实验诊断实验课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一白细胞计数,一目的：熟悉白细胞计数方法，掌握白细胞计数参考值及临床意义。,二原理：用,2%,稀醋酸,(,冰乙酸,),作白细胞计数稀释液，可使红细胞溶解，留下白细胞，用血细胞计数板计数一定体积中的白细胞数，计算出每升血液中白细胞的总数。,三器材：白细胞稀释液、显微镜、,计数板,、采血针、小玻棒、小试管、试管架、微量吸管、小纱布、,75,酒精棉球、消毒干棉球,四步骤：1.以2冰乙酸溶液为白细胞计数稀释液，用吸管准确吸取稀释液 0.38ml，置于清洁干燥的小试管中。,2.毛细血管采血法:用微量吸管采血至20微升处，擦去管尖外围多余的血液，将管内血液迅速注入试管底部，并用上清液将管内残存血液洗净，立即混匀。待液体呈褐色后，再振荡均匀，用小玻棒取此液注入计数池内，静置23分钟。,3.用低倍镜计数,四角的四个大方格内的白细胞数,(N)。,压线细胞计数原则：数上不数下，数左不数右,。,五,计算,：,四个大方格内白细胞数,（N）(N),/4102010,6,白细胞数/升,式中：四个大方格内白细胞总数,/,4，算出,每个大方格（即0.1,微升,）内白细胞平均数。,10,把0.1微升,换算为,1微升,。,20 为血液稀释倍数,。,10,6,将1,微升,换算为1L。,六 参考值：,成人 （41,0,）10,9,/L,6个月至2岁婴儿（1112）10,9,/L,新生儿 （1520）10,9,/L,八注意事项：,1稀释倍数一定要准确（包括采血量和加稀释液量）。,2小试管、计数板一定要清洁，以免杂质、微粒等被误认为细胞。,3.一定要待稀释液转化为棕褐色后方可进行计数，此时红细胞已完全破坏，否则可因红细胞残留而干扰计数，使结果偏高。,九思考题：,白细胞总数增多的临床意义？,实验二,红细胞计数,一 实验目的：掌握红细胞计数原理和方法，熟悉红细胞参考值及临床意义。,二 实验原理：用红细胞稀释液将血液稀释一定倍数，置于血细胞计数板内，于显微镜下计数一定体积内的红细胞数，然后 再计算出每升血液内的红细胞数。,三 实验器材和试剂：,红细胞稀释液（0.85%NaCl）、显微镜、,小试管、细胞计数板、盖玻片、微量吸管、试管架、采血针、小 玻棒、75%酒精棉球、小纱布、消毒干棉球、报告单。,四 实验步骤：,1.取试管1支，加红细胞稀释1.99ml。,2.消毒皮肤，用采血针刺破皮肤，使血液自动流出，拭去第一滴血，用一次性微量吸管准确取血10微升。,3.去管尖外部余血，轻轻注入红细胞稀释液底,部，再吸取上层稀释液清洗吸管2-3次，立即摇匀。,4.倾斜试管用小玻棒沾取红细胞悬液，注入血细胞计池内，要求一次充好，不要产生气泡。静置2-3分钟，使红细胞完全沉降。,5.将计数板置于显微镜下用 高倍镜计数中央大方格红细胞计数区四个角和中间的一个中方格共5个中方格内 的红细胞。凡压在中方格边缘上的红细胞，以数上不数下，数左不数右的原则进行计数。,五 计算,R（五个中方格内RBC数）,R51010,6,200=,.,10,12,个/升,式中：,5：5个中方格内红细胞数换算为1个大方,格内红细胞数,10：1个大方格容积,（0.1微升）,换算成1微升,10,6,：1微升换算为1升,200：,血液,稀释倍数,六,实验报告方式：.10,12,/L,七,正常参考值：,成年男性：4.00-5.5010,12,/L,成年女性：3.50-5.0010,12,/L,新生儿：6.00-7.0010,12,/L,八 注意事项：,1.显微镜物镜接近计数板时应注意，勿损坏计数板及镜头。,2.计数时进入显微镜的光线要适中，否则不易找到方格。计数池内的细胞分布要均匀，各中方格的细胞相差不应超过10%，否则重新计数。,3.试管、计数板须清洁，以免杂质、微粒等被误认为红细胞。,4.,稀释倍数要准确。,5.计数完毕后，用清水将计数盘和盖玻片冲洗干净，待干后备用。,九 思考题：,1.计数不准确的常见原因有哪些？,2.红细胞数增多减少的临床意义？,实验三,白细胞分类计数,一 实验目的：掌握白细胞分类计数原理和方法，熟悉白细胞分类计数的参考值及临床意义。,二 实验原理：白细胞的胞质、胞核和胞桨颗粒等含有不同的化学成分，其与各种染料的亲和力不同。经染色后能着上不同的颜色，根据颜色的差异，可将白细胞区别并进行分类计数。,三 实验器材和试剂：显微镜 擦镜纸 75 酒精,推玻片 吸水纸 消毒干棉球,载玻片 染色架 瑞氏染色液,采血针 香柏油 缓冲液,吸球 二甲苯,四 实验步骤：1.,血涂片制备,-取末梢血一滴，置于载玻片一端，将推片的一端，放在血滴前面，逐渐后移接触血滴，血滴好沿推片散开，然后使推片与载玻片间成3045夹角，平稳向前推动至载玻片的另一端，玻片上便留下一均匀薄层血膜，自然干燥。,2.染色-将干燥后的血膜片置于染色架上。,用瑞氏染液35滴，覆盖整个血膜，固定细胞0.51min。,滴加等量或稍多的缓冲液于血膜上，用吸球将其吹匀，染色510min,。,平放玻片,，,用流水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸吸干，即可镜检。,3.镜检-在低倍镜下观察细胞着色情况，然后选择血涂片体尾交界部染色良好的区域滴加一滴香柏油，在油镜下按一定的方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类，既不得重复亦不遗漏，共计数100个白细胞。求出,各类白细胞所占的百分率,。,瑞氏染色外周血五种白细胞形态特征：,细胞类型,大小（,m,）,外形,细胞核,细胞质,核形,染色质,着色,颗粒,中性杆状核粒细胞,10,15,圆形,弯曲呈腊肠样，两端钝圆,深紫红色粗糙,淡橘红色,量多，细小，均匀布满胞质，浅紫红色,中性分叶核粒细胞,10,15,圆形,分为,2,5,叶，以,3,叶为多,深紫红色粗糙,淡橘红色,量多，细小，均匀布满胞质，浅紫红色,嗜酸性粒细胞,11,16,圆形,分为,2,叶，呈眼镜样,深紫红色粗糙,淡橘红色,量多粗大，圆而均匀，充满胞质，鲜橘红色,嗜碱性粒细胞,10,12,圆形,核结构不清，分叶不明显,粗而不匀,淡橘红色,量少，大小和分布不均，常覆盖核上，蓝黑色,淋巴细胞,6,15,圆形或椭圆形,圆形或椭圆形，着边,深紫红色块粗糙,透明淡蓝色,小淋巴细胞一般无颗粒，大淋巴细胞可有少量粗大不均匀，深紫红色颗粒,单核细胞,10,20,圆形或不规则形,不规则形，肾形，马蹄形，或扭曲折叠,淡紫红色，细致疏松呈网状,淡灰蓝色,量多细小，灰尘样紫红色颗粒弥散分布于胞质中,中性杆状核粒细胞,中性分叶核粒细胞,淋巴细胞,单核细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞,外周血各类白细胞的百分率及绝对值,血涂片的制备,五 注意事项：,1.所制血膜片一定要均匀，厚薄适宜，头、体、尾分明。,2.玻片需清洁，血膜干透后才可固定染色。,3,.染色时间的长短与染液的浓度、室温高低及有核细胞多少有关。染液浓度愈小、室温愈低、细胞愈多、所需时间愈长。必要时可增加染液量或延长时间。,4,.染液不宜过少，以免蒸发干燥，导致染料沾着于血膜上不易冲掉。,5.,冲洗时不可先倒掉染液，应让流水从血膜一端缓缓将染液冲去，以免染料残渣附在血膜上,。,六 思考题：,白细胞分类计数的临床意义？,实验四,网织红细胞计数,一 实验目的：,熟悉网织红细胞计数的原理和测定方法，掌握网织红细胞参考值及临床意义。,二 实验原理：,网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞质中含有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质，经新亚甲蓝活体染色后呈浅蓝或深蓝色的网状结构，可区别于完全成熟的红细胞。,三 实验器材和试剂：显微镜、10g/l新亚甲蓝染液，试管、载玻片、香柏油,四 实验步骤：,1.取小试管1支加10g/l新亚甲蓝染液1滴。,2.加入血液1滴于上述试管中，混匀。,3.室温下放置1015分钟后，取1滴制成血膜片。,4.在低倍镜下选择细胞分布均匀，着色清晰的部位，用油镜计数1000个红细胞内网织红细胞数。,五 计算：网织红细胞百分数网织红细胞数/1000,六 参考值：成人：0.005-0.015 (0.5%1.5%),新生儿：0.03-0.06 (3%6%),七 注意事项：,1.网织红细胞必须用新鲜血液活体染色才能显示，染液与,血液的比例1：1为宜,2.,血膜制备技术很重要。红细胞应均匀散开，如有重叠,则影响结果的准确性。,网织红细胞体积较成熟红细胞体积稍大，多分布于涂片,的尾部及两侧，故进行计数时应巡视整个血涂片中网,红细胞分布情况再进行计数。,3,.染料配制前必须过滤，放置保存过程中应防止有任何沉淀出现以影响计数结果。,4,.,为便于计数，可使用,米勒窥盘,进行计数。,5,.血液与染液混合时间必须足够长。,八 思考题：网织红细胞的临床意义？,Miller窥盘为一厚1 mm，直径19mm的,圆,形玻片，玻片上的微细刻线划分成大小两个正方形。,B,为小正方形，,A,为大正方形。,B,位于,A,之内，如附图所示。其中,B,的边长为,A,的边长的13，故其面积为,A,的19,。将Miller窥盘置于接目镜内检测网织红细胞涂片。用小正方形（B）计数红细胞,大正方形（A）计数网织红细胞数,再接下式计算:,网织红细胞%=A格内网织红细胞/（B格内红细胞数9）100%,实验五,凝血酶原时间（,PT,）测定,凝血酶时间（,TT,）测定,一 实验目的：掌握,PT,TT,实验的原理、操作方法和临床意义。,二 实验原理：,PT,原理：在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固所需的时间，即为血浆凝血酶原时间。本试验是外源性凝血系统常用的筛检试验，此外，常利用本试验对口服抗凝剂治疗进行监控。,TT,原理：受检血浆中加入标准化的凝血酶溶液后，测定血浆凝固所需要的时间，即为血浆凝血酶时间，,TT,主要用于检测血浆纤维蛋白原的减少或抗凝物质的增多。,三 实验试剂和器材：待测血浆、,37,度水浴箱、硅化试管、秒表、加样枪、氯化钙凝血活酶试剂、凝血酶溶液。,四 实验步骤：,PT:,取待测血浆,0.1ml,，,37,孵育,3,分钟，加入,37,预温,PT,试剂,0.2ml,记录凝固时间，即为,PT,值。,TT,：取,37,预温待测血浆,0.2mL,加入,TT,试剂,0.2ml,，记录凝固时间，即为,TT,值。,注意：,TT,试剂不需,37,预温，,15-25,室温直接使用。,五 参考值：,PT 1,0,-1,4,秒,TT 10-16,秒,六注意事项：,1.,采血必须使用一次性塑料注射器或硅化玻璃注射器，贮血必须使用塑料试管或硅化玻璃管。,2,血浆分离后应尽快测定。,3,血浆预温不宜超过,10,分钟。,4,凝血活酶预温不可超过,30,分钟。,5,待测血浆应使用,0.109mo,1,L,枸橼酸钠抗凝。,6,手工操作时，凝血酶原和凝血酶时间的终点计算以出现混浊的,初期凝固为准。,7.,测定温度,36,5,38,5,，过低或过高温度均使,PT,、,TT,延长。,七 临床意义：,1.PT,延长：见于先天性凝血因子异常，如因子,、,、,、,、,缺乏症；后天性凝血因子异常，如弥漫性血管内凝血、原发性纤溶、维生素,K,缺乏症、严重肝病；血循环中有抗凝物质，如口服抗凝剂、肝素和,FDP,等。,2,PT,缩短,:,见于高凝状态和血栓性疾病、先天性因子,增多症、口服避孕药等。,3.TT,延长：以,DIC,时纤维蛋白原消耗为多见，也有部分属于先天性低（无）纤维蛋白原血症、原发性纤溶及肝脏病变。也可见于肝素增多或类肝素抗凝物质增多。,4.TT,缩短：极为罕见，主要见于某些异常蛋白血症或巨球蛋白血症时，此外较多是技术原因，如标本在,4,度环境中放置过久，组织液混入血浆等。,实验六,尿常规检查,尿液的常规检查包括：,物理学检查：尿量、气味、颜色、透明度,化学检查：蛋白、糖、,PH,、酮体、尿胆红素、尿胆原、尿亚硝酸盐、尿隐血、白细胞、比密、维生素,C,尿沉渣（显微镜）检测：,尿液细胞、管型、结晶、上皮,等,一般性状检查：,1、尿量：正常尿量 1000-2000,ml/24hr,平均1500,ml,少尿：400,ml/24hr,或持续17,ml/hr,无尿：2500,ml/24hr,2.,尿液外观：,正常尿的颜色：多为澄清透明至淡黄色或琥珀色，,颜色常受食物、药物、尿色素（尿胆原、尿胆素、尿卟啉）的影响。,病理性尿液外观,1.,血尿,：,尿中含有一定量红细胞，可呈淡红色云雾状、水洗肉样（量少时）、红色血凝块（量多时）。,2.,肉眼血尿：每升尿中含血量超过1,ml,，即可出现淡红色。,3.,显微镜血尿：尿外观无明显变化，离心沉淀后镜检，平均3,RBC/Hp,4.,血红蛋白尿：可使尿液呈浓茶色、红葡萄酒色或酱油色。隐血试验为阳性（正常尿液试验隐血为阴性）,血红蛋白尿：见于严重的血管内溶血：阵发性血红蛋尿、蚕豆病、血型不合的输血反应。,5,.,胆红素尿：尿就中含有大量结合胆红素，呈豆油样改变，振荡后出现黄色的泡沫且不易消失。,常见：阻塞性黄胆和肝细胞性黄疸。,6.,脓尿和菌尿,：,新鲜排出的尿液呈白色混浊（脓尿）或云雾状（菌尿）加热加酸不溶解，内含脓细胞、炎性渗出物或细菌。,常见：泌尿道感染：肾盂肾炎、膀胱炎,尿中红细胞,尿中白细胞,脓细胞,7.,乳糜尿和脂肪尿：,乳糜尿：乳糜液逆流进尿中所致外观呈不同程度乳白色，当含有,较多血液时呈乳糜血尿,。,常见：肿瘤、结核、丝虫病及周围淋巴管,梗阻。,脂肪尿：尿中出现脂肪小滴。常见：脂肪挤压损伤、骨折、肾病,综合征，可通过乙醚等有机溶剂提取乳糜颗粒、脂肪小粒使尿液变,清，可与其他混浊尿鉴别。,气味：,来自尿中的挥发性酸和酚类，新鲜的尿特殊微弱芳香气味,氨臭味：久置尿、但尿液新鲜时可为慢性膀胱炎、慢性尿潴溜,苹果样气味：糖尿病、酮症酸中毒,蒜臭味：有机磷中毒,进食葱、韭菜、蒜和某些药物可呈相应气味。,干化学检查,试剂带原理,绒制层,：包括碘酸盐层和试剂层：,碘酸盐层：可以破坏维生素,C,等干扰物质，,试剂层：含有试剂成分，主要与尿液中测定物质发生化学反应，产生颜色变化；,吸水层,：可使尿液均匀快速的浸入，并能抑制尿液流到相邻的反应区；,塑料底层：作支持体。,各项目测定原理,项目,缩写符号,反应原理,PH,PH,PH,指示剂（甲基红和溴麝香草酚兰）,蛋白质,PRO,PH,指示剂的蛋白质误差法,葡萄糖,GLU,葡萄糖氧化酶法,隐血,BLD,Hb,类过氧化酶法,各项目测定原理,项目,缩写符号,反应原理,胆红素,BIL,偶氮反应法,尿胆原,URO,醛反应法，重氮反应法,酮体,KET,硝基铁氢化钠法,亚硝酸盐,NIT,亚硝酸盐还原法,白细胞,LEU,脂酶法,比密,D(SG),多聚电解质离子解离法,尿沉渣（显微镜）检测,尿液沉渣检测是对尿液离心沉淀物中有形成分的鉴定。,传统的尿液沉渣检测：显微镜对尿液沉渣进行定性、定量检查及有形成分的记数。,现在用尿液分析仪、尿沉渣分析仪。对有形成分检测细胞、管型和结晶等进行自动检测。,尿沉渣检测的标准方法：,取新鲜混匀的尿液10,ml,于离心管内，以1500,rmin,离心,5min，,弃去上清液，留取0.2,ml,沉渣液，混匀后用下列方法检查：,玻片法：,尿沉渣定量分析板法：本法是用特制的尿沉渣定量分析板,尿沉渣定量分析工作站：,移取1滴（约50,ul）,混匀的尿沉渣液于载玻片上，加盖玻片后，低倍镜（10,X 10）,下观察 20个视野，管型以每低倍镜视野（,LP）,平均数报告；高倍镜（10,X 40）,下鉴定管型并观察 10个视野，细胞则以每高倍视野（,HP）,平均数报告。有时以十、十分别表示细胞数510个,HP、1015,个,HP。1520,个,HP,和大于20个,HP。,玻片法,Red Blood Cells,红细胞,(LPF),Red Blood Cells,红细胞,Red Blood Cells,异常红细胞,White Blood Cells,白细胞,Hyaline Casts,，透明管型,Cellular Casts,，细胞管型,Granular Casts,，颗粒管型,