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编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,编辑标题,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR基因扩增仪,内容提要,1,.,PCR,基因扩增仪的工作原理,PCR,技术的原理及发展,PCR,基因扩增仪的工作原理,2.,PCR,扩增仪的分类与结构,定性,PCR,扩增仪,实时荧光定量,PCR,扩增仪,3.,PCR,扩增仪的性能指标、操作规程,PCR,扩增仪的性能指标,PCR,扩增仪的操作规程,4.,PCR,扩增仪的应用,第一节,PCR,基因扩增仪的工作原理,一、,PCR,技术的发展,Khorana(1971)等最早提出,核酸体外扩增,的设想:“经DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”,1985年,Kary Mullis在Cetus公司工作期间,,发明了PCR,。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。,1983年4月的一个星期五晚上,他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“,多聚酶链式反应,”的想法。,1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202),Mullis是第一发明人;,1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文,Mullis是共同作者;,1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始,学习PCR,的方法。,聚合酶链式反应(,PCR,)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。,第一节,PCR,基因扩增仪的工作原理,二、,PCR,技术的原理,体外核酸扩增,加热使双链,DNA,解开螺旋,在退火温度条件下引物同模板,DNA,杂交,在,Taq DNA,聚合酶,,dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸),,,Mg2+,和合适,pH,缓冲液存在条件下延伸引物,重复,“,变性,退火,引物延伸,”,过程至,25-40,个循环,呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。,简单的说,PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。,第一节,PCR,基因扩增仪的工作原理,模板DNA的变性:模板DNA经加热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备,模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;,DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,第一节,PCR,基因扩增仪的工作原理,PCR,基因扩增仪的工作关键,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。,从,PCR,反应基本原理可以看出,,PCR,基因扩增仪工作关键是温度控制。,第一节,PCR,基因扩增仪的工作原理,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,荧光实时定量,PCR,(,real-time quantitative PCR,RQ-PCR,)技术,在,PCR,反应体系中加入特异性的荧光染料或探针,荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加,通过检测荧光信号,从而实时监测整个,PCR,反应过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,实时荧光定量,PCR,仪,金属板式实时定量,PCR,仪,离心式实时定量,PCR,仪,各孔独立控温的定量,PCR,仪,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,金属板式实时定量,PCR,仪,可作为普通,PCR,仪使用,可带梯度功能,可容纳的样本量大,无需特殊耗材,温度均一性欠佳,有边缘效应,标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,ABI 7500,荧光定量,PCR,仪,MJ,公司,Chromo 4,荧光定量,PCR,仪,Bio-rad,公司,iCycler,荧光定量,PCR,仪,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,离心式实时定量,PCR,仪,温度均一性较好,使用的是同一个激发光源和检测器,随时检测旋转到跟前的样品,有效减少系统误差,可容纳样品量少,有的需用特殊毛细管作样品管,增加了使用成本,也不带梯度功能,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,Rotor-Gene 3000,荧光定量,PCR,仪,Light CycleTM,荧光定量,PCR,仪,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,各孔独立控温的定量,PCR,仪,不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,各孔独立控温,适合多指标快速检测。,SmartCycler,的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块,既满足高速批量要求,又能灵活运用,还可实现任意梯度反应。,SmartCycler,上样不如传统方法方便,而且需要独特的扁平反应管,使用成本较高。,第二节,PCR,扩增仪的分类与结构,SmartCycler,荧光定量,PCR,仪,第三节,PCR,扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除,一、,PCR,扩增仪的性能指标,(二)荧光检测系统,激发光源,检测器,发光二极管,卤钨灯光源,超低温,CCD,光电倍增管,第三节,PCR,扩增仪的性能指标、操作规程,(三)软件,简便的人性化设计最能满足其需求。,新型的,PCR,仪很注重程序编写的简易性,易学易用,具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能,很多还可以免费升级。,(四)其他,多样化样品基座设计、热盖等都使,PCR,仪越来越人性化。,第三节,PCR,扩增仪的性能指标、操作规程,第三节,PCR,扩增仪的性能指标、操作规程,二、,PCR,扩增仪的操作规程,普通,PCR,扩增仪的操作非常简便,接通电源,仪器自检,设置温度程序或调出储存的程序运行即可。,定量,PCR,扩增仪的操作和普通,PCR,仪基本相同。,第四节,PCR,扩增仪的应用,三、,PCR,扩增仪的应用,1.,感染性疾病的分子诊断和研究,2.,遗传性疾病的分子诊断和研究,3.,恶性肿瘤的分子诊断和研究,4.PCR,扩增仪在移植配型上的应用,5.PCR,扩增仪在法医学上的应用,6.PCR,扩增仪在分子生物学其他领域的应用,谢 谢!,
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