多脂鳞伞P-YD01的菌丝生物学特性及引种驯化栽培试验.pdf

山东农业大学学报(自然科学版),2023,54(5):650-656VOL.54 NO.5 2023Journal of ShandongAgricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.002多脂鳞伞多脂鳞伞 P-YD01 的菌丝生物学特性及引种驯化栽培试验的菌丝生物学特性及引种驯化栽培试验吴耀越,程欣荣,黄宇柯,朱仁启,陈文思,张大川,初 洋*烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005摘摘 要要:对采自烟台大学校园的一株多脂鳞伞(P-YD01)进行了形态学及 ITS 序列分析鉴定，并对其菌丝生物学特性、最佳培养基配方及驯化栽培进行等进行了研究。结果表明，P-YD01 的最适碳源、氮源分别为 D-果糖、牛肉膏，最佳培养温度为 25-30，最适生长 pH 在 5.0。研究发现 P-YD01 以玉米粉作为母种培养基时生长最快，最适出菇季节应为秋冬季，最适栽培培养基为棉籽壳培养基。搔菌操作可以明显提高多脂鳞伞其出原基整齐度和子实体匀称度。关键词关键词:多脂鳞伞;菌丝生物学特性;培养基;驯化;栽培中图法分类号中图法分类号:S736.15文献标识码文献标识码:A文章编号文章编号:1000-2324(2023)05-0650-07Mycelial Biological Characteristics and Domestication,CultivationExperiment of Pholiota adiposaP-YD01WU Yao-yue,CHENG Xin-rong,HUANG Yu-ke,ZHU Ren-qi,CHEN Wen-si,ZHANG Da-chun,CHU Yang*College of Life Sciences/Yantai University,Yantai 264005,ChinaAbstract:A strain of Pholiota adiposa(P-YD01)taken from the campus of Yantai University was analyzed and identified bymorphological identification and ITS sequence analysis,and its mycelial biological characteristics,optimal mediumformulation and domestication and cultivation were studied.The results show that the optimal carbon and nitrogen sources ofP-YD01 are D-fructose and beef extract,and the optimal culture temperature is 25C-30C,and the optimal growth pH is at5.0.It is found that P-YD01 grows fastest in cornmeal primary medium,the optimal mushroom season should be fall,and theoptimal cultivation medium is cottonseed shell medium.In addition,scratching mycelium operation for Pholiota adiposa cansignificantly improve its primodium emergence neatness and fruiting body homogeneity.Keywords:Pholiota adiposa;mycelial biological characteristic;culture medium;domestication;cultivation大型真菌，又称蕈菌，在自然界中种类繁多，分布广泛，且具有丰富营养1,2。同时，许多野生大型真菌具有药用价值，可用于治疗疾病和提高免疫力3。野生菌的采摘、加工和销售都是一种重要的产业，可创造就业机会和增加经济收入4.多脂鳞伞是鳞伞属（Pholiota）的一种大型真菌，具有丰富的营养，是一种高蛋白低脂肪的健康食品5。此外，多脂鳞伞还有较高的药用价值。Peng Deng 等在其胞内多糖的体外抗氧化实验中，发现多脂鳞伞胞内多糖是一种有潜力的可增强特异性免疫的抗氧化剂6；贺智杰等同样发现多脂鳞伞具有良好的抗氧化活性和对小鼠免疫的调节功能7；Basaran Dulger 探究了多脂鳞伞提取物的抗菌活性，实验发现其 60%甲醇提取物对包括大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在内的六种细菌以及两种酵母具有抑制作用8；多脂鳞伞的多糖成分和麦角固醇类衍生物被证实具有抗糖尿病活性9,10；另外，其多糖亦对小鼠 H22 肝癌细胞具有抑制作用11。提取自多脂鳞伞的多种酶类，亦在生产上可发挥重要作用12,13。关于多脂鳞伞的栽培研究，国内最早可检索到杨占国等和苗长海在 1985 年进行的试验14,15。总体来看，相关研究较少且大多集中在较为基础的菌丝生物学特性方面16-18，但关于具体栽培技术研究较少且不够深入。本文在研究了菌丝生物特性的基础上，进一步探究其具体栽培技术，并将菌丝生物学研究的成果与栽培技术相融合。旨在探明完整且较优的多脂鳞伞栽培体系，一定程度上填补了相关栽培技术的空白。收稿日期收稿日期:2023-07-17修回日期修回日期:2023-11-11基金项目基金项目:烟台大学大学生创新实践训练计划(X202211066081)第第 1 作者简介作者简介:吴耀越(2001-),男,本科生在读,研究方向为食用菌栽培.E-mail:L*通讯作者通讯作者:Author for correspondence.E-mail:第 5 期吴耀越等:多脂鳞伞 P-YD01 的菌丝生物学特性及引种驯化栽培试验6511材料与方法材料与方法1.1供试菌株供试菌株野生多脂鳞伞采自于烟台大学校园中的一棵柳树上。组织分离后保存菌种，编号为 P-YD01。1.2实验用培养基实验用培养基1.2.1 基础培养基 基础培养基配方:葡萄糖 20 g，蛋白胨 3 g，琼脂 20 g，KH2PO40.5 g，MgSO47H2O1 g，K2HPO43H2O 1 g，水 1000 mL。1.2.2 母种实验培养基 土豆培养基：马铃薯 200 g；土豆综合培养基：马铃薯 200 g，硫酸镁 0.5g，磷酸二氢钾 1.5 g；玉米粉培养基：玉米粉 40 g，氮源 1 g，硫酸镁 0.5 g，磷酸二氢钾 1.5 g。棉籽壳培养基：棉籽壳 100 g，麦麸 10 g，硫酸镁 0.5 g，磷酸二氢钾 1.5 g。以上各配方均加入最适碳源 20 g，琼脂 20 g，水 1000 mL19。1.2.3 栽培培养基 a.棉籽壳培养基：78%棉籽壳；b.杂木屑棉籽壳培养基：39%杂木屑、39%棉籽壳；c.柳木屑培养基：78%柳木屑。以上各配方均添加 20%麦麸，1%蔗糖，1%石膏。1.3形态学鉴定形态学鉴定参照中国大型真菌描述20，通过观察 P-YD01 的子实体形态、孢子印、菌丝及孢子的形态、菌丝间的锁状联合和分生孢子等显微结构。根据这些特征，进行了初步的形态学鉴定。1.4分子标分子标记记鉴定鉴定使用CTAB法提取DNA后用引物ITS1(5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3)，ITS4(5TCCTCCGCTTATTGATATGC3)对其中 ITS 序列进行 PCR 扩增，PCR 反应体系：DNA 模板 2 L，ddH2O 10.44 L，10PCR buffer 2L，dNTP(10 mmol/L)0.1 L，MgCl21.2 L，ITS1(2 mol/L)与 ITS4(2 mol/L)各 2 L，TaqE 0.26 L。PCR 反应程序：94 预变性 5 min，开始循环，94 变性 50 s，50 退火 45 s，72 复性 50 s，30个循环，72 延伸 10 min。经电泳检验后，将扩增后的产物送至华大基因测序部进行克隆测序，将测序结果与 NCBI 网站基因库中的有关 ITS 片段进行比对，分析确定野生真菌的种类。1.5菌丝生物学特性实验菌丝生物学特性实验碳源实验分别以蔗糖、D-果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖替代基础培养基中的葡萄糖(CK)；氮源实验分别以酵母浸膏、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵替代基础培养基中的蛋白胨(CK)。温度实验以基础培养基接种后分别于 5、10、15、20、25、30、35 恒温培养箱进行培养。培养基 pH 实验分别以 HCl 和 NaOH 调节基础培养基为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。每种处理重复 5 次。在培养期间，先后于培养第 2 d 和第 10 d 对接种后平板的菌丝生长情况进行菌丝生长划线，采用十字交叉法测两次划线时的菌丝生长半径差值以计算菌丝生长速度，并观察菌丝长势。1.6母种培养基实验母种培养基实验母种培养基所使用碳源、氮源、培养温度和培养基 pH 皆为 1.5 实验中生长速率最快的处理。每种处理重复 5 次。1.7栽培培养基实验栽培培养基实验按照 1.2.3 中的配方按料水比 1:1.4 进行拌料装袋，每袋折合干料 400 g，灭菌接种等按常规，接种后 25 恒温培养，培养期间先后划线记录菌丝生长情况，测量和记录菌丝生长速度，菌丝满袋后转入菇房出菇管理按常规，本实验统计两潮菇产量。培养期间先后划线记录菌丝生长情况，测量和记录菌丝生长速度及产量。每种处理重复 10 次。1.8出菇季节实验出菇季节实验出菇季节实验选择春季和秋季，培养基为 1.2.3 中提到的培养基 a，菇房采用自然温度，人工控652山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷制湿度在 90%左右，通风等其他管理按常规。其中，春季出菇实验在 3 月中旬接种，4 月中旬开袋，5 下旬及 6 月上旬出菇，出菇时期室内温度在 25 左右；秋季出菇实验 9 月中旬接种，10 月中旬开袋，11 月中旬出菇，出菇时期室内温度在 15 左右。1.9搔菌出菇对照实验搔菌出菇对照实验搔菌出菇实验培养基选取及培养步骤同 1.8。移至菇房后，对照组正常开袋出菇，搔菌组开袋后用镊子刮去老旧菌丝后出菇。2结果与分析结果与分析2.1鉴定结果鉴定结果2.1.1 形态学鉴定 参照中国大型真菌20初步确定 P-YD01 是多脂鳞伞(Pholiota adiposa)，属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、球盖菇科、鳞伞属。如图 1 所示，该真菌菌盖和菌柄呈黄色，菌盖呈凸透镜形，表面具粘液和三角形鳞片，平均菌盖直径 6.7 cm；菌柄具鳞片，实心，无菌托，菌柄中生，平均菌柄长 6.1 cm，平均菌柄粗 1.1 cm；菌褶呈褐色，不等长，密度中，延生；菌褶呈辐射状排列，产生孢子量较大，孢子印印迹清晰，孢子锈色，表面光滑椭圆形，平均长度 10 m，平均宽度 5 m。担子呈棒状具四个担子梗，囊状体纺锤形。菌丝具有锁状联合，隔膜清晰。菌丝生长时间长会产生分生孢子。(注:.子实体.孢子印 A.担子体 B.囊状体 C.锁状联合 D.隔膜 E.孢子 F.分生孢子)图图 1 P-YD01 子实体形态、孢子印及显微结构子实体形态、孢子印及显微结构Fig.1 Fruiting body morphology,spore print and microstructure of P-YD012.1.2 序列分析及鉴定 经电泳检验，所得产物片段大小为 700 bp 左右(图 2)。将扩增后的 ITS 片段产物送至华大基因测序部进行克隆测序，测序结果与 NCBI 网站基因库中的有关 ITS 片段进行 BLAST比对，与 NCBI 登录号 810180.1 的比对结果最相近。样本的值显示其与鳞伞属(Pholiota)中的多脂鳞伞的同源性最高，最终确定 P-YD01 为多脂鳞伞。图图 2 ITS 序列序列 PCR 电泳结果电泳结果Fig.2 PCR electrophoresis results of ITS sequence第 5 期吴耀越等:多脂鳞伞 P-YD01 的菌丝生物学特性及引种驯化栽培试验6532.2菌丝生物学特性实验菌丝生物学特性实验由表 1-4 可知，当多脂鳞伞以 D-果糖为碳源时，与除麦芽糖外的其它实验组存在显著性差异。且 D-果糖组菌丝极浓密；当多脂鳞伞以牛肉膏为氮源时，与除硫酸铵外的其它实验组存在显著性差异。菌丝浓密程度上，酵母浸粉组菌丝极浓密，牛肉膏组浓密；当多脂鳞伞在 25、30 恒温环境下菌丝生长速率与其他恒温环境条件下的菌丝生长速率存在显著性差异。且温度为 25 实验组菌丝浓密；多脂鳞伞菌丝在不同 pH 培养基中随着 pH 升高生长速度减慢，长势最好的是 pH5.0，与 pH7-9有显著差异。且 pH 为 5.0、6.0 时菌丝浓密。因此，最适碳源为 D-果糖，最适氮源为牛肉膏，最适培养温度设置为 25，最适 pH 为 5.0。表表 1 不同碳源对菌丝生长速度的影响不同碳源对菌丝生长速度的影响Table 1 Effects of different carbon sources on mycelial growth rate碳源种类D-果糖麦芽糖葡萄糖蔗糖可溶性淀粉乳糖生长速度3.120.14 aA2.580.09 abA2.440.03 bA1.970.07 cB1.680.22 cBC0.290.04 dC菌丝浓密度+-+-表表 2 不同氮源对菌丝生长速度的影响不同氮源对菌丝生长速度的影响Table 2 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth rate氮源种类牛肉膏硫酸铵硝酸铵胰蛋白胨酵母浸粉尿素生长速度3.270.05 aA3.040.04 abA2.910.02 bA2.560.05 cB1.730.26 cdBC0.900.09 dC菌丝浓密度+-+-表表 3 不同温度对菌丝生长速度的影响不同温度对菌丝生长速度的影响Table 3 Effect of different temperature on mycelium growth rate温度25 30 20 15 10 5 35 生长速度2.510.07 aA 2.310.08 aA 1.680.02 bB1.260.05 cC 0.740.01 dD 0.540.01 eE0.000.00 fF菌丝浓密度+-+-表表 4 不同不同 pH 对菌丝生长速度的影响对菌丝生长速度的影响Table 4 Effect of different pH on mycelium growth ratepH56789生长速度2.510.05 aA2.350.09 abA2.260.02 bA2.250.03 bA2.210.02 bA菌丝浓密度+-2.3母种培养基实验母种培养基实验如图 3 所示，当多脂鳞伞以玉米粉培养基为母种培养基时菌丝生长速度最快，与其它种类培养基存在极显著性差异。应以玉米粉培养基作为最适母种培养基。图图 3 多脂鳞伞母种培养基实验多脂鳞伞母种培养基实验Fig.3 Culture medium experiment of mother species of Pholiota adiposa654山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷2.4出菇实验出菇实验2.4.1 出菇季节实验 分析中对秋季和春季出菇的生物学效率进行了独立样本检验，结果显示秋冬季出菇与春季出菇的生物学效率存在显著性差异(0.05)说明搔菌操作对多脂鳞伞出原基时间没有显著影响。通过对产量数据进行分析，搔菌较对照组产量有些微增长，未见显著性差异，因此搔菌对产量提升不显著。但由图 6、7(图 6 搔菌、图 7搔菌)可见搔菌可以明显改善原基及子实体整齐度，对子实体商品性有较大改善，因此建议搔菌。搔菌对出菇的影响还有待进一步的实验证明和数据统计，其机理也有待进一步研究。表表 5 多脂鳞伞搔菌实验多脂鳞伞搔菌实验Table 5 Pholiota adiposa scratching mycelium test实验项两次出菇总质量/gt 检验 sig 值出原基用时/dt 检验 sig 值对照298.212.60.69615.21.60.514搔菌305.813.816.61.3第 5 期吴耀越等:多脂鳞伞 P-YD01 的菌丝生物学特性及引种驯化栽培试验655图图 6 对照对照Fig.6 CK图图 7 搔菌搔菌Fig.7 Fungi scratching3讨讨 论论多脂鳞伞在我国北方较为常见，多生长于柳树上，是一种较为优质的野生菌21-25。不同地区的多脂鳞伞其生物学特性存在差异。本实验所用 P-YD01 菌种其最适碳源、氮源实验结果与其他相关实验结果有所不同22,24。菌丝最适生长温度与大多数研究结果一致。菌丝最适培养 pH 与烟台地区曾做过的实验结果一致，但与其他地区的实验结果稍有差异16,22。推测以上差异可能是由不同地区的生境所导致的，详细机理有待进一步研究16,22。多脂鳞伞的最适母种培养基为玉米粉培养基。多脂鳞伞属于中低温食用菌，春夏季栽培会出现严重的病虫害和霉菌污染，造成第二次出菇量锐减，严重者无法二次出菇；在秋季和初冬，温度在15 左右，尚能满足多脂鳞伞出菇需要，且该温度下病虫害较少，因此最适出菇季节应为秋冬季。虽然野生多脂鳞伞一般都生长在柳树上，但本实验用柳木屑做培养基产量显著低于棉籽壳，可能是棉籽壳的营养成分及通气含水量等优于柳木屑。搔菌操作对于某些种类食用菌具有缩短出原基时间、提高出原基整齐度和使子实体更匀称等作用26,27，在本实验中对于多脂鳞伞仅使其出原基整齐度和子实体匀称度得到提升，未明显缩短出原基时间。虽然多脂鳞伞驯化栽培成功已经 30 多年15，但其商品化推广和大面积栽培并不像杏鲍菇、真姬菇、茶树菇等新兴食用菌一样成功，至少目前在烟台的市场上没有销售，因此多脂鳞伞的推广及工厂化栽培等是急需解决的问题。参考文献参考文献1李 泰,卢士军,孙君茂,等.26种常见市售食用菌营养成分分析及评价J.中国食用菌,2021,40(12):66-722文春玉,徐 明,杨云礼,等.我国野生食用菌营养成分与价值评价研究进展J.中国食用菌,2021,40(11):1-103张志昌,杨 慧,顾昌华,等.“森林黄金”桑黄的多功能研究进展综述J.黑龙江粮食,2021(6):93-944李美娇.野生菌转型升级新景象J.致富天地,2016(7):9-10656山东农业大学学报(自然科学版)第 54 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