第四章蛋白质的翻译.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本章讲授内容：4.1 遗传密码-三联子 4.2,tRNA,的结构、功能及种类 4.3 核糖体的结构及功能 4.4 蛋白质合成的生物学机制 4.5 蛋白质的运转机制,基因的表达过程：,蛋白质的生物合成是一个比,DNA,复制和转录更为复杂的过程,基本概念,翻译,是指将,mRNA,链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,核糖体,是蛋白质合成的场所，,mRNA,是蛋白质合成的模板，,tRNA,是模板与氨基酸之间的接合体。,此外，在合成的各个阶段还有许多,蛋白质,、,酶,和,其他生物大分子,参与。,4.1.1 三联子密码及其破译,遗传密码的破译,确定代表每种氨基酸的具体遗传密码。蛋白质,的氨基酸序列是由,mRNA,的核苷酸序列决定的，所以，要知道它们,之间的关系就要弄清核苷酸和氨基酸数目的对应关系。,1954年科学家对破译密码首先提出了设想：,A.,若一种碱基对应与一种氨基酸，那么只可能产生4种氨基酸;,B.,若2个碱基编码一种氨基酸的话，4种碱基共有4,2,=16种不同的排列组合;,C.3,个碱基编码一种氨基酸，经排列组合可产生4,3,=64种不同形式,;,D.,若是四联密码，就会产生4,4,=256种排列组合。,1.以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板,指导多肽的合成,制备大肠杆菌的无细胞合成体系,:,在含,DNA、mRNA、tRNA、,核糖体、,AA-tRNA,合成酶及其他酶类的抽提物中加入,DNase，,降解体系中的,DNA，,耗尽,mRNA,时体系中的蛋白质合成即停止，当补充外源,mRNA,或人工合成的各种均聚物或共聚物作为模板以及,ATP、GTP、,氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板所决定。,因此，分析比较加入的模板和合成的肽链即可推知编码某些氨基酸的密码。,8,Tritiated-polyU,when added to cell-free extracts of Escherichia coli,became associated with ribosomes.This association occurred at 3 degrees C and did not require high-energy phosphate compounds.Small amounts of tritiated polyuridylic acid produced polydisperse ribosomal aggregates with sedimentation constants of approximately 100 to 130.C(14)-phenylalanine initially was incorporated into protein only on these particles,which suggests that they are the,sites of polyphenylalanine synthesis.,Nirenberg MW.,Fate of a Synthetic Polynucleotide Directing Cell-Free Protein Synthesis II.Association with Ribosomes.,Science,.1962,138(3542):813-817.,1961,Nirenberg MW.,在无细胞体系中,Mg,2+,浓度很高，人工合成的多聚核苷酸,不需要起始密码子就能指导多肽的生物合成,，读码起始是随机的。然而，在生理,Mg,2+,条件下，,没有起始密码子的多核苷酸不能被用作多肽合成的模板,。,以多聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚,(UUC),为模板，可能有3种起读方式。,5U,U,C,UUC UUC UUC UUC3,或,5,U,CU UCU UCU UCU UCU3,或,5,C,UU CUU CUU CUU CUU3,根据读码起点不同，产生的密码子可能是,UUC(Phe)、UCU(Ser),或,CUU(Leu)，,所以得到的多肽可能是多聚苯丙氨酸、多聚丝氨酸或多聚亮氨酸，由此可知,UUC、UCU、CUU,分别是苯丙氨、丝氨酸及亮氨酸的密码子。,以多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种均聚多肽，以多聚,(GUA)n,为例：,5,G,U,A,GUA GUA GUA GUA3,或,5,U,A,G UAG UAG UAG UAG3,或,5,A,GU AGU AGU AGU AGU3,由第二种读码方式产生的密码子,UAG,是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生2种密码子,GUA(Val),或,AGU(Ser)，,所以,合成的多肽要么是多聚,缬氨酸,，要么是多聚,丝氨酸,。,2.核糖体结合技术,1964年采用三联体结合实验发现：,(1),tRNA,和氨基酸及三联体的结合是特异的；,(2)上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而,tRNA-,氨基酸的复合体是可以通过的。,(1),以人工合成的三核苷酸如,UUU、UCU、UGU,等为模板，在含核糖体、,AA-tRNA,的适当离子强度的反应液中保温，然后使反应液通过硝酸纤维素滤膜。,(2),发现,:,游离的,AA-tRNA,因相对分子质量小能自由通过滤膜，加入三核苷酸模板可以促使其对应的,AA-tRNA,结合到核糖体上，体积超过膜上的微孔而被滞留，这样就能把已结合到核糖体上的,AA-tRNA,与未结合的,AA-tRNA,分开。,核糖体结合实验,色氨酸,-tRNA,的分离,用20种,AA-tRNA,做20组同样的实验，每组都含20种,AA-tRNA,和各种三核苷酸，但只有一种氨基酸用,14,C,标记，看哪一种,AA-tRNA,被留在滤膜上，进一步分析这一组的模板是哪个三核苷酸，从模板三核苷酸与氨基酸的关系可测知该,氨基酸的密码子,。例如，模板是,UUU,时，,Phe-tRNA,结合于核糖体上，可知,UUU,是,Phe,的密码子。,4.1.2 遗传密码的性质,1.,密码的连续性,密码子是,mRNA,上连续排列的三个核苷酸序列，并编码一个氨基酸信息的遗传单位。,翻译由,mRNA,的,5,端的起始密码子开始，一个密码子按一个密码子连续地阅读直到,3,终止密码子，密码子间无间断也没有重叠，起始密码子决定了所有后续密码子的位置，说明三联子密码是连续的。,16,2.,密码的简并性,按照1个密码子由3个核苷酸组成的原则，4种核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其中61个是编码氨基酸的密码子，另外，,UAA、UGA,和,UAG,等,3,个密码子并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与,tRNA,的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。,因为存在61种密码子而只有20种氨基酸，所以许多氨基酸有多个密码子。实际上除色氨酸（,UGG）,和甲硫氨酸（,AUG）,只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子，其中9种氨基酸有2个密码子，1种氨基酸有3个密码子，5种氨基酸有4个密码子，3种氨基酸有6个密码子。,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并,，,对应于同一氨基酸的多个密码子称为同义密码子（,synonymous codon）。,另外，,AUG,和,GUG,既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是起始密码子，这种双重功能在生物学上的优点尚不清楚。,同义密码子一般都不是随机分布的，因为其第一、第二位核苷酸往往是相同的，而第三位核苷酸的改变并不一定影响所编码的氨基酸，这种安排减少了变异对生物的影响。一般说来，编码某一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频率也越高。,3.,密码的通用性与特殊性,遗传密码无论在体内还是体外，也无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都是通用的，所以，,密码子具有通用性,。已经查明，在支原体中，,终止密码子,UGA,被用来编码色氨酸,；在嗜热四膜虫中，另一个终止密码子,UAA,被用来编码谷氨酰胺,。,密码子具有特殊性,。,4.密码子与反密码子的相互作用,在蛋白质生物合成过程中，,tRNA,的,反密码子,在核糖体内是通过,碱基的反向配对,与,mRNA,上的,密码子,相互作用的。,1966年,Crick,根据立体化学原理提出摆动假说,(wobble hypothesis),。,摆动假说,:,在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，,第三对碱基有一定的自由度,，可以“摆动”，因而使某些,tRNA,可以识别1个以上的密码子,;,如果有几个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的,tRNA。,原核有,30-45,种,tRNA,，真核有,50,种,tRNA,。,I,：,Inosine is formed by deamination of adenosine after tRNA synthesis,4.2,tRNA,tRNA,在蛋白质合成中处于关键地位，它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了,接合体,，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了,运送载体,，所以，它又被称为,第二遗传密码,。,tRNA,参与多种反应，并与多种蛋白质和核酸相互识别，这就决定了它们在结构上存在大量的共性。,各种,tRNA,均含有7080个碱基，其中22个碱基是恒定的。具五臂四环结构,:,1.受体臂,（,acceptor arm）,：主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3,端末配对的3-4个碱基所组成，其3,端的最后3,个碱基序列保守的,CCA,，,最后一个碱基的3,或2,自由羟基可以被氨酰化。此臂负责携带特异的氨基酸。,2.,T,C,臂:,根据3个核苷酸命名的，其中,表示拟尿嘧啶，是,tRNA,分子所拥有的不常见核苷酸。常由5,bp,的茎和7,Nt,和环组成，负责与核糖体上的,rRNA,识别结合。,4.2.1 t,RNA,的,结构,1,、,tRNA,的二级结构,3.反密码子臂,(,anticodon arm):,位于套索中央的三联反密码子。常由5,bp,的茎区和7,Nt,的环区组成，它负责对密码子的识别与配对。,4.D,臂,(,D arm):,含有二氢尿嘧啶，茎区长度常为4,bp，,也称,双氢尿嘧啶环。负责和氨基酰,-tRNA,聚合酶结合,。,5.额外环,(,extra arm),：可变性大，,4-,21,nt,不等，其功能是在,tRNA,的,L,型三维结构中负责连接两个区域（,D,环反密码子环和,TC-,受体臂）。,tRNA,的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个,tRNA,分子至少含有,2个稀有碱基,，,最多有19个,，多数分布在,非配对区,。特别是在反密码子3,端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸，这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。,研究证实：,tRNA,的性质是由反密码子而不是它所携带的氨基酸所决定的，而,除了起始,tRNA,外，所有,tRNA,都能被翻译辅助因子,EF-Tu,或,eEF1,所识别而与核糖体相结合，起始,tRNA,能被,IF-2,或,eIF-2,所识别。,4.2.,2,tRNA,的功能,转录过程是遗传信息从,DNA,转移至另一种结构上极为相似的核酸分子,mRNA,的过程，信息转移靠的是碱基配对。,翻译阶段遗传信息从,mRNA,分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里起作用的是解码机制。,4.2.,3 tRNA,的种类,1、起始,tRNA,和延伸,tRNA,能特异地识别,mRNA,模板上起始密码子的,tRNA,叫,起始,tRNA,，,其他,tRNA,统称为,延伸,tRNA,。,原核生物起始,tRNA,携带甲酰甲硫氨酸（,fMet），,真核生物起始,tRNA,携带甲硫氨酸（,Met）。,2,、同工,tRNA,代表同一种氨基酸的,tRNA,称为,同工,tRNA,，,同工,tRNA,既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被,AA-tRNA,合成酶识别。,3、校正,tRNA,在结构基因中的一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子,，,使蛋白质合成提前终止，合成无功能的多肽，这种突变就称为,无义突变,，而校正,tRNA,经改变反密码子区可校正无义突变。,（络氨酸）,错义突变,（,missense mutation,）,由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。错义突变的校正,tRNA,通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。,校正,tRNA,在进行校正过程中必须与正常的,tRNA,竞争结合密码子。无义突变的校正,tRNA,必须与释放因子竞争识别密码子；错义突变的校正,tRNA,必须与该密码的正常,tRNA,竞争，都会影响校正的效率。,校正基因的效率不仅决定于反密码子与密码子的亲和力，也决定于它在细胞中的浓度及竞争中的其他参数。一般说来，校正效率不会超过50%。,AA-tRNA,合成酶是一类催化氨基酸与,tRNA,结合的特异性酶，其反应式如下：它实际上包括两步反应：,第一步，氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物：,AA+ATP+,酶（,E）E-AA-AMP+PPi,第二步，氨酰基转移到,tRNA 3,末端腺苷残基上，与其2,或3,-羟基结合。,E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMP,4.2.,4,氨酰,-tRNA,合成酶,核糖体像一个能沿,mRNA,模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体,RNA,组成的亚细胞颗粒。,一个细菌细胞内约有2万个核糖体，而真核细胞内可达10,6,个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达10,12,。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。,在生物细胞中，核糖体数量非常大。,4.3 核糖体,4.3.1,核糖体的结构,2.,核糖体的功能,核糖体有,3,个,tRNA,结合位点。,A,位：,AA-tRNA,的结合部位；,P,位：肽酰,-tRNA,的结合部位、肽基转,移部位及形成肽键的部位；,E,位：肽链延伸过程中的多肽链转移到,氨酰,-tRNA,上释放,tRNA,位点脱出。,小亚基上拥有,mRNA,结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及,tRNA,携带的功能，如肽键的形成、,AA-tRNA、,肽基-,tRNA,的结合等。,A,位、,P,位、转肽酶中心等主要在大亚基上。,表,14-8,核糖体的活性位点,活性位点,功能,位置,组分,mRNA,结合,位点,结合,mRNA,和,IF,因子,30S,P,位点附近,S1,、,S18,、,S21,；及,S3,、,S4,、,S5,、,S12,16SrRNA,3,末端区域,P,位点,结合,fMet-tRNA,和,肽基,-,tRNA,大部分在,50S,亚基,L2,、,L27,及,L14,、,L18,、,L24,、,L33,16S,和,23SrRNA,3,附近区域,A,位点,结合氨酰基,-tRNA,大部分在,30S,亚基,L1,、,L5,、,L7/L12,、,L20,、,L30,、,L33,16S,和,23SrRNA,（,16S,的,1400,区）,E,位点,结合脱酰,tRNA,50S,23SrRNA,是重要的,5SRNA,和,23S,rRNA,结合,P,和,A,位点的附近,L5,、,L18,、,L25,复合体,肽酰基转移,酶,将肽链转移到氨基,酰,-tRNA,上,50S,的中心突起,L2,、,L3,、,L4,、,L15,、,L16,23SrRNA,是重要的,EF-Tu,结合,位点,氨基酰,-tRNA,的进,入,30S,外部,EF-G,结合,位点,移位,50S,亚基的界面,上，,L7/L12,附近，,近,S12,L7/L12,GTP,酶需要,50S,的柄,L7,、,L12,4.4 蛋白质生物合成的生物学机制,研究证明：,核酸是生命体内最基本的物质，因为蛋白质的合成和结构最终都取决于核酸，但蛋白质仍是生物活性物质中最重要的大分子组分，生物有机体的遗传学特性仍然要通过蛋白质来得到表达。,蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。,蛋白质的生物合成是以氨基酸作为基本建筑材料的，且只有与,tRNA,相结合的氨基酸才能被准确地运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。氨基酸必须在氨酰-,tRNA,合成酶的作用下生成活化氨基酸,AA-tRNA。,4.4.1 氨基酸的活化,研究发现,:,细胞至少存在20种以上具有氨基酸专一性的氨酰-,tRNA,合成酶，能够识别并通过氨基酸的,-COOH,与,tRNA 3,端腺苷酸核糖基上3,-OH,缩水形成二酯键。,同一个氨酰-,tRNA,合成酶具有把相同氨基酸加到两个或更多个带有不同反密码子,tRNA,分子上的功能,。,原核生物,起始氨基酸是,甲酰甲硫氨酸,，所以，与核糖体小亚基相结合的是,N-,甲酰甲硫氨酰-,tRNA,fMet,，,它由以下两步反应合成。,（,1,）,Met +tRNA,fMet,+ATP Met-tRNA,fMet,+AMP +PPi,；,（,2,）甲酰基转移酶将,1,个甲酰基,转移到,Met,的氨基上,N,10,-,甲酰四氢叶酸+,Met-tRNA,fMet,四氢叶酸+,fMet-tRNA,fMet,。,真核生物,任何一个多肽合成都是从生成甲硫氨酰-,tRNAi,Met,开始的，因为甲硫氨酸的特殊性，所以，体内存在两种,tRNA,Met,。,只有甲硫氨酰-,tRNAi,Met,才能与40,S,小亚基相结合，起始肽链合成，普通,tRNA,Met,中携带的甲硫氨酸只能被掺入正在延伸的肽链中。,IF-1 9.5kDa,加强,IF-2，IF-3,的酶活,IF-2 95kDa117kDa,促使,fMet-tRNA,fmet,选择性的结合,在30,S,亚基上,IF-3 20kDa,促使30,S,亚基结合于,mRNA,起始部位,具有解离30,S,与50,S,亚基的活性,4.4.2,翻译的起始,1,、原核生物的翻译启始因子,原核生物翻译的起始：,第一步：,30S,小亚基首先与翻译起始因子,IF-1，IF-3,结合，通过,SD,序列,与,mRNA,模板结合,;,第二步：,在,IF-2,和,GTP,的帮助下，,fMet-tRNA,fMet,进入小亚基的,P,位，,tRNA,上的反密码子与,mRNA,上的起始密码子配对,;,第三步：,带有,tRNA，mRNA，,三个翻译起始因子的小亚基复合物与50,S,大亚基结合，,GTP,水解，释放翻译起始因子。,Initiation codon,30,S,小亚基具有专一性的识别和选择,mRNA,起始位点的性质，而,IF-3,能协助小亚基完成这种选择。,研究发现：,30,S,亚基通过其16,S rRNA,的3末端与,mRNA5,端起始密码子上游碱基配对结合。,Shine and Dalgarno,等证明几乎所有原核生物,mRNA,上都有一个5-,AGGAGGU-3,序列，这个,富嘌呤区,与30,S,亚基上16,S rRNA 3,末端的,富嘧啶区序列,5-,GAUCACCUCCUUA-3,相互补,.,各种,mRNA,的核糖体结合位点中能与16,SrRNA,配对的核苷酸数目及这些核苷酸和起始密码子之间的距离是不一样的，反映了起始信号的不均一性。一般说来，,相互补的核苷酸越多,，30,S,亚基与,mRNA,起始位点结合的,效率也越高,。互补的核苷酸与,AUG,之间的距离也会影响,mRNA-,核糖体复合物的形成及其稳定性,。,真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其,差异主要是核糖体较大,，有较多的起始因子参与，其,mRNA,具有,m,7,GpppNp,帽子结构，,Met-tRNA,Met,不甲酰化，,mRNA,分子5 端的“帽子”和3 端的多聚,A,都参与形成翻译起始复合物。,细菌核糖体与氨酰-,tRNA,结合位点,:,A,位点,(,氨酰基部位，,Aminoacyl site),P,位点,(,肽基部位，,Peptidyl site),E,位点,(Exit site),只有,fMet-tRNA,fMet,能与第一个,P,位点相结合，其它所有,tRNA,都必须通过,A,位点到达,P,位点，再由,E,位点离开核糖体。,实验证明：,帽子结构,能促进起始反应，因为核糖体上有专一位点或因子识别,mRNA,的帽子，使,mRNA,与核糖体结合。帽子在,mRNA,与40,S,亚基结合过程中还起稳定作用。,实验表明：,带帽子的,mRNA 5,端与18,S rRNA,的3 端序列之间存在不同于,SD,序列的碱基配对型相互作用,。,40S,小亚基,除了帽子结构以外，40,S,小亚基还能识别,mRNA,上的起始密码子,AUG,。,Kozak,等提出了一个“,扫描模型,”来解释40,S,亚基对,mRNA,起始密码子的识别作用。按照这个模型，40,S,小亚基先结合在,mRNA5,端的任何序列上，然后沿,mRNA,移动直至遇到,AUG,发生较为稳定的相互作用，最后与60,S,亚基一道生成80,S,起始复合物。,40,S,小亚基之所以能在,AUG,处停下，,可能,是由于,Met-tRNAi,Met,的反密码子与,AUG,配对的结果。,4.4.3 肽链的延伸,生成起始复合物，第一个氨基酸（,fMet/Met-tRNA）,与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照,mRNA,模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括,AA-tRNA,与核糖体结合、肽键的生成和移位。,1、后续,AA-tRNA,与核糖体结合,起始复合物形成以后，第二个,AA-tRNA,在延伸因子,EF-Tu,及,GTP,的作用下，生成,AA-tRNA EF-Tu GTP,复合物，然后结合到核糖体的,A,位上。这时,GTP,被水解释放，通过延伸因子,EF-Ts,再生,GTP，,形成,EF-TuGTP,复合物，进入新一轮循环。,模板上的密码子决定了哪种,AA-tRNA,能被结合到,A,位上。由于,EF-Tu,只能与,fMet-tRNA,以外的其他,AA-tRNA,起反应，所以起始,tRNA,不会被结合到,A,位上，这就是,mRNA,内部的,AUG,不会被起始,tRNA,读出，肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸的原因。,2肽键的生成,经过上一步反应后，在核糖体,mRNA AA-tRNA,复合物中，,AA-tRNA,占据,A,位，,fMet-tRNAfMet,占据,P,位。在肽基转移酶的催化下，,A,位上的,AA-tRNA,转移到,P,位，与,fMet-tRNA,fMet,上的氨基酸生成肽键。起始,tRNA,在完成使命后离开核糖体,P,位点，,A,位点准备接受新的,AA-tRNA，,开始下一轮合成反应。,3移位,肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向,mRNA 3,端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基,tRNA,2,从,A,位进入,P,位，去氨基酰-,tRNA,被挤入,E,位，,mRNA,上的第三位密码子则对应于,A,位。,EF-G,是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子,GTP,水解。,用嘌呤霉素作为抑制剂做实验表明，核糖体沿,mRNA,移动与肽基-,tRNA,的移位这两个过程是耦联的。,肽链延伸是由许多个反应组成的，原核生物中每次反应共需3个延伸因子，,EF-Tu、EF-Ts,及,EF-G，,它们都具有,GTP,酶活性，,EF-Tu,和,EF-Ts,能够促进,AA-tRNA,进入,A,位，,EF-G,促进转位和卸载,tRNA,的释放。,真核生物细胞需,EF-1,及,EF-2，,消耗2个,GTP，,向生长中的肽链加上一个氨基酸。,4.4.4.,肽链的终止,肽链的延伸过程中，当终止密码子,UAA、UAG,、,UGA,出现在核糖体的,A,位时，没有相应的,AA-tRNA,能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解,P,位上多肽链与,tRNA,之间的二酯键。接着，新生的肽链和,tRNA,从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。,释放因子,RF,具有,GTP,酶活性，它催化,GTP,水解，使肽链与核糖体解离。,细菌细胞内存在三种不同的终止因子（,RF1，RF2，RF3），RF1,能识别,UAG,和,UAA，RF2,识别,UGA,和,UAA。,一旦,RF,与终止密码相结合，它们就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。,RF3,可能与核糖体的解体有关。,真核细胞,I,类和,II,类分别只有一种，,eRF1,和,eEF3,，,eRF1,能够识别,3,个终止密码子。,4.4.5,.,蛋白质前体的加工,新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。,1,N,端,fMet,或,Met,的切除,细菌蛋白质氨基端的甲酰基能,被脱甲酰化酶,水解，不管是原核生物还是真核生物，,N,端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。50%的真核蛋白中，成熟蛋白,N,端残基会被,N-,乙基化。,2二硫键的形成,mRNA,中没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质都含有二硫键，这是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。,3特定氨基酸的修饰,氨基酸侧链的修饰作用包括：,磷酸化,（如核糖体蛋白质）、,糖基化,（如各种糖蛋白）、,甲基化,（如组蛋白、肌肉蛋白质）、,乙基化,（如组蛋白）、,羟基化,（如胶原蛋白）和,羧基化,等，是生物体内最普通发生修饰作用的氨基酸残基及其修饰产物。糖蛋白主要是通过蛋白质侧链上的天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基加上糖基形成的，胶原蛋白上的脯氨酸和赖氨酸多数是羟基化的。,实验证明：,内质网可能是蛋白质,N-,糖基化的主要场所，糖基化酶催化下进行。,（血型糖蛋白）,蛋白质的糖基化：,A.,蛋白质的特定氨基酸残基(,天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基,)加入糖基复合物,(2-60,单糖),B.,通常为,跨膜蛋白,C.,重要的识别标志,D.,所有分泌性蛋白和膜蛋白,几乎都是糖基化蛋白质。,两种类型,N-linked,O-linked,N-,乙酰葡萄糖氨连接,到天冬胺酸残基上,N-,乙酰葡萄糖氨连,接到丝胺酸残基上,4切除新生肽链中非功能片段,如新合成的胰岛素前体是前胰岛素原，必须先切去信号肽变成胰岛素原，再切去,B-,肽，才变成有活性的胰岛素。,有些动物病毒如脊髓灰质炎病毒的,mRNA,可翻译成很长的多肽链，含多种病毒蛋白，经蛋白酶在特定位置上水解后得到几个有功能的蛋白质分子。不少多肽类激素和酶的前体也要经过加工才能变为活性分子，如血纤维蛋白原、胰蛋白酶原经过加工切去部分肽段才能成为有活性的血纤维蛋白、胰蛋白酶。,4.4.6 蛋白质合成抑制剂,蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素。如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、环已亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白等都能抑制蛋白质的合成,。,抗菌素对蛋白质合成的作用可能是阻止,mRNA,与核糖体结合（氯霉素），或阻止,AA-tRNA,与核糖体结合（四环素类），或干扰,AA-tRNA,与核糖体结合而产生错读（链霉素、新霉素、卡那霉素等），或作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。,链霉素：,它是一种碱性三糖，能干扰,fMet-tRNA,与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致,mRNA,的错读。若以多聚（,U）,作模板，则除苯丙氨酸（,UUU）,外，异亮氨酸（,AUU）,也会被掺入。用抗链霉素细菌的50,S,亚基及对链霉素敏感细菌的30,S,亚基重组获得的核糖体对链霉素是敏感的，而用敏感菌的50,S,亚基及抗性菌的30,S,亚基组成的核糖体对链霉素有抗性，表明链霉素的作用位点在30,S,亚基上。,嘌呤霉素抑制蛋白合成的机制：,其与,AA-tRNA,的结构类似物，能结合在核糖体的,A,位上，抑制,AA-tRNA,的进入。它所带的氨基与,AA-tRNA,上的氨基一样，能与生长中的肽链上的羧基反应生成肽键，这个反应的产物是一条3,羧基端挂了一个嘌呤霉素残基的小肽，肽酰嘌呤霉素随后从核糖体上解离出来，所以嘌呤霉素是通过提前释放肽链来抑制蛋白质合成的。,青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。,氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。,蛋白质运转方式有两大类型,1,、,翻译,-,运转同步机制：,某些蛋白质的合成和运转是同时发生的；,2,、,翻译后运转机制：,某些蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。,蛋白性质,运,转,机,制,主,要,类,型,分泌,蛋白质在结合核糖体上合成，,并以翻译运转同步机制运输,免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等,细胞器发育,蛋白质在游离核糖体上合成，以翻译后运转机制运输,核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质,膜的形成,两种机制兼有,质膜、内质网、类囊体中的蛋白质,4.5.1 翻译-运转同步机制,一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白质氨基酸序列中，且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达，这就是,信号肽假说,的基础。,信号肽假说认为：,蛋白质跨膜运转信号是由,mRNA,编码的。在起始密码子后，有一 段编码,疏水性氨基酸序列,的,RNA,区域，这个氨基酸序列就被称为,信号序列,。,信号序列在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构，因此，这种方式是边翻译边跨膜运转。,84,蛋白质通过其,N,端的信号肽在内质网中转运到不同的细胞器,信号肽长度为13-36,aa,左右，其具有以下三个特点：,（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列,N-,端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其,C-,末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。,SRP=signal recognition protein,改变融合基因中编码麦芽糖转运蛋白氨基端的基因序列，得到如下结论：,完整的信号多肽是保证蛋白质运转的必要条件。信号序列中疏水性氨基酸突变成亲水性氨基酸后，会阻止蛋白质运转而使新生蛋白质以前体形式积累在胞质中。,仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生。,信号序列的切除并不是运转所必需的。如果把细菌外膜脂蛋白信号序列中的甘氨酸残基突变成天冬氨酸残基，能抑制该蛋白信号肽的水解，但不能抑制其跨膜运转。,并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽。卵清蛋白是以翻译运转同步机制进入微粒体中的，但它并没有可降解的信号序列。有人认为，在卵清蛋白分子的中心区域有相当于信号肽功能的肽段存在。,研究发现：,叶绿体和线粒体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供,的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。,线粒体：,线粒体是细胞的,“,动力站,”,，含有,DNA,、,RNA,以及核糖体，,但它的,DNA,信息含量有限，大部分线粒体蛋白质由核,DNA,编,码，在细胞质自由核糖体上合成。蛋白质被释放至细胞质,再跨膜转运到线粒体。,4.5.2.1线粒体蛋白质跨膜运转特征,通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟,蛋白质和,N,端延伸出的一段前导肽（,leader peptide）,组成，其长约为,20-80,个氨基酸残基。,蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需要能量的过程；,蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的,Tom,受体复合蛋白识别,与,Hsp70,或,MSF,（,mitochondrial import stimulation factor,）等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过,Tom,和,Tim,组成的膜通道进入线粒体内腔。,Tom,：,transport across outer,membrane,Tim,：,transport across inner,membrane,Some proteins contain stop,transfersignal and are inserted,Into mitochondrial membrane.,叶绿体蛋白质运转过程有如下特点：,活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内，这是鉴别翻译后运转的指标之一。,叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。,叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。,4.5.2.,2,叶绿体蛋白质的跨膜运转,4.5.3 核定位蛋白的运转机制,在细胞质中合成的蛋白质一般通过核孔进入细胞核。所有核糖体蛋白都首先在细胞质中被合成，运转到细胞核内，在核仁中被装配成40,S,和60,S,核糖体亚基，然后运转回到细胞质中行使作为蛋白质合成机器的功能。,RNA、DNA,聚合酶、组蛋白、拓朴异构酶及大量转录、复制调控因子都必须从细胞质进入细胞核才能正常发挥功能。,Because nuclear membrane,reforms after each cell,division,NLS is not removed.,Importin,（核转运因子,),Ran GTP,酶,NLS nuclear localization sequence.,Ran:GTP,水解酶,