核酸化学主题医学知识.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,本 章 内 容,第一节 概 述,第二节 核酸的结构,第三节 核酸的理化性质,第四节 核酸的提取、分离与含 量测定的原理,核酸是存在于细胞中的一类大分子酸性物质，包括,核糖核酸（,ribonucleic acid,RNA,）,和脱氧核糖核酸（,deoxyribonucleic acid,DNA,）,两大类,。,RNA,和,DNA,都是以单核苷酸,(nucleotide),为基本单位所组成的多核苷酸长链。,RNA,主要参与遗传信息的表达，而,DNA,则是遗传信息的载体。,DNA,主要存在于细胞核中，线粒体、叶绿体、质粒中也有少量,DNA,。,RNA,主要分布在细胞质中。在自然界中，人、动物、植物和微生物都含有核酸。核酸占细胞干重的,5,15,。,第一节 概 述,一、核酸的元素组成,组成核酸的基本元素：,C,、,H,、,O,、,N,、,P,；,其中,P,的含量比较稳定，占,9%-10%,，通过测定,P,的 含量来推算核酸的含量（定磷法）。,DNA,平均含磷量为,9.9%,，,RNA,为,9.4%,。,任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。,二、核酸的基本组成单位,-,核苷酸,核酸部分水解产生,核苷酸,，核苷酸进一步水解生成,核苷和磷酸,。核苷再水解生成,碱基,(,嘌呤碱和嘧啶碱,),和,戊糖,(,核糖或脱氧核糖,),。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。核酸的逐步水解过程可表示如下：,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,碱基,戊糖,核糖,嘌呤,嘧啶,核酸完全水解产物:,脱氧核糖,核苷酸是核酸的基本结构单位，核酸是一类多聚核苷酸。RNA和DNA的基本化学组成见表。,（一）核糖和脱氧核糖,O,HOH,2,C,OH,O,H,OH,1,2,O,HOH,2,C,OH,OH,1,2,-D-2-核糖,-D-2-脱氧核糖,O,核糖+H,+,糠醛,甲基间苯二酚,FeCl,3,绿色产物,脱氧核糖+H,+,-羟基-酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA和DNA定性、定量测定,（二）嘌呤碱和嘧啶碱,N,N,N,N,H,H,H,H,N,N,N,N,H,H,H,H,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,NH,2,腺嘌呤 adenine,（A）,N,N,N,N,H,H,H,H,O,H,2,N,鸟嘌呤 guanine,（G）,N,N,H,H,H,H,嘧啶,1,2,3,4,5,6,N,N,H,H,H,H,NH,2,O,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,N,N,H,H,H,H,O,O,H,H,N,N,H,H,H,H,O,O,H,H,CH,3,胸腺嘧啶 thymine,（T）,N,N,O,O,H,H,H,酮式,H,N,N,O,O,H,H,H,酮式,H,H,H,烯醇式,稀有碱基：,除五种基本的碱基外，核酸中还有些含量甚少的碱基，称为稀有碱基。很多稀有碱基是甲基化碱基。一些稀有碱基的结构式如下：,（三）核苷,戊糖和碱基缩合而成的糖苷称为核苷(nucleoside)。,戊糖和碱基之间的连接是戊糖的第一位碳原子(C-1)与嘧啶碱的第一位氮原子(N-1)或嘌呤碱的第九位氮原子(N-9)相连接，,戊糖和碱基之间的连接键是N-C键，,故生成的化学键称为,，N-糖苷键,。,应用X射线衍射法证明，核苷中的碱基与糖环平面互相垂直。根据核苷中所含戊糖不同，将核苷分为核糖核苷和脱氧核糖核苷两类。,O,HOH,2,C,OH,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,N,O,O,H,H,H,尿嘧啶,H,1,尿苷,(1,N1-糖苷键),天然核苷：一般为反式构象,修饰核苷（modified nucleoside）,：,也称稀有核苷（minor nucleoside）,修饰核苷包括三种情况:,（1）由,修饰碱基,和糖组成的核苷,O,HOH,2,C,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,C,O,O,NH,H,H,5,1,OH,假尿苷（）,（2）由非修饰碱基和,2-O-甲基 核糖,组成的核苷,（3）由碱基与糖,连接方式特殊,的核苷,RNA中主要的核糖核苷有四种：,腺嘌呤核苷(adenosine，A)、鸟嘌呤核苷(guanosine，G)、胞嘧啶核苷(cytidine，C)和尿嘧啶核苷(uridine，U)。,其结构式如下,：,A G C U,腺苷 鸟苷 胞苷 尿苷,DNA中主要的脱氧核糖核苷也有四种：,腺嘌呤脱氧核苷(deoxyadenosine，dA)、鸟嘌呤脱氧核苷(deoxyguanosine，dG)、胞嘧啶脱氧核苷(deoxycytidine，dC)、胸腺嘧啶脱氧核苷(deoxythymidine，dT)。,其结构式 如下：,(A)(G)(C)(T),(四)核苷酸,核苷中戊糖的羟基磷酸酯化，就形成核苷酸。,即核苷酸是核苷的磷酸酯。,根据核苷酸中的戊糖不同，,核苷酸可分为两大类：核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。,由于核糖中有三个游离的羟基(2,、3和5)，因此核糖核苷酸有2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸三种。而脱氧核糖只有3和5两个游离羟基可被酯化，因此只有3-脱氧核苷酸和5-脱氧核苷酸两种。,自然界存在的游离核苷酸为5-核苷酸，一般其代号可略5。,(2,-AMP),(3,-AMP),(5,-AMP),Deoxyadenosine 3-monphosphate,(3-dAMP),Deoxyadenosine 5-monphosphate,(5-dAMP),三、核苷酸的性质,(一)一般性状,核者酸为无色粉末或结晶，易溶于水，不溶于有机溶剂。由于戊糖含有不对称碳原子，因此核苷酸溶液,具有旋光性。,(二)紫外吸收,由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，因此碱基、核苷和核苷酸在240290nm波段有吸收峰，其最大吸收值,在260nm,附近，不同的核苷酸有不同的吸收特性。因此，可以用紫外分光光度法对核苷酸作定性和定量测定。,1核苷酸的定量测定,精确称取核苷酸若干毫克，用0.01mol/L盐酸定容至一定体积，在波长260nm下测定样品的吸收度，根据核苷酸的摩尔吸收系数可以计算出样品中核苷酸的百分含量。计算公式为：,式中 A,260,所测样品的吸收度；,M 所测核苷酸的分子量；,E,260,所测核苷酸的摩尔吸收系数；,C 所测核苷酸的样品浓度(mgm1)。,2核苷酸的定性鉴定,由于不同的核苷酸有其独特的紫外吸收曲线，因此，选定某两个波长的吸收值之比，可以用作鉴定不同核苷酸的指标。其标准比值见表。由于溶液的pH会影响核苷酸的解离状态，因而影响其紫外吸收特性，所以测定时要严格控制溶液的pH值。,250/260,280/260,290/260,2.0,7.0,2.0,7.0,2.0,7.0,5-CMP,0.46,0.84,2.10,0.99,1.55,0.30,5-AMP,0.85,0.80,0.22,0.15,0.03,0.003,5-UMP,0.74,0.73,0.38,0.40,0.03,0.03,5-GMP,1.22,1.15,0.68,0.68,0.40,0.28,光密度,比值,pH,核苷酸,(三)核苷酸的互变异构作用,碱基上带有酮基的核苷酸能转化为烯醇式。在溶液中，酮式和烯醇式两种互变异构体常同时存在，处于平衡态。,在生物体内，核酸结构中的核苷酸主要是酮式。,(四),核苷酸的两性解离和等电点,核苷酸中含有磷酸基，使核苷酸具有较强的酸性。在核苷酸中，两个磷酸基解离常数分别为pK,1,0.71.6，pK,2,5.96.5。,由于核苷酸含有碱基和磷酸基，因此，核苷酸为两性电解质，,它们在不同pH值的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成,兼性离子。,当处在等电点时，,腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸,主要是兼性离子存在。,尿苷酸,的碱基碱性极弱，测不出含氮环的解离曲线。所以不能形成兼性离子。,胞嘧啶核苷酸的解离:,可在pH2.05.0之间分离各种核苷酸,pH3.5时各核苷酸所带电荷,核苷酸,磷酸基电荷,碱基的电荷,净电荷,AMP,-1,+0.54,-0.46,GMP,-1,+0.05,-0.95,CMP,-1,+0.84,-0.16,UMP,-1,+0,-1,四、生物体内重要的核苷酸衍生物,(一)5-二磷酸核苷类和5-三磷酸核苷类,5,-核苷酸又可按其在5,位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。,O,HOH,2,C,OH,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,N,N,N,H,N,H,H,9,腺嘌呤,胸 苷,P,O,-,-,O,O,腺,苷-5-磷酸,AMP,O,P,O,-,-,O,O,ADP,ATP,P,O,-,-,O,O,各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用,：,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,第二信使cAMP,核苷三磷酸化合物在生物体内的能量代谢中起着重要的作用。,体内物质氧化时所产生的能量一般不能直接用于生理活动，但释放出来的能量可供ADP磷酸化形成ATP。因此体内物质氧化所放出的能量先储存于ATP中，当体内需要能量时，ATP水解释放出能量以满足生理活动的需要。可见，,ATP在生物体内化学能的储存和利用中起着关键的作用。,ATP的磷酸酯键显示出高的水解性能，可以从它的特殊化学结构来解释。,a静电效应：,在生理pH(7.35)条件下，ATP的磷酸根中4个可离解质子全部离解，因此共带有4个负电荷。这些负电荷之间静电排斥作用使磷酸酯键处于高势能状态。,b共振稳定因素：,ATP离解成ADP和磷酸或AMP和焦磷酸以后，共振稳定性大大增加。,核苷酸的命名及缩写符号,脱氧,碱基,磷酸基数目,磷酸,d,A,M,P,G,D,T,T,C,U,(二)环化核苷酸,环化核苷酸如环化腺苷酸和环化鸟苷酸普遍存在于动植物和微生物细胞中。它们的结构式如下：,环一磷酸腺苷 环一磷酸鸟苷,环化核苷酸有重要的生理功能，它们参与调节细胞生理生化过程而控制生物的生长、分化和细胞对激素的效应。,第二节 核酸的结构,一、DNA的结构,(一)DNA的碱基组成,(二)DNA的一级结构,(三)DNA的二级结构 (四)DNA的三级结构,二、RNA的结构,(一)RNA的类型 (二)RNA的碱基组成,(三)RNA的一级结构 (四)RNA的构象,三、核酸中核苷酸顺序的测定,(一)RNA的核苷酸顺序测定,(二)DNA的核苷酸顺序测定,一、DNA的结构,(一)DNA的碱基组成,DNA由四种主要的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)组成。此外，还含有少量稀有碱基。应用纸层析和紫外分光光度法对多种生物DNA的碱基组成进行定量测定，总结出如下规律：,(1)所有DNA中腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔含量相等，即AT；鸟嘌呤和胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶)的摩尔含量相等，即GC。因此，嘌呤总数等于嘧啶总数，即A+GC+T。(2)DNA的碱基组成具有种属特异性，即不同生物的DNA具有自己独特的碱基组成。(3)DNA的碱基组成没有组织特异性，即同生物体的不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成。,所有DNA中AT，GC这一规律的发现，为DNA双螺旋结构模型的建立提供了重要的根据。,(二)DNA的一级结构,(,Primary structure),DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸排列的顺序。,由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，也称,碱基序列,。,实验表明，核酸中,一分子核苷酸的3,-位羟基与另一分子核苷酸的5,-位磷酸基通过脱水可形成,3,5,-磷酸二酯键,，从而将两分子核苷酸连接起来。,因此在DNA链中，除了第一个和最后一个核苷酸外，所有核苷酸的3，5-羟基都参与磷酸二酯键。第一个核苷酸的5-磷酸基不连到别的核苷酸上，而最后一个核苷酸则有一个自由的3-羟基。,所以DNA链有方向性或极性，,它有5端和3端。DNA是由数量极其庞大的四种脱氧核糖核苷酸，通过3，5-磷酸二酯键彼此连接起来的,直线形或环形分子,，DNA没有侧链。,DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4,n,。,下图表示DNA多核苷酸链的一个小片段。,H,O,-,O,OCH,2,T,O=P,O,-,3,5,OH,H,O,-,O,OCH,2,G,O=P,O,-,3,5,OH,O,OCH,2,OH,H,A,O=P,O,O,-,3,5,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,d-pGpTpA,OH,d-pG-T-A,d-pGTA,写出二核苷酸d-ApTp的结构,(三)DNA的二级结构,1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的,DNA双螺旋结构模型,，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,DNA二级结构的WatsonCrick模型,B-型DNA,双螺旋结构模型的要点：,(1)DNA分子由两条脱氧多核苷酸链构成，两条链都是右手螺旋，这,两条链反向平行,(即一条为5-3，另一条为3-5)，围绕同一个中心轴构成双螺旋结构，链之间的螺旋形成一条大沟和一条小沟。,(2)磷酸基和脱氧核糖在外侧，彼此之间通过磷酸二酯键相连接，形成DNA的骨架。碱基连接在糖环的内侧。糖环平面与碱基平面相互垂直。,(3)双螺旋的直径为2nm。顺轴方向，每隔0.34nm有一个核苷酸，两个相邻核苷酸之间的夹角为36。每一圈双螺旋有10对核苷酸，每圈高度为34nm。,(4)两条链由碱基间的氢键相连，而且碱基间形成氢键有一定规律：腺嘌呤与胸腺嘧啶成对，鸟嘌呤与胞嘧啶成对。A和T间形成两个氢键，G和C间形成三个氢键。,这种碱基之间互相配对称为碱基互补。,(5)沿螺旋轴方向观察，配对的碱基并不充满双螺旋的全部空间。由于碱基对的方向性，使得碱基对占据的空间不对称，因此在双螺旋的表面形成大沟和小沟。双螺旋表面的沟对DNA和蛋白质相互识别是很重要的。,B型DNA双螺旋结构模式图,碱基配对及氢键形成,DNA双螺旋结构的稳定因素：,DNA双螺旋结构是很稳定的。主要有三种作用力使DNA双螺旋结构维持稳定。,一种作用力是互补碱基之间的氢键，,但氢键并不是DNA双螺旋结构稳定的主要作用力，因为氢键的能量很小。,DNA分子中碱基的堆集可以使碱基缔合，这种力称为碱基堆集力，是使DNA双螺旋结构稳定的主要作用力。,碱基堆集力是由于杂环碱基的电子之间相互作用所引起的。DNA分子中碱基层层堆集，在DNA分子内部形成一个疏水核心。疏水核心内几乎没有游离的水分子，这有利于互补碱基间形成氢键。,第三种使DNA分子稳定的力是磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的离子键。,它可以减少DNA分子双链间的静电斥力，因而对DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。,DNA双螺旋的种类:,目前已知,DNA,双螺旋结构可分为,A,、,B,、,C,、,D,及,Z,型等数种，除,Z,型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋。,外形,碱基距离,直径nm,螺旋方向,螺距nm,碱基数目,螺旋表面,A型,短粗,0.23,2.55,右手,2.46,11,大小沟,B型,适中,0.34,2.00,右手,3.40,10.4,大小沟,Z-DNA,细长,0.38,1.84,左手,4.56,12,小沟深,(四)DNA的三级结构,DNA的二级结构指双螺旋结构。双螺旋链的扭曲或再次螺旋就构成了DNA的三级结构。,超螺旋是DNA三级结构的一种形式。,超螺旋,螺旋,大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋,(superhelix 或supercoil),。当引进的张力与原先右手螺旋的方向相同时，超螺旋的方向是左手的，称为正超螺旋（变紧）,(positive supercoil),；引进张力与原先右手螺旋方向相反时，超螺旋的方向是右手的，称为负超螺旋（变松）,(negative supercoil),。正超螺旋是旋紧双螺旋后形成的，负超螺旋是放松双螺旋后形成的。,DNA超螺旋结构形成的重要意义:,使,DNA,形成高度致密状态从而得以装入核中；,推动,DNA,结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,松弛环形,1,15,20,10,5,23,1,5,10,15,20,25,1,5,10,15,20,23,右手旋转拧松两匝后的线形DNA,解链环形,1,5,10,15,20,23,负超螺旋,1,21,4,8,23,16,13,部分解链,超螺旋,松弛型,绝大多数原核生物的,DNA,都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。,原核生物DNA的高级结构：,DNA在真核生物细胞核内的组装：,生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，,以核蛋白,（,nucleoprotein,）,的形式存在。,DNA,分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。,在真核生物中，双螺旋的,DNA,分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为,核小体,(,nucleosome,),。,核小体结构属于,DNA,的高级结构。,DNA的功能,DNA,的基本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。,DNA,分子中具有特定生物学功能的片段称为,基因,(gene),。,一个生物体的全部,DNA,序列称为,基因组,(genome),。,基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒,SV40,的基因组大小为,5.110,3,bp,，,大肠杆菌为,5.710,6,bp,，,人为,3.210,9,bp,。,二、RNA的结构,(一)RNA的类型,根据结构、功能不同，动物、植物和微生物细胞的RNA主要有三类：核蛋白体RNA(rRNA)，转运RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)。,1核蛋白体RNA,(,rRNA),核蛋白体RNA是细胞中主要的一类RNA，rRNA占细胞中全部RNA的80左右，是一类代谢稳定、分子量最大的RNA，存在于核蛋白体内。核蛋白体(ribosome)又称为核糖体或核糖核蛋白体。,它是细胞内蛋白质生物合成的场所。,核蛋白体由两个亚基组成，一个称为大亚基，另一个称为小亚基，两个亚基都含有rRNA和蛋白质，但其种类和数量却不相同。,2转运RNA(tRNA),转运RNA是细胞中一类最小的RNA，tRNA一般由7393个核苷酸构成，分子量2300028000，,但含有,稀有碱基最多,的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。,tRNA约占细胞中RNA总量的15。,在蛋白质生物合成中tRNA起携带氨基酸的作用。,细胞内tRNA的种类很多，每一种氨基酸都有与其相对应的一种或几种tRNA。,3信使RNA,mRNA在细胞中含量很少，占RNA总量的35。mRNA在代谢上很不稳定，,它是合成蛋白质的模板，每种多肽链都由一种特定的mRNA负责编码。,因此，细胞内mRNA的种类很多。mRNA的分子量极不均一，其沉降系数在425S间，mRNA的平均分子量约500000。,除上述三类RNA以外，细胞内还有一些其他类型的RNA，如细胞核内的不均一核RNA(HnRNA)、小分子核RNA(LnRNA)和染色质RNA(ChRNA)等。,核蛋白体,RNA,信使,RNA,转运,RNA,核内不均一,RNA,核内小,RNA,胞浆小,RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,核蛋白体组分,蛋白质合成模板,转运氨基酸,成熟,mRNA,的前体,参与,hnRNA,的剪接、转运,rRNA,的加工、修饰,蛋白质内质网定位合成,的信号识别体的组分,核仁小,RNA,核蛋白体,RNA,信使,RNA,转运,RNA,核内不均一,RNA,核内小,RNA,胞浆小,RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,核蛋白体组分,蛋白质合成模板,转运氨基酸,成熟,mRNA,的前体,参与,hnRNA,的剪接、转运,rRNA,的加工、修饰,蛋白质内质网定位合成,的信号识别体的组分,核仁小,RNA,RNA的种类、分布与功能,(二)RNA的碱基组成,RNA中含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四种基本碱基。此外，目前已发现RNA中有60多种稀有碱基。,(三)RNA的一级结构,RNA分子由许多核苷酸构成，实验证明，,核苷酸之间也是通过磷酸二酯键连接，,一个核苷酸C,5,的磷酸基与相邻的核苷酸的C,3,的羟基结合成3，5-磷酸二酯键。下图所示为RNA分子中多核苷酸链的一小片段。,RNA分子的一级结构就是指多核苷酸链中核苷酸的排列顺序。,图 RNA分子中多核苷酸链的小片段,pApGpCp,(四)RNA的构象,根据RNA的某些理化性质和X射线衍射分析证明大多数天然RNA分子是单链。,多核苷酸链可以发生自身回折，使可以配对的一些碱基相遇，碱基按一定规律，A与U之间形成氢键，G与C之间也可以形成氢键连接起来，构成双螺旋区；不能配对的碱基则形成环状突起，这种构象就是RNA的二级结构。,RNA中的双螺旋结构为A-DNA类型的结构。每一段螺旋区至少需要有46对碱基才能保持稳定。不同的RNA分子，双螺旋区所占比例不同，如rRNA中双螺旋区占40左右，tRNA中占50左右，烟草花叶病毒RNA中占60左右。,1.tRNA的二级结构,tRNA,的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草”形，故称为,“三叶草”结构,。,tRNA,的“三叶草”形结构包括：,1.,四臂四环；,2.,氨基酸臂,；,3.D,环上有二氢尿嘧啶（,DHU,臂,）,；,4.,反密码环上的反密码子与,mRNA,相互作用,(,反密码臂,),；,5.,可变环上的核苷酸数目可以变动,(,可变臂,),和,6.,TC,臂,五部分。,携带氨基酸,辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,识别mRNA上的密码,识别并结合核蛋白体,氨基酸臂,DHU臂,反密码臂,可变臂,T,C臂,（1）氨基酸臂或氨基酸茎，由3-端和5-端碱基组成7对互补碱基对的双螺旋区，富含鸟嘌呤，末端为CpCpA-OH，接受活化的氨基酸。,（2）二氢尿嘧啶环，由812个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶。由34对碱基组成的双螺旋区与tRNA其余部分相连，这个双螺旋区叫二氢尿嘧啶臂（茎）。,（3）反密码子环，由 7个核苷酸组成，环中部由 3个碱基组成反密码子，反密码子在蛋白质（肽）合成中能与rnRNA上的密码子配对。次黄嘌呤常出现于此环中。5对碱基组成的双螺旋区叫反密码子臂（茎），反密码子环由此茎与tRNA分子的其他部分相连。,（4）额外环，又叫可变环（或叉），由318个核苷酸组成，是tRNA分类的重要指标。,（5）假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷环，即TC环，由7个核苷酸组成。有5对碱基组成的双螺旋区叫TC臂，由此臂与tRNA的其它部分连接。,2.tRNA的三级结构：,tRNA的三级结构的形状像一个倒写的L字母。它是在二级结构三叶草形的基础上进一步扭曲、折叠而成的。,3.rRNA的结构,在原核生物中，,rRNA,有三种：,5S,，,16S,，,23S,。,其中，,16S,的,rRNA,参与构成核蛋白体的小亚基，而,5S,和,23S,的,rRNA,参与构成核蛋白体大亚基。,在真核生物中，,rRNA,有四种：,5S,，,5.8S,，,18S,，,28S,。,其中，,18S,的,rRNA,参与构成核蛋白体小亚基，其余的,rRNA,参与构成核蛋白体大亚基。,5sRNA的二级结构,4.mRNA的结构与功能,mRNA,可形成局部双螺旋结构的二级结构。,（1）,原核细胞mRNA是,多顺反子,，即可以编码多条多肽链；真核细胞的mRNA为,单顺反子,。,（2）,绝大多数真核细胞的mRNA的3-末端具有一段多聚腺苷酸（poly(A)），而且不同真核细胞的mRNA的3-末端的poly(A)长短不同。而原核细胞的mRNA一般没有poly(A)。,（3）,真核细胞mRNA 5-末端有一个特殊的5-“帽子”结构。“帽子”结构和3-末端的poly(A)都有抗核酸外切酶的作用。原核生物mRNA一般没有“帽于”结构。,（4）,真核细胞5-“帽子”结构的下游和3-poly(A)的上游分别为5-端不编码区和3-端不编码区，二者之间是其编码区。已知5-端不编码区和“帽子”结构是与核糖体结合的区域，与蛋白质合成的起始有关。至于3-端不编码的功能，目前仍不清楚。原核细胞由于没有“帽子”结构，不编码区位于mRNA的两端。,原核与真核细胞的mRNA在结构上的差异,顺反子,顺反子,顺反子,插入顺序,插入顺序,先导区,末端顺序,5,3,原核细胞mRNA的结构特点,AAAAAAA-OH,5,“,帽子,”,PolyA 3,顺反子,m,7,G-5,ppp-N-3,p,真核细胞mRNA的结构特点,原核与真核细胞的mRNA在结构上的差异,真核生物mRNA 5,-端帽子结构,5,5,m,7,GTP,mRNA,分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供,模板,(,templet,),。,mRNA,分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为,遗传密码（,coden,),。,某些小分子,RNA,具有催化特定,RNA,降解的活性，这种具有催化作用的小,RNA,被称为,核酶,(,ribozyme,),。,核酶通常具有特殊的分子结构，如锤头结构。,三、核酸中核苷酸顺序的测定,(一)RNA的核苷酸顺序测定,RNA一级结构的研究借鉴了蛋白质一级结构的研究方法，,即片段重叠法。,片段重迭法的一般步骤是：,(1)对RNA分子进行末端测定，分析两个末端碱基；,(2)用特异核酸工具酶将RNA分子降解成小片段；,(3)分离酶解产生的各小片段；,(4)分析各小片段核苷酸的含量、组成和排列顺序；,(5)把两种以上不同特异酶水解的结果，运用重迭法的原理拼合成整个RNA分子的核苷酸排列顺序。,1.末端分析,目前一般用同位素标记法来测定5末端和3末端核苷酸。如用-,32,P-ATP，以多核苷酸激酶催化，使RNA分子或片段的5-OH标记,32,P，然后经酶解或碱水解，鉴定带有放射性的核苷酸或核苷二磷酸即为5末端。,2酶解产物的分离,现采用的分离方法,有尿素柱层析法、双向电泳法等。,(1)尿素柱层析法,在7mol/L尿素存在下，进行DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖凝胶柱层析，用含7molL尿素的0.1mol/L三乙胺乙酸盐缓冲液线性梯度洗脱，即可把RNA的酶解产物寡核苷酸混合物分开。中性尿素柱层析法可以按链长把10个核苷酸残基以下的寡核苷酸分开。酸性尿素柱层析则可以把相同链长、不同组成的各种寡核苷酸分开。,(2)双向电泳法,Sanger建立双向电泳法分离放射性,32,P标记的RNA酶解产物，该法简便易行，已广泛用于RNA一级结构的测定，特别是小分子RNA的测定。此法能分离的最长片段为612个核苷酸。,(3)凝胶电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳用于RNA部分酶解产物(大片段)的分离。该法可按链长将各核甘酸片段分开。根据产物长度不同，可选用不同浓度比例的丙烯酰胺。如果条件选得适宜，对于200个核苷酸以下的片段甚至相差一个核苷酸也能分开。,3.核苷酸顺序测定方法,用上述方法将RNA酶解产物分离后，须对每个片段作核苷酸顺序测定，常用以下几种方法。,(1)自末端按序降解法,含有邻位羟基的寡核苷酸片段可被过碘酸氧化成双醛化合物。与苯胺反应除去末端核苷酸残基，从而鉴定游离出来的碱基，即3末端碱基。,从理论上讲，过碘酸氧化法可以从RNA的3末端开始逐个测定到RNA的5末端，但实际上由于每次反应不可能达到100完全多次循环的误差就越来越大。目前文献报道最多是29次循环。,苯 胺,+N,1,(2)核酸外切酶部分降解法,生物体内存在着多种核酸水解酶(nuclease)。这些酶可以水解多聚核苷酸的磷酸二酯键。核酸水解酶一般可分为RNA水解酶(RNases)和DNA水解酶(DNases)。核酸水解酶还可以根据其水解核酸方式分为两类：,核酸外切酶：能够从多聚核苷酸链的一端(3-端或5-端)开始，逐步将核 酸水解下来。,核苷酸内切酶：能够水解多聚核苷酸链中某种核苷酸形成的磷酸酯键。,如用蛇毒磷酸二酯酶(VPDase)等外切酶进行部分降解，即以限制酶量、降低温度和控制作用时间来使RNA片段部分降解。由于条件不同而产生一系列不同长度的寡核苷酸片段的混合物，用凝胶电泳法将这些混合物分离后即可知其排列顺序。现将下列八核苷酸用VPDase不完全水解，可得8种组分的混合物：,pAGCUGACU,pAGCUGAC,pAGCUGA,pAGCUGACU pAGCUG,pAGC,pAG,pA,将上述各片段的混合物分离后测定每一片段的3末端，即可排出该片段的全部核苷酸顺序。,部分水解,VPDase,(二)DNA的核苷酸顺序测定,按制备DNA片段的方法不同，可以把测定DNA的核苷酸顺序的方法分为,酶法和化学法。,1.MaxamGilbert碱基顺序分析法,1975年，Maxam A和GilbertW发展了一种核酸碱基顺序快速分析方法。这种方法的基本原理是应用有机化学方法，选择性地切断某种特定核苷酸(A，G，C，T)所形成的磷酸酯键。所以此法又称为,化学降解法。,(1)嘌呤碱残基的选择性水解：,核酸中的嘌呤碱基和嘧啶碱基可以与硫酸二甲酯作用，但反应条件及甲基化产物的性质不同。在温和的条件下，用硫酸二甲酯处理DNA，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N-3-甲基腺嘌呤核苷和N-7-甲基鸟嘌吟核苷。,不同碱基的甲基化产物对于水解去嘌呤碱基反应敏感程度有明显差别。脱去了嘌呤碱基的核糖磷酸酯键，在0.1 molLNaOH碱性条件下可以被水解切断。在此条件下，其余的磷酸酯键不受影响。,(2)嘧啶碱残基的选择性水解：,DNA链用肼处理，其中的嘧啶碱残基被脱去，生成核糖腙衍生物，再在哌啶存在下水解，核糖腙3位的磷酸酯键则被水解断裂。,根据上面反应原理，可以在不同反应条件下，选择性地切断分别由四种不同的核苷酸形成的磷酸酯键。,注意：不论嘌呤碱基或嘧啶碱基，在选择性水解后，在水解位点上的含氮碱基都消失了。,例如一个多聚核苷酸链5-ATTGACTTAGCC，在一定条件下，在G处切断，则有以下几种情况可能发生：,由此可见，一共可以得到6种不同的多聚核苷酸片断(包括一条原来的DNA链)。它们可以用凝胶电泳方法分离，,多聚核苷酸片断的长度与它在凝胶电泳中移动的速率成反比。,如下图。,(a)用染色法检测得到全部的DNA片断电泳图谱，(b)用放射性同位素标记法检测到的DNA片断电泳图谱(*),2Sanger碱基顺序分析法,1976年，Sanger F发展了一种新的核酸碱基顺序分析法。Sanger法的基本原理是将待测定的DNA单链作为DNA复制的模板，在DNA聚合酶(一种催化DNA合成的酶)催化下，在有四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和四种脱二氧核苷三磷酸(ddNTP)参与下，合成出各种长度的DNA片断，再进行凝胶电泳和放射性显影，从图谱上直接读出待测DNA的互补碱基顺序。,由于此法的关键是利用脱二氧核苷三磷酸终止DNA链的增长而实现的，所以又称为链终止法。,CCGGTAGCAATT,3,5,模板,引物,GG,5,3,GG,C,GGC,C,GGCCAT,C,C,ddCTP,GGCC,A,GGCCATCGTTG,A,ddATP,A,GGCCATC,G,GGCCATCGTT,G,G,ddGTP,GGCCA,T,GGCCATCG,T,GGCCATCGT,T,T,ddTTP,C,C,A,T,C,G,T,T,G,A,5,3,第三节 核酸的理化性质,一、核酸分子的大小,二、核酸的溶解度与粘度,三、核酸的酸碱性质,四、核酸的紫外吸收,五、核酸的变性、复性和杂交,一、核酸分子的大小,过去用苯酚和中性盐法所制得的DNA样品往往是部分降解了的产物。所以用它测得的DNA分子量(10,6,10,7,)往往偏低。现在采用电子显微镜照像和放射自显影等技术测定DNA的分子量。RNA的分子量大约从几百到几百万。,二、核酸的溶解度与粘度,RNA和DNA都是极性比合物，部微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐比自由酸易于水，RNA钠盐在水中溶解度可达4。高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不规则线团分子比球形分子的粘度大，而线形分子的粘度更大。RNA的粘度比DNA粘度小。,当DNA溶液加热，或在其他因素作用下；发生螺旋线团转变时，粘度降低。所以可用粘度作为DNA变性的指标。,三、核酸的酸碱性质,可以把核酸看成是多元酸，多聚核苷酸链中含有两类可离解的基团。多聚核苷酸链的离解性质与多肽链情况相似，能够发生两性离解，也有等电点。由于磷酸是一个中等强度的酸，而含氮碱基碱性很弱，因此核酸的等电点都在低pH值范围内。,DNA的等电点为4-4.5，RNA的等电点为2-2.5。,DNA和RNA等电点相差较大这一特点，在DNA和RNA分离中具有重要意义。,DNA和RNA等电点相差较大的原因，很容易从它们的结构特点来理解。RNA链中，核糖2-OH的氢原子能与磷酸酯中的羟基氧原子形成氢键，促进了磷酸酯羟基中氢原子的离解。,酸或碱水解：,多聚核苷酸链在适当的条件下能被酸或碱水解成核苷酸。但是DNA和RNA对酸或碱的稳定性有很大的差别。例如，在室温条件下，用01 moLL NaOH溶液即可将RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。,四、核酸的紫外吸收,核酸分子中的嘧啶和嘌呤环的共轭体系强烈吸收260-290nm波段的紫外光，一般在,260nm,左右有最大吸收峰。蛋白质在280nm左右有最大吸收峰。,紫外吸收光谱与分子中可解离基团的解离状态、pH、光波波长等因素有关。,利用核酸的紫外吸收特性，可以对核酸进行定量测定。,上式中：A为吸收度，l为比色杯内径的厚度(cm)，E(P)为摩尔磷吸收系数。,这样，只要测定核酸溶液的磷含量和紫外吸收值，就可计算它的E(P)值。,核酸在变性时，E(P)值显著升高，此现象称为增色效应。在一定条件下，变性核酸可复性，此时E(P)值又回复至原来水平，这种现象称为减色效应。所以E(P)值可作为核酸复性的指标。,五、核酸的变性、复性和杂交,(一)变性,核酸分子具有一定的空间结构，维持这种空间结构的作用力主要是氢键和碱基堆积力。,有些理化因素会破坏氢键和碱基堆积力，使核酸分子的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能改变，这种现象称为核酸的变性。,核酸变性时，其双螺旋结构解开，但并不涉及核苷酸间共价键的断裂。因此变性作用并不引起孩酸分子量降低。,多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂叫降解。,伴随核酸的降解，核酸分子量降低。,多种因素可引起核酸变性，,如加热、过高过低的pH、有机溶剂、酰胺和尿素等。,加热引起DNA的变性称为,热变性。,随着DNA空间结构的改变，引起一系列性质变化，如粘度降低，某些颜色反应增强，尤其是260nm紫外吸收增加，DNA变性后失去生物活性。,DNA热变性的过程不是一种,“渐变”,，而是一种,“跃变”过程,，就像固体的结晶物质在其融点时突然融化一样。,通常把E(P)值达到最高值的12时的温度称为“熔点”或熔解温度，用符号T,m,表示。,DNA的T,m,值一般在7085C之间。,影响Tm的因素：,（1）G-C的相对含量越多，T,m,值就越高。,（G+C）%=（Tm 69.3）2.44,（2）介质离子强度低，Tm低。,（3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。,（4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。,(二)复性,将热变性后的,DNA,溶液缓慢冷却，在低于变性温度约,25,30,的条件下保温一段时间（,退火,annealing,），,则变性的两条单链,DNA,可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。