发酵花生乳的菌种筛选、驯化和工艺优化.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 1476发酵花生乳的菌种筛选、驯化和工艺优化李雅静1，刘江1，何琴1，杨芳2，史巧2，李宏2*，王振兴1*（1西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224；2云南省农业科学院农产品加工研究所，云南昆明650221）摘要：【目的】筛选和驯化适宜发酵花生乳的菌种，并对花生乳的发酵工艺进行优化，为花生的发酵生产提供参考依据。【方法】利用保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌分别对云南红皮小花生进行发酵。以发酵后花生乳的组织状态、发酵风味和酸度为指标，筛选花生乳发酵的最适菌种并进行驯化，再通过单因素试验和响应面法优化花生乳的发酵工艺，以酸度和感官评分为评价指标。【结果】筛选得到保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌适用于发酵花生乳，比例为1 1；经驯化后的菌种发酵花生乳的凝乳时间较驯化前缩短1.5 h。在此基础上进一步优化发酵条件，建立发酵花生乳的酸度（Y1）和感官评分（Y2）对接种量（A）、加糖量（B）、料水比（C）及发酵时间（D）的二次回归方程：Y1=72.36+10.01A-3.57B+0.2525C+11.06D-1.53AB-0.915AC+0.5325AD-1.84BC-1.83BD-1.07A2-7.24B2-8.88C2-14.38D2；Y2=86.22+4.58A-1.02B+0.6917C+4.76D-1.65AB-0.6750AC+2.27AD-0.75BC-0.4BD+2.0CD-3.55A2-4.21B2-2.84C2-5.26D2。各因素对发酵花生乳酸度和感官评分的影响顺序均为发酵时间接种量加糖量料水比。其中，接种量与加糖量、加糖量与料水比、加糖量与发酵时间的交互作用对发酵花生乳的酸度影响显著（P0.05，下同）；接种量与加糖量、接种量与发酵时间、料水比与发酵时间的交互作用对发酵花生乳的感官评分影响极显著（Pinoculum sizesugar amountliquid-solid ratio，and the interaction between inoculum size and sugaramount，sugar amount and liquid-solid ratio，sugar amount and fermentation time on the acidity of fermented peanut milkwas significant（P0.05，the same below），while extremely significant effect was observed for the interaction between in-oculum size and sugar amount，inoculum size and fermentation time，liquid-solid ratio and fermentation time on peanutmilk sensory score（P0.01），and the interaction between inoculum size and liquid-solid ratio，sugar amount and liquid-solid ratio had significant effects on sensory scores of fermented peanut milk.The optimized process parameters were：6%inoculum，5%sugar content，1 8 for the ratio of material to water，and 11 h fermentation time.Under this condition，theacidity of fermented peanut milk was 74.37 T，the sensory score was 86.7，these were close to the theoretical prediction.Peanut milk curd is better，the color is milky yellow.【Conclusion】The most suitable strains for fermenting peanut milkhave been screened and acclimated，and the best fermented peanut milk process has been obtained by using response sur-face optimization，and fermented peanut milk product enjoys suitable acidity，high sensory score，and good flavor.Thispaper can provide guidance for the development and production of healthy peanut products.Key words：fermented peanut milk；strain screening；domestication；acidity；sensory score；response surface opti-mizationFoundation items：National Natural Science Foundation of China（31760440）；Yunnan Xingdian Talent SupportPlan for Young Talents（XDYC-QNRC-2022-0166）；Scientific Research Fund Project of Education Department of Yunnan（2022J0507）；Open Fund ofAgricultural Products Processing Institute ofYunnanAcademy ofAgricultural Sciences（2021）李雅静等：发酵花生乳的菌种筛选、驯化和工艺优化54卷南 方 农 业 学 报 1478植物乳杆菌（Lp）和嗜热链球菌（St）购自广东省微生物菌种保藏中心；MRS肉汤培养基购自广东环凯生物科技有限公司。主要仪器设备：DH6000B电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、SW-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）和FJ200-SH实验室数显高速分散均质机（上海泸析实业有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌种活化在无菌操作台，将Lb、Lc、Lp和St 4种乳酸菌分别接种于MRS肉汤培养基中，37 培养12 h（韩雪等，2018）。1.2.2菌种筛选将花生乳和牛乳按1 1的比例混合均匀，加入8%（m/v）的蔗糖搅拌溶化，等量分装4支试管，在95 下高压蒸汽灭菌10 min，迅速冷却后分别以4%（v/v）的接种量将活化后的菌种接种，并于37 培养8 h，4 后熟12 h。综合凝乳的组织状态、发酵风味和酸度指标评价4种菌种的发酵效果，选择发酵效果较好的2株菌种进行驯化和复配（马明等，2022）。1.2.3菌种驯化在牛乳中加入3%（m/v）的葡萄糖，与花生乳按花生乳 牛乳体积比分别为0 10、2 8、4 6、6 4、8 2和10 0（分别记为花生乳浓度0、20%、40%、60%、80%和100%）混合均匀，分别装入标号为的试管，每支10 mL，95 灭菌10 min，冷却得到菌种驯化培养液。将筛选出的乳酸菌接种至号培养液中，37 培养，待凝固后在号培养液中传代1次，再接种至号培养液中，依次接种，在号培养液中得到驯化后的乳酸菌。将驯化后的菌株按不同比例复配后用于花生乳发酵（谢小瑜，2019）。1.2.4花生乳发酵工艺流程选取无虫害、无霉变的优质花生，在恒温鼓风干燥器中100 烘烤20 min（张建萍等，2020），冷却后手工去皮，纯水浸泡2 h后将花生仁和水按不同比例打浆，用纱布过滤，滤液按不同比例加入蔗糖调配均匀，之后在均质压力20 MPa、60 下均质至花生乳无明显颗粒感（刘晶晶等，2015），再经95 灭菌10 min，冷却至常温后接种发酵菌种，在恒温培养箱中37 发酵10 h，4 后熟10 h，得到发酵花生乳，4 冷藏备用。1.2.5单因素试验在花生乳料水比为1 8（g/mL，下同）、蔗糖含量8%的工艺条件下，95 灭菌10 min，冷却后将筛选得到并经驯化后的2株菌种分别按1 3、1 2、1 1、2 1和3 1的体积比进行复配，并按4%的接种量接种于花生乳中，经37 培养10 h后，考察菌种配比对发酵花生乳酸度的影响。同时，考察发酵时间（2、4、6、8、10、12和14 h）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%）、料水比（1 4、1 6、1 8、110和112）、加糖量（2%、4%、6%、8%和10%）和糖类型（6%蔗糖、3%葡萄糖+3%蔗糖、3%乳糖+3%蔗糖）对发酵花生乳酸度的影响。1.2.6响应面优化试验在单因素试验的基础上，选取接种量、加糖量、料水比和发酵时间作影响因素，以酸度和感官评分为评价指标，使用Design-Expert.v8.0.6进行4因素3水平试验设计（表1），优化花生乳发酵工艺。表 1响应面因素与水平Table 1Response surface experiment design factors and levels因素FactorA：接种量（%）Inoculum sizeB：加糖量（%）Sugar amountC：料水比 Liquid-solid ratioD：发酵时间（h）Fermentation time水平 Level-1241 680461 8101681 10121.2.7酸度测定参照GB/T 5009.2392016 食品安全国家标准 食品酸度的测定 测定发酵花生乳的酸度。1.2.8花生乳感官评价标准邀请10位食品科学与工程专业的大四学生，男、女各5名，分别从花生乳的组织状态（40分）、发酵风味（40分）和色泽（20分）3个方面进行打分（表2），总分100分，去掉1个最低分和1个最高分，计算平均分，即为该样品的最终感官评分（徐海祥等，2020）。1.3统计分析采用Design-Expert.v8.0.6设计响应面，SPSS19.0对试验数据进行统计分析，以Origin 2018制图。2结果与分析2.1菌种筛选结果2.1.1菌种发酵结果用Lc、Lb、Lp和St发酵花生乳的结果如表3所示，Lc和Lb发酵的花生乳凝乳状态好、乳清析出量少，且酸度高于Lp和St发酵的花生乳，故选用Lc和Lb发酵花生乳。2.1.2Lb和Lc的驯化结果由图1可知，花生乳浓度对Lb和Lc驯化前的凝乳时间有较大影响，对驯化后的凝乳时间影响相对较小。驯化前，随着花生乳浓度的增加，Lb和Lc的凝乳时间逐渐延长，当花生乳浓度为100%时，凝乳时间分别达8.0和7.0 h；驯化后，随着花生乳浓度的增加，Lb凝乳时间缓慢延长，花生乳浓度为100%时，凝乳时间为6.5 h，而花生乳浓度对Lc凝乳时间影响较小，花生乳浓度为100%时，凝乳时间为5.5 h。对于纯花生乳的发酵，驯化后5期1479的凝乳时间较驯化前缩短1.5 h。2.1.3Lb与Lc的驯化产酸结果由图2可知，花生乳浓度对2种菌种的发酵产酸有一定影响，随着花生乳浓度的增加，Lb驯化前产酸呈下降趋势，驯化后产酸先上升后下降，在花生乳浓度为20%时酸度达峰值；Lc驯化前后的产酸均呈先上升后下降的变化趋势，在花生乳浓度为40%时酸度达峰值。总体而言，Lb和Lc驯化后的产酸效果优于驯化前。2.2单因素试验结果2.2.1Lb与Lc不同比例对发酵花生乳的影响由表4可知，在Lb与Lc比例为1 1时，花生蛋白乳凝乳较好，乳清少，发酵味良好，酸度适宜，相较于其他接种比例感官评分最高，因此选用Lb Lc=1 1发酵花生乳。2.2.2发酵时间对发酵花生乳的影响由表5可知，随着发酵时间的延长，发酵花生乳的酸度持续增加，发酵6 h时开始凝乳，有大量乳清析出，酸度为33.33 T；发酵8 h时凝乳良好，但乳清量多，酸度为40.00 T；当发酵10、12和14 h时，发酵状态接近，发酵花生乳凝乳好，乳清少，且花生乳组织状态均匀，质地细腻，表面光滑无气泡，酸度分别为59.67、63.33和70.00 T。综合生产成本等因素，选用10 h为最佳菌种StrainLcLbLpSt组织状态Tissue status凝乳好，无乳清凝乳好，乳清少凝乳差，乳清多凝乳差，乳清多发酵风味Fermentation flavor较浓较淡较浓较淡酸度（T）Acidity88.0080.0040.0072.00综合评价Comprehensive assessment较好良好差差表 3Lc、Lb、Lp和St发酵花生乳的结果Table 3Fermentation results of Lc，Lb，Lp and St of fermented peanut milk图 1驯化对Lb和Lc凝乳时间的影响Fig.1Effects of domestication on curdling time in Lb and Lc折线上同一花生乳浓度下不同小写字母表示菌种驯化前后差异显著（P0.05）。图2同Different lowercase letters on the polyline at the same concentration of peanut milk indicated significant difference in curdling time before and afterstrain domestication（P0.05）.The same was applied in Fig.28.58.07.57.06.56.05.5凝乳时间（h）Curdling time花生乳浓度（%）Peanut milk concentration花生乳浓度（%）Peanut milk concentration7.57.06.56.05.55.04.5凝乳时间（h）Curdling timeLb驯化前 Before Lb domesticationLb驯化后After Lb domesticationLc驯化前 Before Lc domesticationLc驯化后After Lc domestication020406080100020406080100babbaaabba评定项 Item组织状态（60分）Tissue status（60 scores）发酵风味（40分）Fermentation flavor（40 scores）色泽（20分）Color（20 scores）评分标准 Scoring criteria凝乳好，无乳清凝乳好，乳清少凝乳差，乳清多发酵味较好发酵味良好发酵味一般发酵味欠佳颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色较淡颜色分布均匀，呈乳白色颜色分布不均，呈乳白色分值范围（分）Score range（score）416021400203140213011200101620111561005表 2感官评分标准Table 2Sensory rating criteria李雅静等：发酵花生乳的菌种筛选、驯化和工艺优化54卷南 方 农 业 学 报 1480发酵时间。2.2.3接种量对发酵花生乳的影响由表6可知，当接种量为1%和2%时，发酵花生乳凝乳不均匀，且酸度低，发酵味欠佳；当接种量为3%和4%时，发酵花生乳的发酵状态相近，凝乳较好，乳清少，但4%的接种量酸度高于3%，且发酵味较好；当接种量为5%和6%时，发酵花生乳凝乳好，感官评分高，但有较多的乳清析出；当接种量为7%时，发酵花生乳的发酵味一般，且有大量乳清析出。综合各个因素，选用4%的接种量发酵花生乳。2.2.4料水比对发酵花生乳的影响由表7可知，随着水分比例的增大，发酵花生乳的酸度和感官评分均呈先升高后降低的变化趋势，当料水比为1 4时，发酵花生乳凝乳良好，无乳清析出，但酸度过低；当料水比为1 6和1 8时，发酵花生乳凝乳好，乳清析出少，酸度适宜，感官评分高；当料水比为110和112时，发酵花生乳的凝乳状态差，且有较多乳清析出。综合以上因素和生产成本，选取最佳料水比接种量（%）Inoculum size1234567酸度（T）Acidity21.6730.3339.0052.0060.6765.0073.67发酵状态Fermentation state凝乳良好，乳清很少，颜色分布不均，呈乳白色，发酵味欠佳凝乳良好，乳清少，颜色分布不均，呈乳白色，发酵味欠佳凝乳较好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳白色，发酵味良好凝乳较好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳白色，发酵味较好凝乳良好，乳清稍多，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳良好，大量乳清，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳良好，大量乳清，颜色分布均匀，呈乳白色，发酵味一般感官评分（分）Sensory score（score）58.063.076.079.082.080.075.0Lb与Lc比例Rate of Lb and Lc1 31 21 12 13 1酸度（T）Acidity47.0056.6662.3456.6651.00发酵状态Fermentation state凝乳良好，乳清很少，发酵味欠佳，颜色分布不均匀凝乳较好，乳清少，发酵味一般，颜色分布均匀，黄色较淡凝乳较好，乳清少，发酵味良好，颜色分布均匀，呈乳黄色凝乳较好，乳清稍多，发酵味较好，颜色分布均匀，呈乳黄色凝乳良好，乳清稍多，发酵味良好，颜色分布均匀，黄色较淡感官评分（分）Sensory score（score）63.076.081.079.074.0发酵时间（h）Fermentation time2468101214酸度（T）Acidity16.6723.3333.3340.0059.6763.3370.00发酵状态Fermentation state未凝乳，发酵味欠佳，颜色分布不均，呈乳白色微凝乳，发酵味欠佳，颜色分布不均，呈乳白色凝乳良好，大量乳清，发酵味欠佳，颜色分布均匀，呈乳白色凝乳良好，乳清多，发酵味欠佳，颜色分布均匀，呈乳白色凝乳好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色较淡凝乳好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显凝乳好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显感官评分（分）Sensory score（score）54.062.069.071.080.078.079.0图 2驯化对Lb和Lc产酸的影响Fig.2Effects of domestication on acid production in Lb and Lc表 4Lb与Lc不同比例对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响Table 4Effects of different rates of Lb and Lc on acidity and fermentation state of fermented peanut milk表 5发酵时间对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响Table 5Effects of fermentation time on acidity and fermentation state of fermented peanut milk表 6接种量对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响Table 6Effects of inoculum size on acidity and fermentation state of fermented peanut milk120.0100.080.060.040.020.0酸度（T）Acidity花生乳浓度（%）Peanut milk concentrationLb驯化前 Before Lb domesticationLb驯化后After Lb domestication020406080100babba130.0120.0110.0100.090.080.070.060.0酸度（T）Acidity花生乳浓度（%）Peanut milk concentration020406080100aaabbbabbaaaabbbaLc驯化前 Before Lc domesticationLc驯化后After Lc domestication5期1481为1 8。2.2.5加糖量对发酵花生乳的影响由表8可知，随着加糖量的增加，发酵花生乳的酸度先升后降，当加糖量为6%时，花生乳凝乳好，乳清少，酸度（66.67 T）和感官评分（76.0分）最高，故选用6%的加糖量来发酵花生乳。2.2.6糖类型对发酵花生乳的影响由表9可知，在糖的总添加量为6%时，添加不同种类的糖发酵花生乳，以6%蔗糖发酵花生乳凝乳好，但乳清多、口感差、感官评分低，可能与Lb不能分解利用蔗糖有关（郑鸿雁，2004）；添加3%葡萄糖+3%蔗糖和添加3%乳糖+3%蔗糖的发酵状态相似，但添加3%葡萄糖+3%蔗糖发酵的花生乳口感好，感官评分高；考虑到乳糖价格高于葡萄糖，且不适于乳糖不耐症患者食用（Leis et al.，2020），故添加糖的类型选择3%葡萄糖+3%蔗糖。2.3响应面试验结果2.3.1影响酸度和感官评分的响应面设计与分析在单因素试验的基础上，利用Design-Expert.v8.0.6对影响花生乳酸度（Y1）和感官评分（Y2）的因素进行响应面试验设计（表10），对模型进行方差分析（表11和表12），建立回归方程：Y1=72.36+10.01A-3.57B+0.2525C+11.06D-1.53AB-0.915AC+0.5325AD-1.84BC-1.83BD-1.07A2-7.24B2-8.88C2-14.38D2Y2=86.22+4.58A-1.02B+0.6917C+4.76D-1.65AB-0.6750AC+2.27AD-0.75BC-0.4BD+2.0CD-3.55A2-4.21B2-2.84C2-5.26D2由表11和表12可知，酸度和感官评分模型极显著（P0.05，下同），决定系数分别为0.9949和0.9948，校正系数分别为0.9898和0.9897，表明模型与实际情况拟合良好，适合用于分析并预测发酵花生乳最优酸度和感官评分的工艺条件。2.3.2因素间交互作用分析由图3可直观看出各因素对发酵花生乳酸度的交互作用，AB、BC和BD的等高线呈椭圆形，表明两因素交互作用显著（P接种量加糖量料水比。由图4可直观看出各因素对发酵花生乳感官评分的交互作用，AB、AC、AD、BC和料水比Liquid-solid ratio1 41 61 81 101 12酸度（T）Acidity42.0060.6660.6651.3446.66发酵状态Fermentation state凝乳良好，无乳清，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色较淡，发酵味良好凝乳好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳良好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳差，乳清较多，发酵味欠佳，颜色分布均匀，呈乳白色微凝乳，有大量乳清，发酵味欠佳，颜色分布不均，呈乳白色感官评分（分）Sensory score（score）77.082.081.078.071.0表 7料水比对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响Table 7Effects of liquid-solid ratio on acidity and fermentation state of fermented peanut milk表 8加糖量对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响Table 8Effects of sugar amount on acidity and fermentation state of fermented peanut milk表 9糖类型对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响Table 9Effects of sugar types on acidity and fermentation state of fermented peanut milk加糖量（%）Sugar amount246810酸度（T）Acidity42.6753.3366.6753.3353.33发酵状态Fermentation state凝乳好，乳清较多，颜色分布不均，呈乳白色，发酵味欠佳凝乳良好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳白色，发酵味欠佳凝乳良好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳良好，乳清多，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳良好，乳清多，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好感官评分（分）Sensory score（score）65.072.076.073.074.0糖类型Sugar type6%蔗糖 6%sucrose3%葡萄糖+3%蔗糖3%glucose+3%sucrose3%乳糖+3%蔗糖3%lactose+3%sucrose酸度（T）Acidity40.0056.6750.00发酵状态Fermentation state凝乳好，乳清较多，颜色分布不均，呈乳白色，发酵味欠佳凝乳良好，乳清少，颜色分布均匀，呈乳黄色，黄色明显，发酵味良好凝乳良好，乳清多，颜色分布均匀，呈乳白色，发酵味一般感官评分（分）Sensory score（score）55.077.062.0李雅静等：发酵花生乳的菌种筛选、驯化和工艺优化54卷南 方 农 业 学 报 1482CD的等高线呈椭圆形，表明两因素的交互作用对发酵花生乳的感官评分有显著或极显著影响，BD的等高线更类似于圆形，表明两因素的交互作用对发酵花生乳的感官评分影响不显著；根据系数估计值A=4.58、B=1.02、C=0.69和D=4.76，可知影响发酵花生乳感官评分因素的主效应关系：发酵时间接种量加糖量料水比。2.3.3工艺条件优化及验证试验 GB 193022010 食品安全国家标准 发酵乳 质量要求发酵乳酸度大于70 T；据报道，发酵花生乳酸度在7080 T较易被人们接受（徐海祥等，2020；黎世灵等，2021）；同时综合分析响应面试验结果，并依据回归模型，预测发酵花生乳酸度在76 T的工艺参数：接种量6%、加糖量5.89%、料水比1 8.71、发酵时间10.57 h；预测感官评分最佳的发酵花生乳工艺参数：接种量6%、加糖量5.24%、料水比1 8.62、发酵时间11.48 h，在此工艺条件下发酵花生乳的感官评分为90.4分。为验证试验可靠性，并考虑试验的可操作性，综合酸度和感官评分的预测工艺参数，将工艺参数修正为：接种量6%、加糖量5%、料水比1 8、发酵时间11 h，进行3次平行验证测试，发酵花生乳的平均酸度为74.37 T，感官评分为86.7分，酸度适宜，凝乳较好，色泽呈乳黄色，因此选取此工艺参数发酵花生乳饮料。3讨论发酵花生乳的产品特性与发酵菌种密切相关，且影响花生乳发酵效果的因素众多，因此，筛选适合发酵的菌种、优化发酵条件，对提高花生发酵乳的品质至关重要。本研究以云南红皮花生为原料，选用4种乳酸菌发酵花生乳，分别为Lb、Lc、Lp和St。4种乳酸菌均广泛应用于发酵乳制品，具有不同作用功试验序号Test number1234567891011121314151617181920212223242526272829因素 FactorA00100-10-10-1000-1100001-1011100-10B10000-1-10-10-10-10-110100000010110C1-1001010-10000-100-1-10110-1001000D01-10100-10110-100-1-100000010-1100Y1：酸度（T）Acidity47.6651.3447.6673.3458.5547.6658.6630.2555.0051.3466.0072.1240.3444.0069.6636.6636.6651.3474.5666.0047.6670.8866.0073.3462.3438.5055.0044.0072.12Y2：感官评分（分）Sensory score（score）78.080.075.085.085.373.081.870.078.875.283.387.372.774.085.371.075.078.086.384.376.786.784.389.380.772.380.075.085.8表 10响应面设计及结果Table 10Response surface design and results表 11酸度的模型方差分析结果Table 11Analysis of variance of acidity model*表示影响显著（P0.05）；*表示影响极显著（P0.01）。表12同*represented significant influence（P0.05）；*represented extremely significant influence（P0.01）.The same was applied in Table 12方差来源 Source of variance模型 ModelABCDABACADBCBDCDABCD残差 Residual失拟项 Lack of fit纯误差 Pure error总变异 Total variation平方和 Sum of squares4757.321201.80152.510.76511467.449.363.351.1313.4713.404.60340.34512.04598.241340.8124.3613.2611.094781.67自由度 df14111111111111111410428均方 Mean square339.811201.80152.510.76511467.449.363.351.1313.4713.404.60340.34512.04598.241340.811.741.332.77F195.31690.7487.660.4397843.425.381.920.65197.747.702.64195.61294.30343.84770.640.4783P0.00010.00010.00010.51800.00010.03600.18700.43290.01470.01490.12620.00010.00010.00010.00010.8431显著性 Significance*5期1483效，如Lb具有调节肠道菌群平衡、提高免疫力的作用（陈世伟，2021）；Lc具有缓解腹泻、调节免疫反应的功效；Lp具有较强的分解脂肪形成游离脂肪酸能力，且能抑制一些常见病原体的生长（闫雍雍等，2022）；St发酵可生产胞外多糖、细菌素和维生素，增强酸奶等产品的奶油味和口感。单因素试验结果表明，Lb和Lc发酵的花生乳酸度高于Lp和St，因此选用Lb和Lc发酵花生乳。通过逐渐增加花生乳浓度对Lb和Lc进行驯化，结果表明，驯化后的菌种发酵花生乳的凝乳时间较驯化前缩短1.5 h，有效提高Lb和Lc的发酵能力。驯化可以有目的地提高和强化菌种的某种性状，对于后续优化发酵产品有重要意义。谢小瑜（2019）在大米红枣混合饮料发酵菌种的驯化研究中发现，驯化对发酵菌在大米红枣混合汁环境中的生长和发酵有促进作用，本研究结果也证实了该结论。进一步将驯化后的Lb和Lc复配用于发酵，结果表明Lb与Lc比例为1 1适用于发酵花生乳，究其原因可能是由于Lb与Lc有协同作用；秦南冰等（2011）、李苏红等（2012）也报道了类似结果，即Lb在培养过程中可促进St生长，而St在生长过程中会代谢一些促进Lb酸化的活性物质。基于菌种筛选和驯化的结果，采用单因素试验考察菌种的接种量、料水比、加糖量、糖类型和发酵时间等关键因素对发酵花生乳酸度及发酵状态的影响。一般来说，接种量过低，会导致花生乳发酵不完全，接种量过高，发酵体系中的营养物质不足以提供发酵菌的生长代谢。本研究结果表明，接种量为4%时发酵的花生乳酸度较高，凝乳效果好；此外，料水比对发酵结果有较大影响，添加一定量的水可使发酵体系中的蛋白质和多糖水解为微生物易吸收的小分子物质，促进产酸，但添加水分含量过大时，会导致蛋白质和糖浓度降低，抑制微生物的生长（秦朗等，2021）。本研究发现，当料水比为1 8时发酵花生乳凝乳好，酸度适宜，感官评分高；乳酸菌会分解糖类产生乳酸，使花生乳酸度升高（何家乐等，2021），但糖用量过大会使发酵体系的渗透压增大、黏度增高，从而抑制乳酸菌的生长（胡玢，2017），因此加糖量也是发酵花生乳的重要影响因素。当加糖量为6%时，花生乳凝乳好，酸度（66.67 T）和感官评分（76.0分）最高；同时发现，添加3%葡萄糖+3%蔗糖和添加3%乳糖+3%蔗糖的发酵状态相似，但考虑到乳糖不适于乳糖不耐症患者食用，所以选择3%葡萄糖+3%蔗糖用于发酵。发酵时间也是发酵产品品质的重要影响因素，在发酵过程中，随着发酵时间的延长，发酵花生乳会释放特有的风味和芳香物质（田佳乐，2021），但发酵时间过短会导致发酵风味不足，凝乳不完全、酸度低；发酵时间过长会导致大量乳酸菌生长，乳清析出，酸度过高（王婷，2013）。本研究发现，当发酵时间为10 h时，花生乳状态良好，组织均匀，质地细腻，表面光滑无气泡，酸度为59.67 T。为进一步确定花生乳的发酵工艺，在单因素试验的基础上，选择菌种的接种量、加糖量、料水比和发酵时间为影响因素，以酸度和感官评分为评价指标，基于Box-Behnken Design响应面模型确定花生乳饮料的最佳发酵工艺。考虑到人们适宜接受的酸度范围为7080 T（徐海祥等，2020；黎世灵等，表 12感官评分的模型方差分析结果Table 12Analysis of variance of sensory scoring model方差来源 Source of variance模型 ModelABCDABACADBCBDCDABCD残差 Residual失拟项 Lack of fit纯误差 Pure error总变异 Total variation平方和 Sum of squares879.79252.0812.405.74271.7010.891.8220.702.250.64016.0081.82114.5152.29179.754.561.493.07884.35自由度 df14111111111111111410428均方 Mean square62.84252.0812.405.74271.7010.891.8220.702.250.640016.0081.82114.5152.29179.750.32540.14870.7670F193.13774.7038.1217.64834.9933.475.6063.626.911.9749.17251.46351.92160.69552.410.1939P0.00010.00010.00010.00090.00010.00010.03290.00010.01980.18260.00010.00010.00010.00010.00010.9838显著性 Significance*李雅静等：发酵花生乳的菌种筛选、驯化和工艺优化54卷南 方 农 业 学 报 1484图 3接种量、加糖量、料水比和发酵时间对发酵花生乳酸度的交互影响Fig.3Interaction effects of inoculum size，sugar amount，solid-liquid ratio and fermentation time on acidity of fermentedpeanut milk酸度（T）AcidityA：接种量（%）Inoculum sizeA：接种量（%）Inoculum