仿刺参C1q基因的克隆与表达分析.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 2 0 6 2第4 2卷第6期2 0 2 3年1 1月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.6N o v.2 0 2 3仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析陈 仲(辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产动物种质改良与优良苗种繁育重点实验室,辽宁 大连1 1 6 0 2 3)摘 要:C 1 q作为补体经典激活途径的识别蛋白,对于机体的免疫作用至关重要。为探明C 1 q基因在仿刺参免疫防御中的作用,利用构建的仿刺参c D NA文库,通过R A C E技术克隆得到仿刺参C 1 q(A j C 1 q)的全长c D NA,其序列全长为1 7 1 7b p,其中5 -端非翻译区为1 1 0b p,3 -端非翻译区为6 9 8b p,开放阅读框为9 0 9b p,编码3 0 2个氨基酸。A j C 1 q蛋白具有球状C 1 q结构域,为三聚体,与自然界中大多数动物中的C 1 q结构域有着较高的同源性。实时荧光定量P C R检测结果显示:在仿刺参从受精卵到幼参的发育过程中,A j C 1 q基因的mR NA均有表达,并且在樽形期的表达水平明显增加,到五触手幼体期达到峰值,表明补体系统可能在樽形期被广泛激活;A j C 1 q基因的mR NA在不同组织中均有表达,其中在管足中的表达水平较高;不同病原菌刺激后,A j C 1 q基因的转录表达均在较短时间内发生上调,表明在病原菌刺激下A j C 1 q基因能够快速表达。A j C 1 q可能在仿刺参发育过程中以及免疫应答中起着重要作用。关键词:仿刺参;C 1 q;c D NA克隆;生物信息学中图分类号:Q 7 8文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 6-0 9 3 3-1 2收稿日期:2 0 2 2-0 7-0 6;修回日期:2 0 2 2-0 9-0 2.基金项目:辽宁省百千万人才工程资助项目(2 0 2 1 9 2 1 0 7 1);辽宁省农业科学院基本科研业务费计划项目(2 0 2 2 X T C X 0 5 0 4);辽宁省农业科学院学科建设计划项目(2 0 2 2 D D 2 6 8 1 4 3);大连市重点领域创新团队支持计划项目(2 0 2 1 R T 0 8).作者简介:陈仲(1 9 8 0),男,高级工程师;研究方向:养殖生物免疫及病害.E-m a i l:9 0 3 0 3 5 7q q.c o m.仿刺参(A p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s)为无脊椎动物,属棘皮动物门海参纲刺参科仿刺参属1,是中国北方沿海广 泛分布的最 具经济价值 的动物之一2-3。近年来,养殖规模扩大、养殖密度提高、养殖环境恶化和种质退化等问题导致仿刺参病害频发,造成严重损失的同时也制约了仿刺参养殖产业的健康和可持续发展。仿刺参病害的病原主要为革兰氏阴性细菌,目前,抗生素等药物针对这些病原虽然有较好的防治效果,但因其存在生态环境安全和食品安全风险,在仿刺参病害中的应用受到诸多限制。而绿色、高效的仿刺参病害防控技术、手段仍较为匮乏。因此解析仿刺参免疫系统的防御机制,寻找绿色、高效病害防控技术,成为当前仿刺参病害防控基础研究中的重点4-8。免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫(固有免疫)两种9。仿刺参免疫机制以固有免疫为主1 0,这种免疫是与生俱来的,可遗传,能够迅速抵御外来威胁,具有非特异性1 1-1 2。免疫识别是固有免疫反应过程中极为重要的一步,主要依赖于模式识别蛋白1 0。补体是一种模式识别蛋白,是固有免疫的主要组成部分,可直接被多种病原体激活,随之形成多种活性物质,具有杀灭病原体、抗炎、抗感染、维持 机 体 内 环 境 稳 定 和 免 疫 调 节 等 生 物 活性9,1 3。大多数补体成分表现出生物学功能需要进行激活,补体激活有3种途径:经典途径、凝集素途径和替代途径1 2,1 4-1 5。完整的补体系统极其复杂1 6-1 7,其中经典激活途径是依赖于免疫复合物(又称抗原抗体复合物)(I C)激活实现的。C 1 q是补体1(C 1)的目标识别分子,能够启动补体的经典途径1 8。大多数C 1 q配体是通过C端球状C 1 q结构域(g C 1 q)识别的1 9-2 1,g C 1 q可以广泛地与自我配体和非自我配体进行结合,参与多种免疫反应2 2-2 3。补体系统是进化过程中较早出现的防御体系,并一直存在于脊椎动物以及部分无脊椎动物中9。目前,C 1 q为补体系统经典途径的目标识别蛋白,并且是固有免疫和特异性免疫之间的主要链接纽带,其功能研究多集中于脊椎动物。尽管C 1 q在无脊椎动物中的防御机制不断被重视,但研究起步较晚还处于初步探索阶段。仿刺参主要依靠固有免疫抵抗各种外源感染,因此作为固有免疫重要组成部分的补体分子的作用尤为重要,对补体经典途径的起始分子C 1 q的研究能更深入地了解仿刺参的免疫防御机制。笔者研究的目标基因为仿刺参C 1 q基因,通过克隆、生物学信息和荧光定量P C R等方法分析该基因在仿刺参体内的作用特性,包括功能结构域的预测以及其在不同组织、不同发育阶段和不同病原刺激后的转录水平表达,以期为防治仿刺参的病害发生提供思路,也为进一步探索仿刺参等海洋无脊椎动物C 1 q基因的免疫机制及其重要性提供理论基础。1 材料与方法1.1 试验材料试验用的仿刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院海水养殖引育种中心,取健康仿刺参,体质量(1 0.12.3)g,于实验室暂养7d,水温1 61 8,p H8.38.5,盐度2 9。用于不同组织取样和病原菌刺激。取健康仿刺参的体壁、肠道、呼吸树、肌肉、体腔细胞和管足6种组织。每5头仿刺参的同一种组织样品混合为1组,设3组平行,用于R NA提取(提取方法见1.2.1);取健康仿刺参不同发育时期(受精卵、囊胚、原肠胚、小耳幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽形幼体、五触手幼体、稚参及幼参)样品。本实验室自“化皮病”仿刺参中分离出3株革兰氏阴性菌和1株革兰氏阳性菌,经1 6 Sr D NA鉴定,分别为灿烂弧菌(V i b r i os p l e n d i d u s)、产黑假交替单胞菌(P s e u d o a l t e r o m o n a sn i g r i f a c i e n s)、波罗的海希瓦氏菌(S h e w a n e l l ab a l t i c a)和蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u s c e r e u s)。1.2 试验方法1.2.1 R NA的提取和c D NA的扩增用R N A p r e pp u r eT i s s u eK i t(T I A N G E N)对仿刺参体腔细胞进行总R N A提取。利用P r i m e rP r e m e r5.0设计特异性引物(表1)。使用S MA R T e rR A C E5/3 K i t(T a k a r a)和A d v a n t a g e2P C RK i t(T a k a r a)进行3 和5 末端扩增。第一轮P C R反应程序:9 4预变性3m i n;9 43 0s,7 23m i n,5个循环;9 43 0s,7 03 0s,7 23m i n,5个循环;9 43 0s,6 8 3 0s,7 2 3 m i n,3 0个循环;7 2 延伸1 0m i n;4保存。以第一轮P C R产物为模板进行第二轮P C R反应,反应条件:9 4预变性3m i n;9 43 0s,6 83 0s,7 2 3m i n,3 0个循环;7 2 延伸1 0m i n;4保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。表1 仿刺参C 1 q的R A C E引物 T a b.1 R A C Ep r i m e r f o rA.j a p o n i c u sC 1 q引物P r i m e r序列(5 3)S e q u e n c e用途F u n c t i o nC 1 q-3 -R A C E-1 PA C G G T G T C T T C C A C T G C C G GA T AAA C G G C3 -R A C EC 1 q-3 -R A C E-2 PC A G G G T G T A C G G G G GAA G C T C C A G GA T GA3 -R A C EC 1 q-5 -R A C E-1 PC C T C T C G G T C C T C T C GA T C C T T G GA G G C C5 -R A C EC 1 q-5 -R A C E-2 PT GA G G G C C A G G G T C T C C T C G T GAA C AA C A5 -R A C EU PM(L o n g)C T AA T A C GA C T C A C T A T AG G G C AA G C A G T G G T A T C AA C G C AGA G T3 和5 -R A C EU PM(S h o r t)C T AA T A C GA C T C A C T A T A G G G C3 和5 -R A C ENU PAA G C A G T G G T A T C AA C G C A GA G T3 和5 -R A C E1.2.2 病原菌刺激将1.1中描述的4株菌在2 2 1 6 E液体培养基中培养(2 8,1 5 0r/m i n)至对数期后,将菌液于4、5 0 0 0r/m i n(离心半径1 5c m)离心1 5m i n,获得菌泥,用无菌海水将菌泥重悬,并调节菌悬液密度至1.01 08c f u/m L,用于仿刺参体内注射刺激。将健康仿刺参平均分为6组,每组3 5头仿刺参:4个试验组分别注射1 0 0L的病原菌悬液,对照组注射1 0 0L的灭菌海水,空白组不做任何处理。试验过程中不进行投饵。注射4、1 2、2 4、4 8、7 2、9 6h后,分别从各个试验组和对照组中随机取5头仿刺参的体腔细胞(混合样,设3组平行),迅速投入液氮中冷冻,冰箱-8 0保存备用。1.2.3 实时荧光定量P C R(q R T-P C R)首 先 使 用P r i m e S c r i p tTMR T r e a g e n t K i t(T a k a r a)对1.2.1部分每个样品的总R NA进行反转录,然后采用S Y B RP r e m i xE xT a qTMI IK i t(T l iR N a s e HP l u s)(T a k a r a)进行荧光定量,荧光染料为S Y B RTMG r e e nI,试验在A B IP r i s m7 5 0 0实时荧光定量P C R仪(美国应用生物系统公司)上进439水 产 科 学第4 2卷行。仿刺参C 1 q基因引物序列见表2,内参基因为C y t b2 4。反应总体积为2 0L:2 S Y B RP r e m i xE xT a qTMI I(T l iR n a s e HP l u s)1 0L,R O XR e f e r-e n c eD y e I I 0.4L,c D NA模板2L,上、下游引物各0.8L,d H2O6L。反应条件:9 53 0s;9 51 0s,5 52 5s,7 22 5s,4 0个循环。采用2-Ct方法计算仿刺参C 1 q基因mR NA相对表达量2 5。表2 仿刺参C 1 q的实时荧光定量P C R引物 T a b.2 q R T-P C Rp r i m e r f o rA.j a p o n i c u sC 1 q引物P r i m e r序列(5 3)S e q u e n c e用途F u n c t i o nC 1 q-FG G T A G T C A T G GAA C T AA C G G Cq R T-P C RC 1 q-RC T C T C G G T C C T C T C GA T C Cq R T-P C RC Y T B-FT GA G C C G C AA C A G TAA T C内参基因C Y T B-RAA G G GAAAA G GAA G T GAAAG内参基因1.2.4 仿刺参C 1 q(A j C 1 q)基因的生 物信息学分析利用在线服务器O R FF i n d e r(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/o r f f i n d e r/)查找A j C 1 q基因的开放阅读框,并进行分析2 5;将A j C 1 q氨基酸序列上传至在线服务器E x P A S y-P r o t P a r a mt o o l(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)分析分子量、氨基酸残基组成和长度、蛋白理论等电点及分子量等理化性质2 6;分别 利用 在 线 服 务 器S i g n a l p5.0(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c ep h p?S i g n a l P-5.0)、E x P A S y-P r o t S c a l e t o o l(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t s c a l e/)、TMHMM2.0(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p?TMHMM-2.0)和C e l l-P L o c2.0中E u k-m P L o c 2.0(h t t p:/w w w.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/e u k-m u l t i-2/)对该蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区域以及定位等进行预测2 6-2 7。通过S O P MA(h t-t p s:/n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a_s o p m a.h t m l)分析A j C 1 q的二级结构2 8。利用U n i-F o l d(h t t p s:/h e r m i t e.d p.t e c h/,开源地址:h t t p s:/g i t h u b.c o m/d e e p m o d e l i n g/U n i-F o l d)对蛋白进行建模2 9。利用 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/)搜索并挑选其他物种编码的C 1 q氨基酸序列,使用C l u s t a lX软件进行多种序列比对,运用ME GA X中邻接法绘制系统进化树。应用B i o E d i t软件对上述氨基酸保守序列进行多序列比对。1.2.5 数据分析使用每个样 品 的3组 平 行 试 验 结 果 计 算 仿刺参C 1 q基因mR NA相对表达量的平均值及标准差,试验结果采用S P S S2 2.0软件进行统计分析,用独立t检验 方法检验不 同 组 织、不 同 发 育期、不同细菌 刺激时间的 差异,P0.0 5表明差异显著。2 结果与分析2.1 A j C 1 q生物信息学分析A j C 1 qc D NA序列全长为1 7 1 7b p,其中5 -端非翻译区为1 1 0b p,3 -端非翻译区为6 9 8b p,开放阅读框为9 0 9b p,编码3 0 2个氨基酸。A j C 1 q含有1个信号肽(图1)。2.1.1 理化性质分析A j C 1 q分子式是C1 4 2 9H2 1 8 5N3 9 7O4 3 7S1 4,分子质量为3 2.3 7k u,理论等电点为5.3 7;带正/负电荷的残基总数(A r g+L y s)/(A s p+G l u)分别为3 1和2 0;该蛋白的不稳定性指数为3 3.2 8,预测其为稳定蛋白。A j C 1 q亲水性蛋白(分值0)约占6 0.3%(图2),且平均亲水性系数为-0.3 7 5,小于0,推测该蛋白为亲水蛋白。2.1.2 结构分析TMHMM分析结果表明,A j C 1 q存在跨膜区域(图3 a);S i g n a lP5.0预测该蛋白存在信号肽,分割位点存在于2 3号位和2 4号位之间(AKA2 3-N2 4N)(图3 b);结合亚细胞定位分析,该蛋白可能属于胞外蛋白。S O PMA显示该蛋白的二级结构由7.9 5%的-螺旋、4.9 7%的-转 角、6 8.5 4%的 无 规 则 卷 曲 和1 8.5 4%的延伸链所构成(图3 c),其中延伸链可通过氢键的作用形成-片层结构3 0,由通过氢键网络连接的延伸多肽链(-链)组成。539第6期陈 仲:仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析图1 A j C 1 qc D NA序列和预测的氨基酸序列全长F i g.1 T h e s e q u e n c ea n df u l l l e n g t ho fd e d u c e da m i n oa c i d s s e q u e n c e f o rA j C 1 qc D N A信号肽加方框标注;C 1 q家族结构域用灰色背景标注;P o l y A序列加粗标注;六核苷酸多腺苷化信号(a a t a a a)斜体加粗标注.T h es i g n a l p e p t i d e i sm a r k e dw i t hb o x;t h e t y p i c a lC 1 q f a m i l yd o m a i n i sm a r k e dw i t hg r e yb a c k g r o u n d;P o l y Aa n dp o l y a d e n y l a t i o ns i g n a l(a a t a a a)a r es h o w n i nb o l d.图2 A j C 1 q氨基酸亲疏水性区域分布F i g.2 H y d r o p h i l i ca n dh y d r o p h o b i c r e g i o n s o fA j C 1 qa m i n oa c i d s639水 产 科 学第4 2卷图3 A j C 1 q结构分析F i g.3 A n a l y s i s o fA j C 1 qs t r u c t u r ea.A j C 1 q跨膜区分析;b.A j C 1 q信号肽分析;c.A j C 1 q二级结构分布;蓝色.-螺旋;绿色.-转角;紫色.无规则卷曲;红色.延伸链.a.t r a n s m e m b r a n er e g i o na n a l y s i so fA j C 1 q;b.s i g n a lp e p t i d eo fA j C 1 q;c.s e c o n d a r ys t r u c t u r ed i s t r i b u t i o no fA j C 1 qp r o t e i n;b l u e.a l p h ah e l i x;g r e e n.b e t a t u r n;p u r p l e.r a n d o mc o i l;r e d.e x t e n d e ds t r a n d.U n i-F o l d建模预测A j C 1 q单链的三级结构见图4 a,其中功能区的结构预测的准确度较高。该区域的空间结构较为紧密(图4 b),以-片层为主。3条链的功能区构成1个球状C 1 q结构域,为同源三聚体(图4 c),其中每个单体中的4个保守位点构成了疏水内核,分别为F 1 7 0、F 2 0 8、F 2 1 8、F 2 9 1(图4 d)。图4 A j C 1 q空间结构预测F i g.4 P r e d i c t i o no fA j C 1 qt e r t i a r ys t r u c t u r ea.A j C 1 q三级结构和预测局部距离差异测试(p L D D T),横坐标表示氨基酸序列位点;b.距离图(预测结构中残基之间的成对距离),横、纵坐标均表示氨基酸序列位点;c.球状C 1 q结构域(三聚体);d.C 1 q结构域(单体)和4个保守苯丙氨酸(F).a.t e r t i a r ys t r u c t u r eo fA j C 1 qa n dp r e d i c t e d l o c a l d i s t a n c ed i f f e r e n c et e s t(p L D D T),t h ea b s c i s s ar e p r e s e n t t h ea m i n oa c i ds e q u e n c el o c u s;b.d i s t a n c em a p(t h ep a i r-w i s ed i s t a n c e sb e t w e e nr e s i d u e s i n t h ep r e d i c t e ds t r u c t u r e),t h e a b s c i s s aa n do r d i n a t eb o t hr e p r e s e n tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e l o c u s;c.g l o b u l a rC 1 qd o m a i n(t r i m e r);d.C 1 qd o m a i n(m o n o m e r)a n d4c o n s e r v e dp h e n y l a l a n i n e.739第6期陈 仲:仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析2.1.3 A j C 1 q同源性分析在美国国家生物技术信息中心检索其他物种的C 1 q序列,序列见表3。对其进行一致性分析,A j C 1 q与紫海胆(S t r o n g y l o c e n t r o t u sp u r p u r a t u s)中的C 1 q一致性较高。用C l u s t a lX软件将A j C 1 q氨基酸序列与其他物种C 1 q氨基酸序列进行多重序列比对(图5),结果显示,其保守位点有2 7个,大多分布在C 1 q家族功能结构域中,包括4个疏水内核中的关键残基F 1 7 0、F 2 0 8、F 2 1 8和F 2 9 1;再结合软件ME GA X,利用邻接法构建系统发育树(图6),结果显示,A j C 1 q和紫海胆分在同一小分支,并与囊舌虫(S a c c o g l o s s u sk o w a l e v s k i i)亲缘关系也较近。对亲缘性较高的紫海胆C 1 q(X P_0 0 3 7 2 4 1 4 8.1)和人类C 1 q(N P_0 0 0 4 8 2.3)的信号肽进行分析发现,A j C 1 q和二者均具有信号肽,转移方式为常规的分泌通路,在2 03 0位残基之间具有一个I型信号肽酶(S P a s e I,S P I)的分割位点;对以上两种C 1 q进行建模,可以看出A j C 1 q和二者的功能结构域均以-片层为主,具有高度的相似性,推测它们功能及作用机制相似。表3 不同物种的C 1 q及其与A j C 1 q的一致性 T a b.3 C 1 qf r o md i f f e r e n t s p e c i e s a n dt h e i r i d e n t i t yw i t hA j C 1 q物种S p e c i e sN C B I登记号N C B In u m b e r一致性/%I d e n t i t y人类H o m os a p i e n sN P_0 0 0 4 8 2.32 8.6 9小家鼠M u sm u s c u l u sN P_0 3 3 9 0 7.12 8.4 5刺猬E r i n a c e u s e u r o p a e u sX P_0 0 7 5 3 5 3 0 2.12 7.2 7眼镜王蛇O p h i o p h a g u sh a n n a hE T E 5 9 8 9 8.13 0.5 8绿头鸭A n a sp l a t y r h y n c h o sE O B 0 4 7 3 8.13 1.4 5原鸡G a l l u sg a l l u sX P_0 0 4 9 4 7 5 7 8.13 2.1 0非洲爪蟾X e n o p u s l a e v i sN P_0 0 1 0 8 5 8 3 6.12 7.9 2矛尾鱼L a t i m e r i ac h a l u m n a eX P_0 1 4 3 4 9 1 9 1.13 5.0 8叶吻银鲛C a l l o r h i n c h u sm i l i iN P_0 0 1 2 7 9 7 5 5.13 5.3 9草鱼C t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l aA GN 7 1 0 1 0.13 0.0 8斑马鱼D a n i or e r i oN P_0 0 1 0 0 3 4 8 2.12 7.2 7蒲氏黏盲鳗E p t a t r e t u s b u r g e r iB AM 7 6 7 6 1.12 5.2 5东亚叉牙七鳃鳗L e t h e n t e r o nc a m t s c h a t i c u mB A D 2 2 8 3 3.13 4.6 8囊舌虫S.k o w a l e v s k i iX P_0 0 2 7 3 9 4 4 5.13 7.3 4紫海胆S.p u r p u r a t u sX P_0 0 3 7 2 4 1 4 8.13 8.6 0青岛文昌鱼B r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i t s i n g t a u e n s eA C H 9 5 4 1 9.13 2.1 8紫贻贝M y t i l u s c o r u s c u sA GO 0 5 9 3 9.13 1.0 3海湾扇贝A r g o p e c t e ni r r a d i a n sA D D 1 7 3 4 4.13 6.1 1蚤状溞D a p h n i ap u l e xE F X 9 0 3 7 3.13 0.8 82.2 A j C 1 q基因在仿刺参不同发育时期、不同组织的表达情况A j C 1 q基因在仿刺参不同发育时期的表达结果见图7。以 受 精 卵 时 期 为 对 照,除 囊 胚 时 期,A j C 1 q基因在其他8个发育时期的表达量均高于受精卵时期,其中五触手、樽形幼体和稚参这3个时期的表达量显著高于受精卵时期(P0.0 5)。此外,在整个生长发育时期,A j C 1 q基因的表达量在五触手幼体时期达到最高值。A j C 1 q基因在仿刺参幼参不同组织中的表达结果见图8,以体腔细胞为对照,其他5种组织的表达量均高于体腔细胞,其中呼吸树、肠道、管足、体壁的表达量显著高于体腔细胞(P0.0 5)。C 1 q基因在管足的表达量最高,其次为体壁。2.3 病原菌刺激对A j C 1 q基因表达的影响仿刺参对不同细菌的刺激有不同的免疫应答(图9)。灿烂弧菌刺激后,与对照组相比,A j C 1 q基因在所有的时间点表达量均上调,其中4 8h和9 6h的表达水平显著高于对照组(P0.0 5)。产黑假交替单胞菌刺激后,在4、2 4、7 2h和9 6h的表达量显著高于对照组(P0.0 5),其中2 4h的表达量最高,其次是9 6h和7 2h。1 2、4 8h的表达量下调,与对839水 产 科 学第4 2卷照组差异不显著。波罗的海希瓦氏菌刺激后,除7 2h以外时间点的表达量均高于对照组,其中4h时的A j C 1 q表达量显著高于对照组(P0.0 5),7 2h表达量显著低于对照组。蜡样芽孢杆菌刺激后,除4 8h以外时间点的表达量均高于对照组,其中1 2、2 4、7 2h的表达量较对照组显著上调(P0.0 5)。图5 A j C 1 q与其他物种的C 1 q氨基酸序列比较F i g.5 C o m p a r i s o no f a m i n oa c i ds e q u e n c e s o fA j C 1 qw i t ho t h e r s p e c i e sC 1 q保守位点用下划线标注.C o n s e r v e ds i t e sa r eu n d e r l i n e d.939第6期陈 仲:仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析图6 A j C 1 q系统进化树F i g.6 P h y l o g e n e t i c t r e eo fA j C 1 q图7 A j C 1 q基因在仿刺参不同发育时期的相对表达量变化F i g.7 C h a n g e s i nr e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o fA j C 1 qg e n e i nd i f f e r e n td e v e l o p m e n t a l s t a g e s o f s e ac u c u m b e rA.j a p o n i c u s不同字母表示不同发育时期基因表达有差异(P0.0 5).D i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t ed i f f e r e n c e s i ng e n ee x p r e s s i o na td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a l s t a g e s(P0.0 5).049水 产 科 学第4 2卷图8 A j C 1 q基因在仿刺参不同组织的相对表达量差异F i g.8 D i f f e r e n c e i nr e l a t i v e e x p r e s s i o no fA j C 1 qg e n ei nd i f f e r e n t t i s s u e s o f s e ac u c u m b e rA.j a p o n i c u s不同字母表示不同组织中基因表达有差异(P0.0 5).D i f f e r e n t l e t t e r si n d i c a t ed i f f e r e n c e si ng e n ee x p r e s s i o nl e v e l i nd i f f e r e n t t i s s u e s(P0.0 5).图9 仿刺参体腔细胞中A j C 1 q基因在4种病原菌刺激下的表达F i g.9 E x p r e s s i o no fA j C 1 qg e n e i nc o e l o m o c y t e s o f s e ac u c u m b e rA.j a p o n i c u ss t i m u l a t e db yf o u rp a t h o g e n s*表示同一时间试验组与对照组的基因表达有差异(P0.0 5).*i n d i c a t ed i f f e r e n c e si ng e n ee x p r e s s i o nb e t w e e nt h ee x p e r i-m e n t a l g r o u pa n d t h e c o n t r o l g r o u pa t t h e s a m e t i m e(P0.0 5).3 讨 论仿刺参的补体系统是固有免疫和适应性免疫二者之间的重要桥梁3 1。A j C 1 q作为仿刺参补体系统经典途径的目标识别蛋白,其功能一直未被系统地阐述,所以从仿刺参的C l q基因入手,即着眼于仿刺参的免疫防御因子,通过研究A j C 1 q分子在其体内的作用机制,分析其在仿刺参免疫系统中的分布以及参与对外界病害免疫应答的情况具有十分重要的意义。3.1 A j C 1 q蛋白结构及同源性分析不同物种间具有相似甚至相同功能的蛋白质具有同源性,其中决定蛋白功能性的氨基酸残基是保守的,而非保守残基的变化对蛋白的功能并没有明显的影响3 2,因此,笔者采用U n i-F o l d对A j C 1 q进行建模,解决了S w i s s-m o d e l(h t t p s:s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)在没有同源模板的情况下,对目标蛋白质的建模不完整,甚至无法建模的问题。该方法在一定程度上成功复现了A l p h a f o l d 2,提高了其对非同源序列的精度。通过U n i-F o l d预测出A j C 1 q的q C 1 q结构域为三聚体,该结构域使得C 1 q可以广泛地与自我配体和非自我配体进行结合,例如某些逆转录病毒的包膜蛋白、-淀粉样原纤维、脂多糖、革兰氏阴性菌的孔蛋白、磷脂、凋亡细胞和一些急性期反应物等,由此参与清除凋亡细胞、吞噬细菌、中和病毒粒子来维持免疫耐受,细胞黏附和免疫细胞调节多种免疫反应2 2-2 3。仿刺参A j C 1 qc D NA序列编码的蛋白具有3 0 2个氨基酸,C 1 q结构域(单链)为1 3 8个氨基酸,空间结构以-片层为主,含有2 7个高度保守氨基酸(8 0%),大部分为甘氨酸(G),其中4个芳香族氨基酸(苯丙氨酸,F)参与形成疏水内核,对结构的稳定性起着积极的作用3 3。此外,通过对已知C 1 q进行建模分析,A j C 1 q和其他物种的C 1 q的分泌类型都属于常规的分泌通路,且结构十分相似,推测C 1 q无论是在无脊椎动物还是脊椎动物中,其作用及机制可能是相似的。3.2 A j C 1 q基因在仿刺参各发育时期的表达分析A j C 1 q基因在仿刺参各发育时 期均有表达。受精卵发育到中耳幼体期这一阶段,A j C 1 q基因的表达量呈微弱的升高趋势,但表达量仍极少;从大耳幼体期开始,表达量显著增多,并到五触手幼体期达到峰值。有研究表明,大多数情况下,浮游/底栖生物的生命转变过程中,C 1 q基因在幼虫形成前不表达;在不同的发育阶段,C 1 q基因的累积表达逐渐增加,以适应静止的生活,在这个期间,主体组织为成体的雏形,C 1 q基因的表达大量增加与成熟器官的发育是一致的3 4。A j C 1 q基因的表达特点与上述特征相似3 5:仿刺参在发育至原肠期之前,各器官并没有形成,所以A j C 1 q基因表达量极少;当发育至原肠期时,食道、消化道等器官已经发育,此时的A j C 1 q基因表达量有微小的增加;当发育到耳状时期,纤毛、胃部和水管系统等器官形成,并开始149第6期陈 仲:仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析运动、摄食,使得外界的物质刺激机体几率提升,免疫应答增强,A j C 1 q基因表达量增加;发育至樽形和五触手阶段,仿刺参形成五触手和重要免疫器官管足,所以此时的A j C 1 q基因显著升高;当发育至稚参和幼参阶段,器官发育完全,体壁的骨片覆盖全身,体壁防御能力增强,减缓了机体固有免疫应答,此时的