基因工程的基本操作程序选修专业知识讲座.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。,目的基因的获取,基因表达载体的构建（,核心,）,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,四 个 步 骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因,主要,是_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,人工合成,1)基因文库？,1.从基因文库中获取目的基因,将含有,某种生物,不同基因的许多DNA片断，导入到,受体菌,的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,2)基因文库的种类:,种类,基因组DNA文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：cDNA文库,受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因,基因组文库的构建模式图,cDNA,文库的构建模式图,杂交双链,(单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,双链DNA,(,cDNA,),某种生物的mRNA,某种酶,DNA聚合酶,与载体连接后导入受体菌贮存，组成,cDNA,文库,思考：,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？,基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因的表达产物蛋白质,根据基因的,有关信息,概念：,PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,（2）利用,PCR技术,扩增目的基因,过程,变性,复性,延伸,1.变性,（90-95）,双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,氢键,单链DNA,2.,复性,(55-65),温度降低，,与DNA模板结合，形成局部_。,双链,引物,3.延伸,（70-75）,在,的作用下，从引物的,连接,，合 成与模板互补的DNA,链。,3端,脱氧核苷酸,Taq酶,2、具体过程,原理：,.,DNA复制的原理,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,1对引物,DNA聚合酶(Taq酶),条件,模板,原料,酶,引物,能量,PCR,技术扩增与DNA复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制(,PCR扩增仪内),主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,（Taq酶）,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,解旋酶、,普通的DNA聚合酶等,3.人工合成,1)反转录法：,杂交双链,(单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA,(,cDNA,),目的基因,的mRNA,某种酶,DNA聚合酶,反转录酶,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,二、基因表达载体的构建（,核心,）,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,，并且可以,遗传,给下一代,使目的基因能够,表达和发挥作用,1、基因,表达载体,构建的目的,？（,P11）,2、基因表达载体的组成？,启动子,目的基因,终止子,标记基因,思考,1、启动子？终止子？标记基因？它们的作用是？,2、作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？,3、,基因表达载体的构建是千篇一律的吗？,三、将目的基因导入,受体细胞,目的基因进入_,_内，并且在受体细胞内维持_,_和_,_的过程,转化:,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,易感染,双子叶植物,和,裸子植物,，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA)可以转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。,农杆菌特点：,（1）农杆菌转化法,(,采用最多）,两次拼接？两次导入？,组织培养技术,（2）基因枪法,（3）花粉管通道法,显微注射技术（最常用，最有效）,（3）将目的基因导入动物细胞,方法,受体细胞,常用受精卵,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,动物细胞受精卵的全能性大,目的基因的表达载体提纯,取卵（受精卵）,显微注射,受精卵发育,新性状动物,过程：,（2）将目的基因导入微生物细胞,过程：,Ca,2+,处理受体细胞,感受态细胞,重组表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？,常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。,方法,Ca,2+,处理法,用Ca,2,处理，增加细菌细胞壁的通透性,思考：,为什么要用Ca,2+,处理受体细胞？,受体生物,植物,动物,微生物,受体细胞,导入方法,受精卵,体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注,射技术,用Ca,2+,处理成感受态细胞,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中,BC,四、目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,1、导入检测,目的：,方法：,DNA分子杂交技术,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针？,杂交的对象？,用放射性同位素标记的,含目的基因的DNA片段,15,N,15,N,14,N,探针,转基因生,物的DNA,变性,变性,14,N,过,程,.首先取出,转基因生物的基因组DNA,.用含目的基因的DNA片段用,放射性同位素等作标记,以此做,探针,。,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出,杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,2、转录检测,目的：,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法：,分子杂交技术,用放射性同位素标记的,含目的基因的DNA片段,探针？,杂交的对象？,从转基因生物中提取的mRNA.,3、翻译检测,目的：,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交技术,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原？,抗体？,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,4、个体生物学水平的鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、,活性鉴定等,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法、,Ca,2+,处理法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,个体生物学水平的鉴定,1.,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：,位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:,能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质,.(以模板转录然后脱落),编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做,内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,2.,真核细胞的基因结构,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的,组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码区,基因组文库与,cDNA,文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中是否有启动子,基因中是否有内含子,基因多少,物种间的,基因交流,小,有,无,有,无,某种生物的全部基因,某种生物的部分基因,部分基因可以,可以,大,