常用液相色谱柱原理和使用和维护保养培训课件.ppt

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to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。,主要内容,1,、液相色谱柱基本理论知识,2,、常用液相色谱柱使用方法与维护保养,3,、液相色谱柱常见问题分析与解决方案,1.2,液相色谱柱的结构及其主要功能,液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。,柱管：,多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于,70 kg/cm,2,时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。,压帽：,即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。,密封环：,位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。,1.3,液相色谱柱的分类与应用范围,分类方法很多，可按键合相类型、用途（分析型与制备型）、基质种类等进行分类。,1.3.1,硅胶基质柱（,4,大类）,目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为：,高纯硅胶柱：,以高纯度硅烷化硅胶（,Silica,）为填料，应用范围较广，但只能在,PH2.0-7.5,，小于,60,度的条件下使用。又由于强极性硅羟基（,Si-OH),的次级保留效应较强，所以应用受到局限，已被键合相柱所取代。,反相硅胶柱：,是以硅烷化硅胶为基质，表面键合,弱极性官能团,的固定相。目前多用,C,18,（,ODS,）、,C,8,（,MOS,）、,C,4,（,B,）、,C,6,H,5,（,phenyl,，苯基）等。用于分离大多数有机化合物，应用范围最广。,正相硅胶柱：,是以硅烷化硅胶为基质，表面键合,极性官能,团的固定相。目前较多的为：,NH2,（氨基）、,CN,（氰基）、,DIOL,（二羟基，也常做,HILIC,单独分类列出，多用于分离,有机酸,、,蛋白质,等）。多用于分离光学异构体和反相柱子不能分离的极性比较大的物质,。,离子交换柱：,是以硅烷化硅胶为基质，以磺化交联键合强阳,/,阴离子基团（磺酸盐,/,季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类化合物。（,注意：,不要同离子色谱混淆，离子色谱主要是分离无机盐类化合物或某些带点离子。）,1.3.2,聚合物基质柱,聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯,二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的,pH,范围（,1.0,14.0,），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱（,GPC,）、凝胶过滤色谱（,GFC,）及分子排阻色谱（,MEC,）。主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。,1.3.3,其他无机物填料柱,这类色谱柱仅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化铝（,Al,2,O,3,）、氧化锆（,ZrO,2,）等填料。不需要进行表面改性，其自身表面即可对各类化合物有强保留。可在任意,pH,（氧化铝除外，不能大于,12.0,）及高温度（可达,100,）下使用。其中，,石墨化碳填料柱能分离多种化合物，主要用于分离几何,异构体；氧化铝柱刚性强，柱床稳定，可分离多种化合物且多用于制备色谱；氧化锆柱较氧化铝柱有更强的,pH,适用范围及能耐受更高的温度，但其应用尚待进一步研究。,1.3.4,建立色谱柱档案,应同色谱仪器档案一样重视色谱柱档案，主要内容包括：品牌、型号、系列号、购进日期、购进发票、使用记录（使用日期、使用人、使用目的、使用情况）、维护保养记录（老化时间、老化人、故障现象、故障原因、处理方法、处理结果及附图）等，并以档案盒形式保存，最好做到专柱专用。,1.3.5,常用液相色谱柱主要应用范围与特点汇总,1.3.5.1,反相色谱柱,柱填料类型,主要应用范围,特点,C18,（,ODS,）,可分离多种化合物，最适合用于极性样品或做离子抑制的样品的分析,普适性好；保留性强，用途广,；可用于正相。,C8,（辛基）,与,C18,相似,与,C18,相似，但保留值稍小,C3,，,C4,多用于肽类与蛋白质,保留值更小,C1,三甲基单氯硅烷,(TMS),普通反相溶剂分析疏水性强的化合物；使用高水含量溶剂分析高极性化合物,；分离多功能团化合物,保留值最小；最不稳定；可用于反相与正相,苯基，苯乙基,多用于分离分析同时含极性和非极性芳香化合物的混合物,保留值适中；选择性有所不同,，对极性芳香化合物选择性更强；可用于正相。,1.3.5.2,正相色谱柱,柱填料类型,主要应用范围,特点,CN,（氰基）,适用于在,ODS,上无保留或分离时间太长的组分的分离，以及样品中同时含有亲水与疏水性化合物而在,ODS,上色谱优化困难的场合，也可用于氨基酸分析。,属中等级性柱，普适性好；保留适中，可用于正相与反相。,NH2,（氨基）,主要用于分析单糖类、,烃类化合物,保留性弱；极性大，不稳定，酸性条件下易水解；亦可用于反相。,OH,（二醇基，,DIOL,）,多用于有机酸、,肽类与蛋白质分析,极性大于,CN,，小于,NH2,，常做,HILIC,用。可反相用。,高纯硅胶柱,多用于制备,LC,，,适用于多种化合物,普适性好；价廉；操作不太方便；,pH,窄（,2-7.5,）；次级保留效应强（硅羟基），易峰拖尾或前延，分叉等。,1.3.5.3,聚合物基质柱,（,eg.,聚苯乙烯柱）,单独的聚苯乙烯类填料柱主要用于分离蛋白质类等大分子化合物，多用于,GPC,、,GFC,、,MEC,等；若与离子交换基团共键则形成离子交换柱，用于分离酸性化合物（磺酸基团）、碱性合物（季铵基团）及药物代谢产物等。特点：在,1,PH,13,的流动相中稳定；分离峰形较好，柱子寿命较长。,1.3.5.4,其他无机物填料柱,如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。,柱填料类型,主要应用范围,特点,Chiral,（手性柱）,常用于分离手性异构体，根据分离不同机理选择。,不同化学性质的异构体需采用不同类型的手性柱,。部分亦可用于反相。,HILIC,（亲水作用柱）,最常用,Diol,柱、丙基酰胺基键合硅胶柱，多用于分析极性化合物、端基异构体、如药物极性代谢产物、多肽、有机酸、糖类等。,多用于,ELSD,检测，,C18,无保留化合物，毒品检查等。,可用于反相。,1.4,液相色谱柱制备工艺简述,不同品牌色谱柱制备工艺各异，但都可归纳为如下流程（以硅胶柱为例）：,硅烷化硅胶制备（四乙氧基硅烷脱乙基与聚合）,Si-OH,基暴露（,脱乙基，置换成,H,）,海绵状多孔硅胶构造（物理匀质过程）,官能团键合,（各种官能团与,Si-OH,键合）,端基封口（对残余的,Si-OH,用小分子的氯,-,甲基、氯,-,乙基键合,）,润湿混合（加乙醇等调匀，其配方各厂家均有专利保护）,装填（机械装填或手工装填，层层装填，压紧，润湿）,高压平衡（轴向加压或径向加压，各厂家均有专利保护）,干燥（此步为关键工艺步骤，各厂家均有专利保护）,削平,组件安装,预平衡,柱效测试流动相平衡,柱效测试,封口,包装,1.5,液相色谱柱分离机理概述,色谱柱类型,分离机理,备注,常规反相柱,相似相溶,常规正相柱,相似相溶,离子交换柱,样品离子与色谱柱离子达到置换动态平衡,要关注,pH,条件,手性柱（,Chiral column,）,氢键作用、偶级,-,偶级作用、,-,作用、静电作用、疏水作用、空间作用,一般，,AGP,、,HSA,、,BSA,等以疏水作用、空间作用为主,。,亲水性色谱柱,（,HILIC,）,氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应及相似相溶,基于,NP,原理,氨基酸分析柱,相似相溶,基于,RP,原理,2,、常用液相色谱柱使用方法与维护保养,(1),认识色谱柱规范化使用与保养的必要性：,延长色谱柱使用寿命，,降低色谱柱使用成本，逐步提高分析人员色谱柱使用与维护水平，确保试验数据的准确性、可靠性和重现性，提升个人在色谱领域的竞争力。,(2),熟悉几个概念：,液相色谱柱：,指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽,/,卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。,色谱柱再生：,指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。,运载溶剂（,Shipp,ing Solvent,）：,指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。,保存条件（,Storage Conditions,）：,指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温度。,保存溶剂（,Storage Solvent,）：,用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与,比例的溶液。,(3),对新柱正确老化处理的,必要性,认识：新购色谱柱出厂前均采用适,合的运载溶剂（,Shipp,ing Solvent,）饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。若老化方法不正确或时间不够，极易导致色谱柱在使用较短时间后即产生分离度下降、峰形变差、峰拖尾等柱效降低的情况。需根据色谱柱不同类型选择不同饱和与老化方法。,2.1,普通,C,8,及,C,18,反相色谱柱（,C,8,&C,18,Reversed-phase chromatography column,）,（,1,）准备新鲜超纯水及色谱级乙腈或甲醇，冲洗色谱仪器系统，保证仪器系统管路干净。（新柱老化前，此步决不可忽略）,（,2,）将色谱柱反向连接，不接检测器。用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,0.3,0.6ml/min,流速冲洗,20,30min,。（目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）,（,3,）再将色谱柱正向连接，不接检测器。用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,0.3,0.6ml/min,流速冲洗,20,30min,。（目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）,（,4,）连接检测器，开启柱温达,30,40,，用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,0.3,0.6ml/min,流速冲洗,4h,以上。（目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气）,（,5,）用水,-,有机相（,10,：,90,5:95,），以,0.3,0.6ml/min,流速冲洗,2h,以上,或在,120min,内以水,-,有机相（,95:50:100,）梯度变化，以,0.3,0.6ml/min,流速冲洗,再用,100%,有机溶剂，以,0.3,0.6ml/min,流速冲洗,1h,以上,最后用,100%,有机溶剂，以,1ml/min,流速冲洗,1h,以上。（目的是老化色谱柱）,（,6,）在平衡前根据水相,-,有机相的比例，首先调整水,-,有机相的比例接近流动相水相,-,有机相的比例，以,1ml/min,流速冲洗,30,左右（目的是相平衡过渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡，必需先用,90%,以上水进行预平衡,30min,以上，否则，会导致缓冲盐在,柱内析出结晶,，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。,（,7,）然后更换成新制并经,0.45um,滤膜过滤，超声脱气后的流动,相，按检测方法平衡至少,1h,，待基线稳定后，开始进样检测。,（,8,）由于是新柱首次使用，在进样完成后需立即对色谱柱进行净化和有机溶剂饱和。方法是：用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,0.6ml/min,流速冲洗,1h,以上,再用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,1ml/min,流速冲洗,30min,以上（或者采用溶剂梯度变化至,100%,有机相冲洗,120min,以上）,最后用,100%,有机溶剂，以,1ml/min,流速冲洗,1h,以上。若流动相中有缓冲盐，建议用,100%,水冲洗,1h,以上后，再重复上述净化程序（但个别品牌,C,8,或,C,18,色谱柱不耐受纯水冲洗者例外）。,在新色谱柱使用几次，均正常后，运行完毕,净化处理程序可简化为：,用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,1ml/min,流速冲洗,1h,以上,再用,100%,有机溶剂，以,1ml/min,流速冲洗,30min,以上,选择柱说明书中保存条件（,Storage Conditions,）规定的保存溶剂（,Storage Solvent,）冲洗,10,倍柱体积以上,封口，保存。,（,9,）净化完毕，若次日不再使用，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。,（,10,）,备注：,老化用有机溶剂推荐使用色谱级甲醇，不同品牌色谱柱需区别对待；水需用去离子的超纯水。若色谱柱使用后入库保存，长时间未使用，重新使用时仍需重新饱和。方法是：用水,-,有机相（,90,：,10,95:5,），以,0.6ml/min,流速冲洗,1h,以上,再用,100%,有机溶剂，以,1ml/min,流速冲洗,30min,以上,然后调整水,-,有机相的比例接近流动相水相,-,有机相的比例，以,1ml/min,流速冲洗,30,左右,最后用流动相平衡,1h,以上，进样检测。必需注意流动相,pH,值不能超过色谱柱,pH,耐受范围，过酸容易使键合相变态，过碱则易导致硅胶溶解柱床塌陷。,（,11,）,特别提示：,当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时，处理方法如下：将色谱柱反向连接接，不接检测器，用水,-,乙腈（,90,：,10,95:5,），以,0.6ml/min,流速冲洗,2h,以上,再用,100%,乙腈，以,0.6ml/min,流速冲洗,1h,以上,然后正向连接好色谱柱，用水,-,乙腈（,90,：,10,95:5,），以,1ml/min,流速冲洗,1h,以上,再用,100%,乙腈，以,1ml/min,流速冲洗,1h,以上，即可恢复。,（,12,）,警告：,无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间（,30min,以上）走空，否则易使色谱柱干涸且带入大量几乎无法排出的气泡，甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。使用与保存时，严禁用力甩，绝对杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落，否则，易导致柱床机械性损坏，则再无再生可能。,2.2,正相色谱柱（,Normal Phase Chromatography column,）,目前，正相色谱分析最常用的是氨基柱与氰基柱。,2.2.1,氨基柱（,-NH,2,）,氨基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。新购氨基柱老化处理及使用基本程序如下：,1,）若需要在正相条件下使用,：,用正己烷,-,乙腈（,99,：,1,）以,0.5ml/min,的流速冲洗约,50,倍柱体积,备注：氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，,eg.,正己烷,-,乙腈（,99,：,1,）,。,再根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲洗约,10,倍柱体积。,用正相流动相平衡,1h,以上，确保柱压控制在,6000Psi,以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约,10,倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。,分析完毕，用异丙醇，以,0.5ml/min,流速冲洗色谱柱约,30,倍柱体积,再用甲醇，以,1ml/min,流速冲洗色谱柱约,10,倍柱体积,再用异丙醇，以,0.5ml/min,流速冲洗色谱柱约,10,倍柱体积。若使用的分析用流动相中含有缓冲盐类，分析完毕需先用不含缓冲盐的同比例流动相冲洗约,30,倍柱体积，再按上述方法冲洗。,再用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂以,1ml/min,冲洗约,10,倍柱体积，保存即可，一般用正己烷,-,乙腈（,99,：,1,）。,重新在正相条件下使用时，重复上述,过程即可，时间可适当减少一半左右。,2,）若需要在反相条件下使用,：,先用正己烷,-,乙腈（,99,：,1,）以,0.5ml/min,的流速冲洗约,30,倍柱体积,再依次以,0.5ml/min,的流速，用等量的氯仿,异丙醇,甲醇,甲醇,-,水（,50,：,50,）分别冲洗柱子约,10,倍柱体积,再以,0.5ml/min,的流速，用,pH11.0,以下的氢氧化钠溶液冲洗柱子约,30,倍柱体积（注意：,pH,值切不可超过,11.0,）,立即,用水以,0.5ml/min,的流速冲洗柱子约,30,倍柱体积,最后换成反相流动相平衡,1h,以上，待基线平稳，进样检测。,（备注：,若要使用的反相流动相中含有缓冲盐类，在用反相流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约,10,倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。在反相条件下使用时，要特别注意控制,pH,值范围及流动相中水的比例，,pH,值越低越易发生键合相水解，流动相中水的比例越高也越易发生键合相水解。,最理想的,pH,范围在,pH 3.0-7.0,，决不允许超过,11.0,。）,反相条件下使用完毕，净化处理程序同,C18,柱,但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于,10%,；净化完毕，先用甲醇以,0.5ml/min,的流速冲洗柱子约,10,倍柱体积,然后用异丙醇以,0.5ml/min,的流速冲洗柱子约,10,倍柱体积,最后用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂,一般用正己烷,-,乙腈（,99,：,1,）,以,1ml/min,冲洗约,10,倍柱体积,密封，保存即可。,2.2.2,氰基柱（,-CN,）,氰基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。新购氰基柱老化处理及使用基本程序与氨基柱基本相同，主要程序如下：,1,）若需要在正相条件下使用,：,用异丙醇或正己烷以,0.5ml/min,的流速冲洗约,30,倍柱体积。（备注：氰基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，,eg.,正己烷或异丙醇。）,再根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿、异丙醇或二氯甲烷以相同的流速冲洗约,10,倍柱体积。,用正相流动相平衡,1h,以上，确保柱压控制在,6000Psi,以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约,10,倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。,分析完毕，用异丙醇，以,0.5ml/min,流速冲洗色谱柱约,30,倍柱体积,再用甲醇，以,1ml/min,流速冲洗色谱柱约,10,倍柱体积,再用异丙醇，以,0.5ml/min,流速冲洗色谱柱约,10,倍柱体积。若使用的分析用流动相中含有缓冲盐类，分析完毕需先用不含缓冲盐的同比例流动相冲洗约,30,倍柱体积，再按上述方法冲洗。,再用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂以,0.5ml/min,冲洗约,10,倍柱体积，保存即可，一般用,正己烷或异丙醇,。,重新在正相条件下使用时，重复上述,过程即可，时间可适当减少一半左右。,2,）若需要在反相条件下使用：,操作和维护与,C18,柱基本相同，但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于,10%,。,新柱先用正己烷或异丙醇以,0.5ml/min,的流速冲洗约,30,倍柱体积,再依次以,0.5ml/min,的流速，用等量的水,-,乙腈（,95:5,）,THF,（四氢呋喃）,水,-,乙腈（,5:95,）分别冲洗柱子约,10,倍柱体积,最好再继续用水,-,乙腈（,5:95,）以,0.2-0.3mL/min,过夜冲洗,最后换成反相流动相平衡,1h,以上，待基线平稳，进样检测。,（备注：,若要使用的反相流动相中含有缓冲盐类，在用反相流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约,10,倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。在反相条件下使用时，要特别注意控制,pH,值范围及流动相中水的比例，,pH,值越低越易发生键合相水解，流动相中水的比例越高也越易发生键合相水解。,最理想的,pH,范围在,pH 1.5-7.0,。）,反相条件下使用完毕，净化处理程序同,C18,柱；净化完毕，先用甲醇以,0.5ml/min,的流速冲洗柱子约,10,倍柱体积,然后用异丙醇以,0.5ml/min,的流速冲洗柱子约,10,倍柱体积,最后用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂（一般用正己烷或异丙醇）以,0.5ml/min,冲洗约,10,倍柱体积,密封，保存即可。,2.3,阴,/,阳离子交换色谱柱（,negion,/,cation exchange column,）,阴,/,阳离子交换柱属于强离子交换柱，分为玻璃柱与不锈钢柱，多用不锈钢柱。阳离子交换柱填充硅胶基质，键合强阳离子基团，含有磺酸盐功能团，属于酸性离子柱，特别设计用于常规,HPLC,分析有机和无机阳离子。阴离子交换柱填充硅胶基质，键合强阴离子基团，含有季胺碱功能团，属于碱性离子柱，特别设计用于常规,HPLC,分析有机和无机阴离子。对于新柱而言，二者老化、使用与保养程序类似，主要方法如下：,（,1,）首先在开始使用系统以前检查柱子有否微生物生长，否则柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。然后，不接检测器，正向安装色谱柱，使用纯甲醇以,0.6ml/min,流速冲洗约,5,倍柱体积。,（,2,）再连接检测器，用纯甲醇以,0.6ml/min,流速冲洗约,10,倍柱体积。,（,3,）然后使用去离子水以,0.6ml/min,流速冲洗约,10,倍柱体积。,（,4,）最好再确保连接好保护柱（多使用相应柱制造商针对性提供,的保护柱），再用选用的洗脱液以,0.6ml/min,流速平衡,1h,以上，进样检测。同样，若洗脱液中含有缓冲盐类，在用分析洗脱液平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例洗脱液过渡，冲洗约,10,倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。,（,5,）,特别提示：,洗脱液要求是新制的低电导率缓冲液，或者是有,UV,吸收的缓冲液。对于阳离子交换柱，多用柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶液）、邻苯二甲酸缓冲液,，,pH,范围从,2.5,到,6.5,；对于阴离子交换柱，多用磷酸缓冲液、硝酸铵溶液（,1mMol/L,），邻苯二甲酸缓冲液，,pH,范围从,2.5,到,6.5,。绝对禁止使用水杨酸缓冲液，因水杨酸分解产物会改变固定相的性质。洗脱液在使用以前必须用,0.45,微米滤膜过滤并彻底脱气，以防止发生检测和泵送问题。,提倡在室温环境使用，为了提高分析的稳定性，可以设置高于室温,5,10,的柱温，最好不要在,40,以上使用。,2025/10/2 周四,梅特勒上海公司维修部,25,使用过程中不要超过其耐受最高压力（不锈钢柱：,4500psi,；,玻璃柱：,3000psi,）。,增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止柱床的扰动。更换柱子，必须先降低流量至,0,，等待洗脱液完全流出柱子，压力变化到,0,（约,2,分钟）后再更换。,必须防止将来自流动相或者样品中的疏水性或与流动相极性差别很大的化合物进入色谱柱，特别地，要绝对禁止导入颗粒杂质，以防止操作压力增高，污染物难以或者不能去除。,（,6,）分析完毕，净化程序基本同,C18,柱，先用去离子水以,0.6ml/min,流速冲洗约,20,倍柱体积,然后用甲醇以,0.6ml/min,流速冲洗约,10,倍柱体积，纯甲醇饱和后,密封保存即可。（注意：一定要确保在柱子内没有缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下保存色谱柱。）,（,7,）长时间保存后重新使用，重复上述（,1,）（,6,）即可。,2025/10/2 周四,梅特勒上海公司维修部,26,（,8,）使用并正确处理完毕，入库保存于防尘环境下，登记备案。,（,9,）,特别说明：,部分离子交换柱的使用条件、保存溶剂与保存条件、预平衡溶剂与方法、再生方法等有特殊要求。,eg.phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+(,酸性阳离子柱,),柱压必须控制在,600 psi,之内；流动相中有机相比例不得超过,10%,，流速应小间隔上升至,0.6ml/min,，且不得超过,0.6ml/min,，降低流速亦然；柱子用超纯水饱和后保存于,4,左右冰箱中；运行时，柱温不超过,85,。,分析完毕，用超纯水清洗,30,倍柱体积以上，密封保存。,为防止色谱柱长时间保存时长菌，应使用,0.05mol/L,左右的硫酸溶液（阳离子交换柱）或氨水溶液（阴离子交换柱）饱和后保存于,4,左右冰箱中。新柱或旧柱再次使用前均需先用去离子水，以,0.6mL/min,流速冲洗色谱柱约,30,倍柱体积，将柱内硫酸或氨水彻底洗出,然后用流动相平衡，进样检测即可。分析完毕，先用去离子水，以,0.6ml/min,流速冲洗色谱柱约,30,倍柱体积,再用,0.5mol/L,左右的,0.05mol/L,左右的硫酸溶液（阳离子交换柱）或氨水溶液（阴离子交换柱）冲洗色谱柱约,10,倍柱体积,密封，保存即可。具体流速需根据柱长与柱内径选择，一般不允许超过,0.6ml/min,，因流速过大易导致键合相随流动相流出。其他具体要求，请仔细阅读相关说明书，并以说明书为准。,2.4,手性色谱柱（,Chiral HPLC Column,）,手性色谱柱（,Chiral HPLC Column,）是由具有光学活性的单体，键合在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（,Chiral Stationary Phase,）。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体分离的目的。主要有刷（,Brush,）型或称为,Prikle,型、纤维素（,Cellulose,）型、环糊精（,Cyclodextrin,）型、大环抗生素（,Macrocyclic antibiotics,）型、蛋白质（,Protein,）型、配位交换（,Ligand exchange,）型、冠醚（,Crown ethers,）型等类型，此类色谱柱可用于正相系统与反相系统，多用于正相系统。,常用的是蛋白质（,Protein,）型，其分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用，大多可用于反相色谱条件。目前使用较多的是,-,酸