鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验.ppt

AMESAMES试验试验+Ames试验，即污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验+污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。B.N.Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。原理：检测受试物诱发原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株缺陷型突变株(his(his-)回复突变成野生型回复突变成野生型(his(his+)的能力。的能力。即组氨酸突变菌即组氨酸突变菌(his(his-)在不含组氨酸的最低营养平在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长；回复突变成野生型皿上不能生长；回复突变成野生型(his(his+)，可在不含，可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长。组氨酸的最低营养平皿上生长。是应用最广泛的检测是应用最广泛的检测基因突变基因突变的体外试验。的体外试验。Ames试验试验u标准试验菌株标准试验菌株(配套菌株配套菌株)：有四种：有四种 TA98、TA97：检测移码突变：检测移码突变 TA100：检测碱基置换突变：检测碱基置换突变 TA102：对醛、过氧化物及：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感交联剂较敏感 u这四个试验菌株除了含有这四个试验菌株除了含有hishis-突变，还有一些附加突突变，还有一些附加突变，以提高敏感性变，以提高敏感性 Ames试验试验不加不加S9 混合液得到阳性结果，说明受试物是混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物直接致突变物 加加S9 混合液才得到阳性结果，说明该受试物混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物是间接致突变物 Ames试验试验 AMESAMES试验试验常规方法：斑点试验 平板掺入试验 AMESAMES试验试验斑点试验：+1、吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml0.4mlS9混合液，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。+2、用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。+3、平皿倒置于37温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。AMESAMES试验试验平板掺入试验：1、将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml0.4ml S9混合液，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。2、同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4个5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。3、同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。MR值2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌野生型（野生型（his）鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌 突变型（突变型（his）正向突变正向突变回复突变回复突变受试物受试物试验菌种试验菌种(his(his-)S S9 9试验菌种试验菌种(his(his-)S S9 9Ames试验原理试验原理 结果判断结果判断:只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物受试物是致突变物 仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物受试物是非致突变物 Ames试验试验 AMESAMES试验试验应用1斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适宜用此法。此法敏感性较差，主要是一种定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。2平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点试验敏感，获阳性结果所需的剂量较低。点试获阳性结果的浓度用于掺入试验（每皿0.1ml），往往出现抑（杀）菌作用。3致变作用迟缓或有抑菌作用的试样，培养时间延长至72h。AMESAMES试验试验+应用+4挥发性的液体和气体试样，可用干燥器内试验法进行测试。+5目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛。但是，与今天快信息、高效率的社会要求相比，该试验程序还嫌繁琐，方法不够简便，有待于创建新的更为快速灵敏、简单易行的环境诱变剂短期生物测试法。