基因工程的原理和技术宣讲PPT优质课件.ppt

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导入,基因组文库,某种生物某个时期的,mRNA,cDNA,反转录,受体菌群体,与载体连接 导入,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组文库与,cDNA,文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中有无启动子,基因中有无内含子,基因多少,物种间的基因交流,小,大,无,无,有,有,可以,部分基因可以,某种生物的,部分基因,某种生物的,全部基因,如何从基因文库中获取目的基因？,就像从图书馆借一本书，要知道书名、作者、出版社或人物情节等信息一样,获取目的基因前，要对这个基因的背景有一定程度的了解，（如核苷酸序列、基因的功能、位置以及基因的表达产物的特性等）然后通过恰当的技术手段将目的基因从基因文库中调取出来。,获取目的基因方法：,利用,PCR,技术扩增目的基因,全称是：,多聚酶链式反,应,，在生物,体外,复制,特定,DNA,片段,的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。,DNA,复制的过程涉及,DNA,双链的方向,。通常将,DNA,的羟基（,-OH,）末端称为,3,端,，而磷酸基团的末端称为,5,端。,5,端,3,端,3,端,5,端,DNA,复制的方向,3,端,5,端,5,端,3,端,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从,3,端延伸,DNA,链。因此，,DNA,复制需要,引物,。当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从引物的,3,端开始延伸,DNA,链。,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端,端向,3,端,端延伸,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,复习：,DNA,复制,DNA,复制的过程,1.,解旋,:,利用细胞提供的能量边解旋、边复制,2.,配对,:,分别以每条单链为模板,以四种游离的脱氧核苷酸为原料,利用碱基互补配对原则合成两条新的子链,3.,螺旋：两条子链分别与对应的模板链绕成螺旋型，构成两个新的,DNA,分子,DNA,复制方式：半保留复制,思考：,DNA,复制需要哪些成分和反应条件？,如何在体外设置一个类似的,DNA,复制环境？,参与的组分,在,DNA,复制中的作用,解旋酶,打开,DNA,双链,DNA,母链（模板链）,提供,DNA,复制的模板,4,种脱氧核糖核苷酸,合成子链的原料,DNA,聚合酶,催化合成,DNA,子链,引物,使,DNA,聚合酶能够从,3,端开始连接脱氧核苷酸,DNA,双链复制的原理,（遵循,碱基互补配对,原则）,含待扩增目的基因片段的,DNA,模板,；,根据目的基因双链各一端序列片段合成,与两条模板链相结合的,两种引物,；,要有,耐热的,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,；,四种单核苷酸（,dCTP,、,dGTP,、,dATP,、,dTTP,）。,基本条件：,PCR,技术依据的原理：,DNA,热变性的原理,前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列,变性,复性,延伸,55-60,1,.DNA,变性,：加热至,90-95,，,DNA,片段,受热后,氢键,断裂，形成,单链；,2.,复性,：,冷却至,55-60,，引物结合到互补,DNA,链；,3.,延伸,：加热至,70-75,，,耐热的,DNA,聚合酶,从引物起始引导互补链的合成。,PCR,第一轮过程：,结果：使目的基因在短时间内成百万倍的扩增,目的基因以,指数,方式扩增，即,2,n,获取目的基因方法,DNA,合成仪用化学方法直接人工合成,根据已知的氨基酸序列推知,DNA,序列,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,前提条件：基因比较小，核苷酸序列已知,设备：,DNA,合成仪,目的基因的获取；,表达载体的构建；,将目的基因导入受体细胞；,目的基因的检测与鉴定。,单独的目的基因（,DNA,片段）是不能稳定遗传的。,为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传,给下一代，同时使目的基因能正常表达和发挥作用，,必须构建表达载体。,温故知新,为什么要有这一步,基因工程操作步骤的必要性,第二步：基因表达载体的构建,基因工程的,核心,构建,目的：使,目的基因,在,受体细胞,中稳定存在，并且,可以以传给下一代,。,基因表达载体的组成：,目的基因,、,启动子,、,终止子,、,标记基因,等,基因表达载体,启动子：,位于基因的首端，是,RNA,聚合酶,识别和结合,的部位，有了它才能,驱动基因,转录出,mRNA,，最终获得所需蛋白质。,终止子：,位于,基因的尾端,，使,转录在所需要的地方停止,下来。,标记基因：,为了鉴别受体细胞中是否含,目的基因,，从而,筛选,出来。,如：,抗生素抗性基因,目的基因,标记基因,质粒,DNA,分子,限制酶处理,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同种,一个切口,两个黏性末端,为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？,通过,cDNA,文库获得的目的基因有启动子和终止子吗？,在构建表达载体（重组,DNA,分子）过程中需要什么分子工具？,只考虑两两结合，可产生几种重组,DNA,分子？,三种,不能稳定存在并表达。,cDNA,文库的目的基因中没有启动子和终止子,.,目的基因的获取；,表达载体的构建；,将目的基因导入受体细胞；,目的基因的检测与鉴定。,含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,温故知新,为什么要有这一步,基因工程操作步骤的必要性,第三步：将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为,转化,常用的受体细胞：,动植物细胞和,大肠杆菌,、枯草杆菌、酵母菌等微生物。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染,双子叶,植物和,裸子,植物，受植物体伤口处的细胞分泌的,大量,酚类化合物,的吸引，农杆菌中的,Ti,质粒,上的,T-DNA,可转移至受体细胞，并整合到受体细胞,染色体的,DNA,上。,1,）将目的基因导入植物细胞,a.,农杆菌转化法（采用最多的方法）,原理：将,目的基因,插入到,Ti,质粒的,T-DNA,上,，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞,染色体的,DNA,上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。,优点及应用：此法比较经济和有效，约,80%,的转基因植物都是通过这种方法获得。,我国科学家独创的一种方法,实例：,我国的,转基因抗虫棉,（,1,）,常用于,单子叶植物,的基因,转化,（,2,）,缺点：,成本较高,基因枪法,花粉管通道法,2,）将目的基因导入动物细胞,提纯基因表达载体,体外显微注射入受精卵,经胚胎早期培养后,移植到雌性体内,受体细胞：,显微注射技术,基本操作程序：,原因是：,受精卵全能性较高，可使外源基因在相应的组织细胞内表达。,受精卵,最常用的方法,:,1,）,早期基因工程为什么选用原核生物作为受体细胞？,原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,2,）应用最为广泛的受体细胞是,大肠杆菌,3,）,方法,：,3,）将目的基因导入微生物细胞,a.,用,Ca,2+,处理细胞,（,以增加细菌细胞壁的通透性）,，使细胞处于一种,能吸收周围环境中,DNA,分子,的生理状态，这种细胞称为,感受态细胞,；,b.,是将,重组表达载体,DNA,分子,溶于,缓冲液,中,与,感受态细胞混合,，在一定的,温度,下促进感受态细胞吸收,DNA,分子，完成转化过程。,思考,4:,利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗,?,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成,.,大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的,.,1.,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,2.,将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,（最多、最有效）,3.,将目的基因导入微生物细胞,Ca,2+,处理,花粉管通道法,小结,基因工程操作步骤的必要性,目的基因的获取；,表达载体的构建；,将目的基因导入受体细胞；,目的基因的检测与鉴定。,因为并不是所有受体细胞的,DNA,都接纳了目的基因、也并不是所有插入的目的基因都能正确表达，因此需要,筛选。只有通过检测和鉴定，才能得知目的基因是否,能够在受体细胞中稳定存在和正确表达。,温故知新,为什么要有这一步,第四步：目的基因的检测和鉴定,检测转基因生物的染色体,DNA,上是否插入了目的基因,DNA,分子杂交,DNA,分子杂交技术,【,小组交流,】,阅读教材,14,页，讨论,什么是,DNA,分子探针？,检测时探针通过什么原理来检测目的基因？,探针,是一小段单链,DNA,或者,RNA,片段（,约,20,到,500bp,），用于检测与其互补的核酸序列。,根据重组质粒上目的基因的部分,DNA,序列，人工合成（或,PCR,技术合成）与之互补的一小段单链,DNA,（或,RNA),利用带有,32P-,磷酸的,dATP,使其标记上放射性同位素，这一小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为,DNA,探针,。,什么是,DNA,分子探针？,DNA,分子杂交技术,互补碱基序列的,DNA,分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。,DNA,分子杂交的双方是所使用的,探针,和,要检测的核酸,DNA,分子杂交的理论基础是：,基因探针与目的基因杂交，观察标记有无杂交带,将标记的核酸探针与,细胞或组织中,的核酸进行杂交,不能，受体细胞必须合成相应的蛋白质或表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了,表达,。,受体细胞摄入,DNA,分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,第四步：目的基因的检测和鉴定,检测转基因生物的染色体,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原,抗体杂交,分子水平检测,抗原,抗体杂交,从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行,抗原,抗体杂交,，若有,杂交带,出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。,以上检测是,分子,水平，有时还需进行,个体生物学,水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等。,第四步：目的基因的检测和鉴定,检测转基因生物的染色体,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,是否赋予个体新的遗传特性,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原,抗体杂交,分子水平检测,个体,水平,鉴定,基因工程的基本操作程序,1,、目的基因的获取,2,、形成重组,DNA,分子；,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、筛选含有目的基因的受体细胞、,目的基因表达,1,、从基因文库中获取目的基因,2,、利用,PCR,技术扩增目的基因,3,、化学方法人工合成,农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、,Ca,2+,处理法,DNA,分子杂交技术、抗原,抗体杂交技术,分子检测外的个体水平鉴定,小结,将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的香蕉细胞通过组织培养形成植株。,生态安全问题包括：,外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；,转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；,转基因植株扩散对生物多样性的影响；,转基因植物残体或分泌物对环境的影响。,如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点）,cDNA,成熟的编码蛋白的,mRNA,分子,加入逆转录酶，反转录,mRNA,，合成一条与其互补的,DNA,单链分子,在,DNA,聚合酶的作用下，以第一条,DNA,单链为模板合成第二条单链,知识扩展,基因的结构,真核生物基因结构,原核生物基因结构,真核生物基因控制蛋白质合成的过程,RNA,聚合酶结合位点,非编码区,编码区,非编码区,外显子,外显子,内含子,内含子,外显子,A,B,C,D,E,真核生物基因的结构,A,B,C,D,E,A,C,E,加工,翻译,初级,RNA,mRNA,蛋白质（多肽）,基因控制蛋白质的合成,转录,所谓,文库，,是指一种全体的集合,。,基因文库,则是指某一生物全部基因的集合。,构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是,分离克隆目的基因,的主要途径。,对于复杂的染色体,DNA,分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。,难点释疑,基因文库,基因组文库,与,cDNA,文库？,基因组文库：,包含,某种,生物所有基因,的文库。,（生物体的全部,DNA,经酶切,而成,的所有,DNA,片段,，分别与载体连接，导入受体菌的群体储存。这个群体就叫做这种生物的基因组文库。,）,cDNA,文库：只包含部分基因,的文库,生物体发育中某时期的,mRNA,，经,反转录,产生的,互补,DNA,片段,（,cDNA,），,与载体连接后所储存的一个受体菌群中。,表达产物检测：,将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,无表达产物,无表达产物,有表达产物,无表达产物,循环,变性,退火,延伸,结果：使目的基因在短时间内成百万倍的扩增,目的基因以,指数,方式扩增，即,2,n,四环素,抗性基因,氨苄青霉,素抗性基因,荧光染料标记,DNA,探针与目的基因杂交,用化学发光检测仪,进行有无标记的检测,