溶性蛋白质的稳定有关。大豆、绿豆和水稻细胞内富含,smHSPs,的组分具有维持蛋白质热稳定的作用，而且不同种类的植物含,HSPs,组分的这种热稳定作用可以互相替代。从大豆富含,HSPs,的组分中除去,15,18 kD,的,HSPs,，则热稳定性丧失，加入纯化的,280 kD,的,I,类,smHSPs,复合体，这种保护作用又恢复。,HSPs,是热激时形成约,40 nm,的大颗粒结构的前体颗粒的组成部分，这些颗粒由,5,10%HSP 70,和,50,80%,的,smHSPs,组成。大豆幼苗的,HSGs,密度约,1.20,1.21 g/cm3,。高温热激时,形成,HSGs,颗粒，在非热激条件下,(28,时,),，亚砷酸盐或氨基酸类似物诱导,HSPs,合成的同时，也形成,I,类,smHSPs,复合物。当热激恢复时，细胞质中的,HSGs(,含有变性或凝聚蛋白，热激时形成,),解聚成,280 kD,的,I,类,smHSPs,复合物，这种凝集与解聚和酵母,HSP 104,的情况相似，使热失活蛋白从不溶性凝聚体中恢复活性。含有,HSPs,的离体线粒体在热激时可进行氧化磷酸化，定位于内膜、线粒体的,smHSPs,有保护其免受热伤害的作用。变性,/,凝聚蛋白周围常有线粒体，表明凝聚蛋白的解聚可能受线粒体提供的能量调节，同时,HSP,的从新定位也需要能量。值得注意的是离体,I,类,smHSPs,的分子伴侣活性不依赖能量。酵母,HSP 90s,包括,HSP 82,和,HSC 82,，如两种基因都突变则是致死的，任意一种发生突变在高温时生长受到破坏，表明,HSC,在热激时也有保护作用。酵母,HSP 104,缺失突变体不能形成耐热性，其实,HSP,在耐热性方面的作用的遗传学证据首先来自酵母,HSP 104,。,(,三,),热激蛋白在植物种子发育中的作用,HSPs,在种子发育中的作用日益受到重视。发育小麦种子中分离的,HSC 70,是,BiP,同源物。,BiP,在所有植物中含量丰富，受热激诱导不明显，主要受营养,(,葡萄糖饥饿,),调节，和内质网上的束缚核糖体合成蛋白质有密切关系，可能参与种子贮藏蛋白的合成。碗豆种子在发育过程中，,I,类和,II,类,smHSPs,受发育调控，干种子中也检测到,HSP 17.4,和,HSP 17.6,，在小麦胚中也发现有发育依赖的,HSPs,，它们可能与种子耐脱水性、胚发育、休眠、萌发、耐热性、寿命形成及维持都有密切关系。,（四）热激蛋白在植物减数分裂中的作用,和雌性组织不同，成熟花粉没有热激反应。玉米受精时对热敏感，高温时导致减产，部分原因可能是成熟花粉不能合成,HSPs,。但也有一些研究表明玉米花粉萌发对高温敏感存在遗传差异。,Frova,等,(1989),证明在花粉萌发过程中，合成,HSP,的能力是逐渐丧失的，单核花粉粒热激反应最强。,Gagliardi,等,(1995),研究显示,HSP,合,成能力逐渐丧失是由于没有,HSPs mRNA,的积累。所以，玉米花粉的热敏感性可能是从单核到双核花粉粒的转变开始，合成,HSPs,的能力逐渐下降，花粉成熟时完全丧失。从单核到双核花粉粒的转变是花粉发育的一个重要阶段，其特征是“早期”花粉基因表达关闭，“晚期”花粉基因开始表达,(Magnard,等，,1996),，因此,HSP,合成能力的变化尤为值得注意。,人们在研究众多植物的,HSPs,时，发现雄性不育植株的热激反应更有其特殊的表现。雄性不育株对温度有剧烈的反应，热激,(40),可诱导雄性不育态在当代就转变为雄性可育态。对其,HSPs,的电泳分析表明，逐渐升温到,46,49,温度区间，高粱,(3197A),雄性不育株幼穗的蛋白质电泳图谱中，出现特异性,HSP 80,，可育的保持系高粱,(3197B),没有。表明此蛋白质与雄性不育有关。高粱不育系花粉母细胞线粒体中缺少,HSP70,，当温度升高,(40,45),后，线粒体中出现了,HSP 70,，线粒体数目增加了,8,倍,(,与可育系相近,),，保证了花粉发育的能量供应，不育系由不育变成了可育，这说明高粱不育系线粒体中缺少,HSP 70,很可能是造成雄性不育的原因。热激处理能使水稻珍汕,97A,不育系与其珍汕,97B,保持系花药,Pox,和,Est,的表达发生改变，导致不育系和保持系这两种同工酶组成上的原有差异缩小。蛋白质,SDS-PAGE,图谱表明，热激,(30),处理的温敏不育水稻二九青,S,花药蛋白质组分，比原种二九青少了,3,条区带；安农,S21,水稻比,25,处理者少了,1,条区带。可以认为，温敏雄性核不育水稻二九青,S,和安农,S21,的花粉败育，可能与这些,HSPs,组分不能转译有关。热激,(38),处理的温敏雄性核不育水稻培矮,64S,花药中的,Pox,同工酶和,Est,同工酶比常规稻湘晚籼二号各增加了,1,条热激酶带，其花药中可溶性蛋白质组分比常规稻湘晚籼二号少了,3,条蛋白质区带。由此看来，植物雄性不育的育性转变现象，以及不育系对热激的反应，可能存在某种特殊的联系。其机理还有待于从发育生理和分子生物学方面作更深入的研究。,（五）热激蛋白与植物的抗冷性,冷胁迫可以诱导植物,HSC 70 mRNA,和特异蛋白质合成，但也有耐冷性和非耐冷性植物都有,HSP 70,的积累的报道。高温热激和化学物质处理可增强冷敏感植物和组织的耐冷性已有不少报道。,HSP,和耐冷性具有直接关系。热激,(40,，,3 h),诱导绿豆下胚轴,HSP 70,和,HSP 79,从头合成，减轻随后的冷胁迫,(2.5),对膜的损丧，使溶质渗漏减少，增强了组织的抗冷性。在,2.5,下,6,9 d,，热激诱导的耐冷性消失，同时,HSP 70,和,HSP 79,也降至对照,(20),水平。,如绿熟,(mature green),的番茄在,36,、,38,或,40,的培养箱中放置,3 d,后，在,2,下贮藏,21 d,未发生冷害，但未经热处理的果实却表现出的,严重冷害症状。,38,热处理,3 d,不但减轻了冷害，并且从低温放回常温后果实仍能正常转红成熟，而对照果实冷害严重，不能正常成熟。用,39,45,的热水处理绿熟番茄,1 h,也能有效减轻冷害。再如油梨在,37,38,下处理,17,18 h,显著增强了抗冷性。在,38,下处理,3,、,6,、,12 h,以及,40,处理,0.5 h,后，可明显减轻油梨在,2,贮藏期间的冷害；而且具有延迟成熟，延长贮后货架寿命的效果。还在许多其它采后果蔬上观察到类似效果，如热水处理柑橘，热空气或热水处理芒果，热空气或热水处理黄瓜，热空气处理甜椒，热空气处理柿子等均可有效地减轻冷害的发生。研究表明，热激处理对植物,组织的影响是多方面的。在生理上，热处理减少乙烯释放量，这与热处理降低,1-,胺基环丙烷,-1-,羧酸,(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,，,ACC),氧化酶基因的表达水平并抑制,ACC,合成酶和,ACC,氧化酶活性有关。热处理期间，果实内源乙烯释放量减少的同时，对外源乙烯的敏感性也降低。这表明高温使乙烯受体失活，从而阻碍了乙烯的信号转导。热处理还减少离子渗漏，这与其对膜脂成分的影响有关。苹果经,38,处理,4 d,再在,0,贮藏,4,个月后，质膜的磷脂含量和脂肪酸不饱和程度高于未经热处理的果实。此外，热处理还减慢果实软化和果胶可溶化的速度，因为热处理影响多聚半乳糖,醛酸酶,(PG,酶,),和半乳糖苷酶的活性。另外，热处理还引起膜系统超微结构的变化，包括核仁，线粒体，核糖体，以及细胞核和内质网。热处理减轻植物冷害的效应可能与上述的某些生理反应或超微结构的变化有关。但是，进一步的研究表明，这些反应和变化与热激过程中新蛋白的合成有关。比如，,40,处理可降低离体绿豆下胚轴的溶质渗漏，增强其抗冷性；但热激处理时加入,50 mmol/L,的亚胺环己酮,(cycloheximide,，,CHX),可抵消热处理的效应。这说明，热激处理降低膜透性，提高组织抗冷性，与热激诱导蛋白质合成有关。因此，深入了解,HSP,及其与抗冷性的关系，是全面理解植物抗冷机理的一个重要方面。,第八章植物热激反应及其信号转导途径,第一节植物的热胁迫,第二节 植物的热激蛋白家族,第三节 热激反应的信号转导,第三节 热激反应的信号转导,一、热激信号转导途径上游的,Ca2+-CaM信号系统,二、信号转导途径下游的热激基因表达,第三节 热激反应的信号转导,热刺激能诱导机体产生热激响应。在热激基因,(,编码热激蛋白的基因，,heat shock gene,，,HS gene),表达之前许多信号转导组分已经发生了改变。已有一些直接或间接的证据表明,Ca,2+,及,CaM,参与了植物,HSR,的信号转导。真核生物中热激基因的表达被热激转录因子,(heat shock transcriptionfactor,，,HSF),所介导。热胁迫时，,HSF,被激活并结合到热激元件,(heat shock element,，,HSE),上。本文主要介绍与植物热激信号转导途径,(,包括基因调控过程,),中上游的,Ca,2+,CaM,信号系统及下游的热激基因表达调控。,一、热激信号转导途径上游的,Ca2+-CaM,信号系统,Ca,2+,是植物细胞中被证实的胞内信使之一，,Ca,2+,CaM,信号系统调控胞内许多生理过程。目前已知许多种胁迫刺激都可引起,Ca,2+,和,CaM,水平的升高。近些年来，,Ca,2+,-CaM,信号系统在热激信号转导中的作用也越来越多地受到人们的重视。尽管热激后完整的上游信号转导途径目前还不清楚，但已有一些直接或间接的证据表明,Ca,2+,和,CaM,可能是热激信号转导途径中的主要上游组分。,（一）热激时胞内,Ca,2+,、,CaM,浓度及,CaM,基因表达的变化,在果蝇、中国仓鼠、,HeLa(,子宫颈癌组织细胞株,),等细胞中，热激诱导胞质,Ca,2+,浓度升高。随后，植物方面的研究也证明了这一点。例如热激时悬浮培养的梨细胞或原生质体对,Ca,2+,的吸收大大增加；用荧光染料方法测定到热激能使豌豆叶原生质体胞质,Ca,2+,浓度增加,4,倍；热激时胞质中,Ca,2+,水平迅速而短暂地升高。用质膜钙通道阻断剂,LaCl,3,和内质网钙通道阻断剂新霉素处理均可明显抑制热激后胞质,Ca,2+,浓度的升高，表明热激既动员质外体中的钙向胞质中流动又可动员胞内钙库内质网中的钙向胞质中流动。叶绿体中的,Ca,2+,浓度在热激时没有明显的变化。单一的热刺激可引起一个不应期，在不应期内，另加一次热刺激不能引起胞质,Ca,2+,水平的升高。,然而在这段不应期内，烟草植株对机械刺激和冷刺激仍然能够做出,Ca,2+,浓度升高的响应。这种现象可能说明由热激引起的,Ca,2+,流动是专一的，或者表明不应期是由于在热刺激的感受或信号转导方面存在暂时的障碍。,热激在使植物胞质,Ca,2+,浓度升高的同时，也使细胞中,CaM,浓度升高。例如，对玉米所做的实验表明，热激时,CaM,水平增加，并且这种增加是依赖,Ca,2+,的。对小麦悬浮细胞或幼苗以,34,热激处理可引起,CaM,的积累，而,Ca,2+,螯合剂,EGTA,对,CaM,的积累具有抑制作用。热激也可诱导,TCH,基因,(,编码,CaM,同源蛋白,),的表达。我们进一步以小麦,CaM 122,基因为探针，通过,Northern,杂交方法,表明，小麦幼苗经,37,热激,10 min,，,CaM mRNA,的表达已明显高于基础表达，,20 min,达到最高值，,30 min,后开始下降，最终回到基础水平。这一工作进一步说明，热激时,CaM,活性的增加可能不仅是因为,Ca,2+,激活,CaM,，而且还由于促进,CaM,基因的表达。,（二）,Ca,2+,及,CaM,对热激基因表达的影响,在动物中，,Ca,2+,能激活,HSF,与,DNA,的结合能力，并可促进热激基因的转录和蛋白质的合成。植物方面,Ca,2+,对热激基因表达影响的报告很少，仅,Trofimova,等在甜菜上观察到，,CaCl,2,和钙载体,A23187,预处理可促进,HSP,的合成，而,EGTA,则抑制,HSP,的合成，即在蛋白合成水平上表明了,Ca,2+,的影响。在转录水平上研究，观察到,CaCl,2,和,A23187,可促进,Hsp 26,及,Hsp 70,的,mRNA,合成；相反，用,EGTA,、质膜,Ca,2+,通道阻断剂,LaCl,3,和异博定处理则抑制小麦,Hsp 26,及,Hsp 70,的,mRNA,合成。,此外，以番茄为材料的研究还表明,Ca,2+,可提高,HSF,与,DNA,的结合能力。初步表明，,Ca,2+,可能在,HSF,激活、热激基因转录和,HSP,合成这三种不同水平上参与植物热激基因表达的调节。,Ca,2+,是否通过,CaM,进一步调节热激基因表达此前在动植物中均未见报告。本实验室用,CaM,的拮抗剂,CPZ,、,TFP,预处理小麦种子和幼苗后，观察到,34,热激时,HSP,的合成明显减少；进而发现,CPZ,和另一种,CaM,的拮抗剂,W7,也可降低,37,热激,时,hsp,26,、,hsp,70,基因的转录水平；,CaM,还可提高,HSF,与,DNA,的结合能力。,小麦幼苗在经热激,10 min,后,CaM,基因表达已明显高于基础表达，而热激,20 min,后,hsp,26,基因才开始有少量表达，表明热诱导的,CaM,基因的转录先于,hsp,26,基因的转录；但是如果只热激,5 min,，然后给予一定的恢复时间，则,hsp,26,基因也可以表达，说明,hsp,26,基因转录其实并不需要持续,20 min,的热刺激，较短时间,(5 min),的热刺激即能启动胞内某一关键因子，随后引起一系列生理生化反应,(,在恢复时间内完成,),，到,20 min,时才导致基因的转录。以小麦叶鞘表皮为材料，利用钙离子荧光指示剂,fluo23,AM,染色，通过激光共聚焦显微技术，观察到热激处理过程中胞质,Ca,2+,浓度快速升高，,1.5 min,时,Ca,2+,浓度开始上升，,4 min,时已达到最高值。在,22,下用,CaCl,2,和,A23187,处理小麦幼芽，看到可增加,CaM,基因的转录水平，表明,Ca,2+,不仅可激活,CaM,，而且还可促进,CaM,基因的表达。因此我们认为,Ca,2+,可能是短暂热激启动的胞内关键因子，热激后胞质,Ca,2+,浓度升高既激活已有的,CaM,，也引起,CaM,基因表达量的提高，形成更多的,CaM,，从而激活热激基因的转录。,（三）,CaM,与,HSP,结合,90,年代以来，动物方面不断有,CaM,与,HSP,结合的报告。,Evans,等,(1990),首先发现在,Ca,2+,存在时，,Hsp 90,、,Hsp 70,、,Hsp 68,、,Hsp 32,、,Hsp 26,等与,CaM,-,琼脂糖柱结合，而已结合的,HSP,可被含,W7,的缓冲液洗脱下来，说明,CaM,能与一些,HSP,结合，这些结合是依赖,Ca,2+,的。,Stevenson,和,Calderwood(1990),证明大鼠细胞,Hsc 70,能与,CaM,结合，并发现,Hsc 70,内有一段,21,个氨基酸组成的,CaM,结合序列。植物方面，关于,CaM,能与,HSP,结合的研究至今仅有两例报告。,Lu,等,(1995),报告，从热激后悬浮培养的烟草细胞,cDNA,表达文库中筛选到一个编码与,CaM,结合的,HSP,的,cDNA,，该,cDNA,编码分子量为,50 kD,的蛋白，用凝胶覆盖技术证明这个蛋白可与,35 S,标记的,CaM,结合。以玉米为材料的研究表明，热激蛋白家族中最重要的成员之一，纯化的细胞质,Hsc 70,能与,CaM,结合，并且玉米,Hsc 70,中也有一个非常保守的,21,个氨基酸组成的,CaM,结合序列,(,序列同源性达,86%),。这种高度的保守性意味着这一,CaM,结合序列可能在完整的,Hsc70,中具有重要的功能，从而首次在植物中证实,Hsc 70,是,CaM,的靶蛋白，为进一步研究,CaM,调节热激基因表达的方式和途径提供了重要的线索。,（四）,Ca,2+,和,CaM,在植物耐热性获得中的作用,在玉米和转基因烟草中以幼苗生活力,(TTC,法,),以及细胞膜稳定性作为耐热性研究的,2,个指标所做的研究中观察到，,CaCl,2,预处理明显增加幼苗的耐热性，而,MgCl,2,处理无此作用。相反，,EGTA,、,LaCl,3,或异博定处理均妨碍了热诱导的,耐热性的获得。,W7,预处理玉米幼苗明显妨碍了热诱导的耐热性的获得。热激通过诱导热激蛋白的合成使生物获得耐热性，,Ca,2+,-CaM,信号系统与热激诱导的耐热性获得的关系表明,Ca,2+,-CaM,信号系统可促进热激蛋白的表达。总之，多方面的研究表明，,Ca,2+,-CaM,介导的信号转导途径参与热激反应的调控。,IP3/DG,、,cAMP,和,pH,与热激反应的关系问题在动物和微生物方面有一些研究，但植物方面还未见报告。,Stevenson,等,(1986),用中国仓鼠实验观察到，,45,热激可诱导,IP3,水平迅速而明显的升高，随后紧跟着一个持续时间较长的胞外,Ca,2+,内流，同时发现,Ca,2+,内流与膜上磷脂酸,(PA),的积累呈正相关，由此提出了一个热激引起胞内游离,Ca,2+,水平升高的,一个可能的机制：热信号首先刺激膜上的受体改变构象，受体与,G,蛋白结合并激活,G,蛋白，后者激活磷脂酶，在磷脂酶作用下，,PIP2,分解为,IP3,和,DG,。,IP3,刺激胞内钙库释放,Ca,2+,，而,DG,转化成,PA,，后者活化膜上的,Ca,2+,通道，使胞外,Ca,2+,进入胞内。,二、信号转导途径下游的热激基因表达,在细胞内有一种转录调节因子在热激条件下可激活热激基因的表达，被称为热激转录因子,(HSF),。在热激基因中，启动子中有一小段特异的,DNA,序列，是,HSF,的结合位点，称为热激元件,(HSE),，,HSF,与,HSE,结合激活热激基因的表达。热激基因表达的调节包括选择性转录和选择性翻译，以前者为主。,（一）热激基因启动子,植物与其它真核生物