免疫学概论-第5章-抗原和抗体的制备与应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 天然抗原的制备,一、颗粒天然抗原的制备,二、可溶性抗原的,制备,一、颗粒天然抗原的制备,1.,细菌抗原,2.,血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备,1.,细菌抗原,(,多用液体或固体培养物,集菌,后处理,),1),H,抗原,(,鞭毛抗原，蛋白质）,:,用有毒力的菌株，菌液用,0.3,0.5,甲醛处理,2),O,抗原（菌体抗原，细胞壁多糖抗原）,:,需要,100,加温,2,2.5h,后应用。,3),Vi,抗原（伤寒沙门菌的表面抗原，糖脂）,：应在杀菌后再加,0.5,1,氯化钙溶液。,有些细胞膜成分，如组织细胞膜、血细胞膜经打碎后亦可制成颗粒抗原。颗粒抗原悬液呈乳浊状，多采用,静脉内免疫法,，较少使用,佐剂,作皮内注射。,b.,死菌苗,制备关键：用化学或物理方法将病原菌,杀死,后仍可,保持免疫原性,特点,:,病原菌已被杀死，不能繁殖，用量较大，接种后可能出现局部肿痛或发热等全身反应,;,大多需多次接种。,实例：霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌苗、百日咳菌苗等。,2.,血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备,绵羊红细胞抗原的制备,组织和细胞粗抗原的制备,绵羊红细胞的制备流程图,摇动,15-20min,4,可保存,3,周,取适量,NS,洗涤,3,次,2000r/min,10min,NS,稀释至,2,5%,抗凝血剂天然抗凝剂（肝素）,Ca+2,鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）,有溶血现象应弃去,2,）组织和细胞粗抗原的制备,处理好的组织用生理盐水洗去血迹及污染物。将洗净的组织剪成小块，进行粉碎。,组织匀浆后通过,2000,3000r/min,离心,10min,后分成两个部分,沉淀物含有大量的组织细胞和碎片,-,组织和细胞粗抗原；,上清液作为提取可溶性抗原的材料，提取前还要通过,1000,2000r/min20,30min,的高速离心，以除去微小的细胞碎片，此时上清液应澄清,来源,:,组织和细胞，其成分比较,复杂,1.,组织和细胞成分,混合抗原,制备,2.,蛋白质抗原,制备,3.,核酸抗原,制备,4.,类脂多糖,抗原制备,5.,免疫球蛋白,片段制备,二、,可溶性抗原制备及鉴定,可溶性抗原,:,蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、,补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制备及鉴定,1.,组织和细胞成分混合抗原制备程序,上清液,澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹,及污物,NS,内含,0.5g,L NaN,2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速,粉碎制成组织匀浆液,3000r,min10min,取上清液,去除细胞碎片,及微小组织,离心,蛋白质抗原制备,蛋白质是,良好的,抗原，要制备特异性高,的抗血清通常需要,纯化,。可采用：,1.,超速离心法,2.,选择性沉淀法,3.,凝胶层析法,4.,离子交换层析法,5.,亲合层析法,2.,蛋白质抗原制备（自学）,原理,:,利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，,使具有,不同沉降速度,的颗粒,处于,不同密度,的梯度层内,，达到彼此分离的目的。,1),超速离心法,特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗,原，极难将某一抗原成分分离出来。,应用：用于少部分,大分子抗原,和一些比较,轻,的抗原物质,的分离，如,IgM,、,C1q,、甲状腺球,蛋白、载脂蛋白,A,、,B,等。,2,、选择性沉淀法,原理：,根据各蛋白质理化特性的差异，采用,各种沉淀剂或改变某些条件,促使蛋白质抗原,成分沉淀，从而达到纯化的目的。,2),、选择性沉淀法,常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解,度不同）；常用,33,50,饱和度的硫酸胺,。,特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。,应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,3,凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：,凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，,经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种,分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分,子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝,胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时,间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝,胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分,成大、中、小三种类型。,3),凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：,利用带离子基团的纤维素或凝胶，,吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原,。,各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别,。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成,球蛋白、,球蛋白、,球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,4),离子交换层析法,5,亲和层析法（亲和色谱）,原理：,依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的,抗,IgG,附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的,IgG,可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体,(,抗,IgG),结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的,Ig,洗脱下来，达到纯化的目的。,优点：,提取纯度高、抗原抗体不失活性。,5),亲和层析法（亲和色谱）,核酸抗原制备,大分子的核酸,具有免疫原性,。,提取核酸的主要步骤：,3.,核酸抗原制备自学,破碎细胞,核酸从细胞中游离出来,酸沉淀核酸,除去蛋白质,乙醇,酚和氯仿,类脂多糖抗原制备,苯酚法提取,LPS,：,干燥菌体或湿菌体,水中,混匀,激烈搅匀,加热,5min,冰水,急冷,降至,10,以下,离心,上层的水层,(,含,LPS),下层的酚层,菌体残渣于底部,吸取,水层,透析,除酚,加热,超速离心,浓缩,LPS,在上层沉淀的透明胶状部内,绞出,悬于水中,离心,得纯化,LPS,4.,类脂多糖抗原制备自学,同温的苯酚,免疫球蛋白片段制备,1,酶裂解法,酶对免疫球蛋白的水解有极好,的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解,为不同的片段。,5.,免疫球蛋白片段制备,2,氧化法和还原法,是将免疫球蛋白轻、重,链分开的两种常用方法。,3.,还可用,强变性剂,或利用,改变,pH,将免疫球蛋,白亚单位分开。,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc,段，用以制备抗重链血清,F(ab,),2,，常作为抗体试剂用于试验,木瓜蛋白酶,（,papain),胰蛋白酶,(pepsin),胃蛋白酶,(pepsin),1.,氧化法：,优点是切开后，肽链不能重新,形成二硫键、便于肽链纯化；,缺点是色氨酸侧链容易被破坏,氧化法和,还原法,2.,还原法：,将二硫键还原成巯基。但极不,稳定，易重新形成二硫键，必须及时用,碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化,三、半抗原免疫原的制备,1.,半抗原：,低分子量的化学物质。例如多糖、,多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、,某些药物,(,包括抗生素）及其他化学物品等。,第二节、人工抗原的制备,2.,载体：,蛋白质类,多肽聚合物,大分子聚合物,3.,半抗原,-,载体连接方法,:,载体类型,1.,蛋白质：,人血清白蛋白、,牛血清白蛋白,、兔,血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,载体类型,2.,多肽聚合物,：人工合成的，常见的有多聚赖,氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万,),，,这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动,物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.,大聚合物,：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮,等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦,可诱发动物产生抗体。,通过电荷和微孔吸附手段,半抗原,-,载体连接方法,1,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌,1,2h,室温,24,h,透析除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法,1,混合,带游离的羧基或氨基的半抗原与载体连接,混合,半抗原,-,载体连接方法,2,戊二醛法,:,半抗原,-NH,2,载体蛋白,-NH,2,半抗原,-N=,CH-(CH,2,),3,-CH=,NH-,载体蛋白,OHC-(CH,2,),3,-CHO,*,戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂,半抗原载体连接方法,2,与载体和半抗原的氨基相连接,半抗原,-,载体连接方法,3,氯甲酸异丁脂法：,半抗原,-COOH,载体蛋白,-NH,2,Cl-COO-CH,2,CH(CH,3,),2,半抗原,-COO-COO-CH,2,CH(CH,3,),2,半抗原,-CO-,NH,-,载体蛋白,半抗原载体连接方法,3,简便，用于,类固醇抗原,制备,HO-,CH,2,CH(CH,3,),2,半抗原,-,载体连接方法,4,琥珀酸酐法：,用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原,-CH,2,OH,CH,2,-CO CH,2,-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原,-CH,2,-OOC-CH,2,-CH,2,-COOH,返回,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化,二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法,4,第三节 多克隆抗体的制备,1.,概念,2.,多克隆抗体的特点,3.,多克隆抗体的制备流程,一、概念,1.,克隆：无性繁殖细胞系，由,单一个祖先细胞,分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。,2.,多克隆抗体,:,用一种包含,多种抗原决定簇的抗原,免疫动物，可刺激机体,多个,B,细胞克隆,产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有,多种抗体的混合物,，即多克隆抗体。,二、,多克隆抗体,的特点,特点,:,不均一性,(,抗体的异质性,),由外源性和内源,性因素引起的,1),外源性,:,抗原分子结构复杂,具有多种抗原 决,定簇,每种决定簇引起一种相应抗体的,产生,.,反映了机体对抗原物质的精细结,构的识别能力,.,2),内源性,:,免疫球蛋白的血清型,(,回顾,),免疫蛋白为大分子蛋白质，具备抗原的各种性质，对异种、同种异体，甚至宿主自身都是良好的抗原，且是一个抗原复合体，带有多种抗原决定簇。,Ig,分子的这种异质性反映了抗体形成细胞的遗传性差异，代表抗体分子在不同水平上的遗传变异性；通常可用血清学方法检测出来，并据此将,Ig,及其肽链（,H,和,L,链）分成不同的血清学类型。,同种型 同种异型,独特型,免疫球蛋白的血清型,:,三、多克隆抗体的制备流程,1.,免疫动物的选择,2.,免疫的方法,3.,动物采血法,4.,免疫血清的分离与保存,一、免疫动物选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。,兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,一、免疫动物选择,1.,抗原与免疫动物种属差异越远越好；,2.,动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、,体重合乎要求；,3.,不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫,应答；,4.,按需要量选择大小不同的动物。,二、免疫方法,4.,免疫方案,全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射,微量免疫法：卡介苗,7,天,弗氏佐剂,1,月,抗原,混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,二、免疫方法,1.,免疫原的注射剂量,2.,免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉,腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,3.,免疫时间间隔：首次和第二次之间,10-20,天为宜，第二次以后,7-10,天。免疫次数,3-5,次。,三、动物采血法,1.,颈动脉放血法：最常用的方法,-,常用于家兔的全采血,2.,心脏采血法：要求操作熟练,-,常用于家兔和豚鼠的采血。,3.,静脉采血法：,颈静脉采血常用于绵羊；耳静脉采血常用于,家兔；尾静脉采血常用于小白鼠和大白鼠。,1.4,保存：可保存,3,6,个月,2.,低温保存：,-20,-40,，可保存,2,3,年,3.,冰冻干燥保存：可保存,3,5,年,三、动物采血法,四、免疫血清的分离和保存,第四节 抗体的纯化和鉴定,1.,抗体特异性的纯化,2.,特异性,IgG,类抗体的纯化,3.,特异性抗体的鉴定,一、抗体特异性的纯化,1.,亲合层析法：,将交叉抗原交联到,Sepharose,4B,上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层,析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异,性抗体。,一、抗体特异性的纯化,2.,吸附法：,利用不含特异性抗原的抗原液，直,接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上,清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,二、特异性,IgG,类抗体的纯化,1.,盐吸沉淀法：,经硫酸铵盐吸提取,球蛋白,3,次，基本为,IgG,类抗体，但不纯。,二、特异性,IgG,类抗体的纯化,2.A,蛋白亲和层析：,SPA,与,IgG,的,Fc,段有很强的,特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地,与抗体结合，一个,A,蛋白至少可以结合二个,IgG,分子。适合纯化细胞培养上清中的,McAb,。,3.,其它：,凝胶过滤、离子交换层析等,1.,单克隆抗体的定义,2.,单克隆抗体制备原理,3.,单抗制备方法 步骤,4.,制备过程中注意事项,5.,单抗的优缺点,第五节 单克隆抗体的制备,1975,年分子生物学家,G.J.F.keler,和,C.Milstein,在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，把体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高滴度的、非常均一的抗体,单克隆抗体,:,由一个识别,一种抗原表位的,B,细胞克隆,产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高,少或无交叉反应性。,Niels K.Jerne,G.Kohler,C.Milstein,单克隆抗体,高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的,B,细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞,杂交瘤技术的基本原理,单克隆抗体制备步骤,1,.,致敏淋巴细胞的准备,2.,骨髓瘤细胞的准备,3.,饲养层细胞的准备,4.,细胞融合,5.,选择性培养,6.,特异性抗体的检测,7.,杂交瘤细胞的克隆化,8,杂交瘤的冻存和复苏,9,单克隆抗体的大量制取,10,单克隆抗体的纯化,步骤,1,致敏淋巴细胞的准备,完全抗原：,病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于,5000Da,生物物质,半抗原,：,多糖、药物、激素、肽类等分子量小于,5000 Da,物质,半抗原需与,BSA,、,OA,等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体,步骤,1,致敏淋巴细胞的准备,动物选择：,品系、年龄、性别、健康状态,抗原免疫：,方式,体内、体外,剂量,0.5-100,g,次数,视抗原而定,间隔,视抗原而定,佐剂,视抗原而定,收集时间：,末次加强免疫（,iV,或,iP,）后,72-96h,BALB/C,小鼠,选择体重,18,20g BALB/C,雌性小鼠，用制备抗原免疫。,步骤,2,骨髓瘤细胞的准备,常用骨髓瘤细胞系：,SP2,0,、,NS1,、,P3.653,融合时骨髓瘤细胞的选择：,a.,处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于,95,b.,细胞株保持,HGPRT,缺陷状态（,次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移）,步骤,3,饲养层细胞的准备,常用饲养细胞：,小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞，小鼠或大鼠胸腺细胞等。,饲养细胞主要作用：,可能在培养液中释放某种生长刺激因子；满足新生细胞对细胞密度的依赖性；减少聚苯乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等,步骤,4,细胞融合,步骤,5,选择性培养,HAT,选择培养原理,随机融合后的细胞类型,选择性培养原理：,核苷酸主要合成途径,核苷酸补救合成途径,氨基碟呤 （,A,）,HAT,次黄嘌呤（,H,）,胸腺嘧啶核苷（,T,）,核苷酸,DNA,步骤,6,特异性抗体的检测,对检测方法的要求：,灵敏度高,特异性强,简便快速,常用检测方法：,ELISA,阳性孔的检测,步骤,7.,杂交瘤细胞的克隆化,目的,：,建立单一细胞克隆,方法：,有限稀释法，显微操作法，软琼脂培养法,克隆建立的标准：,连续两次以上,100%,阳性孔,有限稀释法,计数,0.5-2/,孔,步骤,8,杂交瘤细胞的冻存与复苏,冻存：,慢冻，分步冻存，,室温,-20,-70,液氮,复苏：,快融，取出立即浸入,37-40,水浴中，,使其迅速融化,意义：,防止污染及变异 避免染色体丢失,防止细胞密度过高而死亡,步骤,9,单克隆抗体的大量制取,动物体内诱生：,腹腔接种,体外细胞培养：,悬浮培养系统，细胞固,定化培养系统,步骤,9,单克隆抗体的大量制取,腹腔接种,1.,辛酸硫酸铵沉淀法,原理：,先加正辛酸沉淀杂蛋白，后加硫酸铵,沉淀抗体。,特点：,成本较低，操作简单；,抗体活性损失小；,抗体纯度高；,抗体回收率低；,需要高速冷冻离心机。,步骤,10,单克隆抗体的纯化,2,亲和层析法：,原理：,利用蛋白,A,或蛋白,G,通过共价键联接到活化的固相载体上，吸附抗体，然后采用改变,pH,值的方法将抗体洗脱分离。,特点：,抗体纯度高；,纯化速度快；,抗体回收率低；,抗体活性有损失；,成本高，费用大。,单克隆抗体的优缺点,优点：,在体外“永久”地存活并传代,用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,局限性：,固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围,反应强度不如多克隆抗体,制备技术复杂、费时费工、价格较高,制备过程中注意事项,1,2,3,4,用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物,抗原,免疫,用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性,融合剂,PEG,对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。浓度越高，对细胞,的毒性越大,操作中的污染污染是杂交瘤技术中最常遇到的问题，它往往可使一个即将建株的细胞毁于一旦。,单克隆抗体的 特点,特异性强,高度的均一性和重复性,效价高,可无限供应,具有单一的生物学功能,对环境敏感,单克隆抗体和多克隆抗体的比较,比较项目,多克隆抗体（,PcAb,）,单克隆抗体（,MAb,）,免疫原要求,免疫原纯度高，抗体,纯度才能高,不纯的免疫原可以获得高纯度抗体,抗体产生细胞,多克隆性,单克隆性,均质性,高度异质,高度纯质,特异性,较高，与抗原上多种决,定簇结合,高，与抗原上特定决定簇结合,稳定性,较好,相对较差，对理化条件敏感,标准化,较难，不同批次的抗体质,量差异大,易于标准化，批次间差异小,交叉反应,很常见，难避免非特异性,反应,不常见，可避免非特异反应,沉淀反应,有,多数没有,实用的血清学试验,大多数血清学试验,一种或多种，需适当选择,供应量,有限,无限,有效抗体含量,0.1-0.2 mg/ml,小鼠腹水,2.0-30 mg/ml,无效,Ig,含量,10.0-15.0 mg/ml,体外培养一般没有，小鼠腹水,0.5-5.0 mg/ml,其它血清蛋白,存在,体外培养可能有少量小牛血清蛋白，小鼠腹水有少量杂蛋白,