基因工程-第4章-基因工程载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：,1、分子较小，可携带比较大的片段。,2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。,3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点,multiple cloning sites,，MCS）。,4、有适合的标记，易于选择。,5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。,6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。,质粒*,受体细胞,结构,插入片断,举例,E.coli,环状,8*,p,UC18/19,T-载体pGEM-3z等,噬菌体,E.coli,线状,9-24kb,EMBL系列，,gt系列,丝状噬菌体及噬菌粒,E.coli,环状,10 kb,M13mp系列,粘粒载体,E.coli,环状,35-45kb,pJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCV,BAC(Bacterial Artificial Chro,mosome),E.coli,环状,300 kb,Pel oBAC系列,PAC(P1-derived Artificial chromosome),E.coli,环状,100-2000 kb,PCYPAC1,YAC(Yeast Artificial chromosome),酵母细胞,线性染色体,100-2000 kb,MAC(Mammalian Artificial Chromosome),哺乳类细胞,线性染色体,1000 kb,病毒载体,动物细胞,环状,SV40 载体，昆虫,杆状病毒载体,穿梭载体,动物细胞,和细菌,环状,pSVK3质粒，PBV,Ti质粒,载体的种类和特征,第一节 质粒（plasmid）载体,质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约,10,6,10,8,D,，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改造后便可成为良好的载体。,作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,质粒（plasmid）,是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA,分子。大小约为,数千碱基对。常,有1,3个抗药,性基因，以利于,筛选。,质粒载体,克隆,的,质粒载体,允许外源的,DNA,插入，储存。主要是,DNA,水平上的操作。,基因表达的质粒载体,允许外源,DNA,的插入、储存和表达。,一、,质粒的生物学特性：,1、,质粒DNA的构型：,SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA）,OC型 开环DNA（ocDNA）,L型 线性DNA（LDNA）,2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：,10,6,1,0,8,D,3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：,复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点,L,OC,SC,4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。,抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子等。,5、质粒DNA的类型：,接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌,素抗性基因的R质粒；F因子和F因子等。,按接合转移功能分类,主要基因,按抗性记号分类,非接合型质粒,自主复制基因，产生大肠杆菌素基因,Col质粒,自主复制基因，抗菌素抗性基因,R质粒(R因子),接合型质粒,自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段,F质粒（F因子）,自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因,Col质粒,自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因,R质粒(R因子),自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因,Ent质粒,6、质粒DNA的复制类型：,低拷贝的质粒（13）：严紧型复制控制的质粒,（接合型）,高拷贝的质粒（1060）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）,7、质粒的不亲合性,在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。,是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。,二、质粒载体的构建与类型,1.,天然质粒：,没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。,在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR I,酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tet,r,），插入外源片断后不影响其复制功能，,但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。,ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoR I中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。,但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。,2.,质粒载体必须具备的基本条件,(1)、具有复制起点；,自我增值的基本条件，一般具,一个,复制子。,(2),、具有抗菌素抗性；,理想的质粒载体具有,两种,抗菌素抗性基因。,(3)、具有若干限制酶切,单一,位点（CMS）；,(4)、具有较小的分子量和较高的拷贝数。,低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断,后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多种识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因,以Amp,r,和Tet,r,为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择Amp,r,Tet,s,或Amp,s,Tet,r,的重组子。,（4363bp）,3.,质粒载体的选择记号,新陈代谢特性；,对大肠杆菌素E1的免疫性；,抗菌素抗性；,四环素抗性、氨苄青霉素抗性、,链霉素抗性、卡那霉素抗性,大多数质粒本身带有抗菌素基因；,抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。,三、重要的大肠杆菌质粒载体,1、pSC101质粒载体；,2、ColE,1,质粒载体；,3、pBR322质粒载体；,4、pUC质粒载体；,1.,pSC101质粒载体,一种严谨型复制控制的拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1,2,个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tet,r,）。有Hind III,、,EcoR I,、BamH I、Sal I、Xho I、Pvu II、Sma I等 7种核酸内切限制酶。其中在,Hind III,、BamH I和Sma I等3个位点克隆外源DNA，都会导致,tet,r,基因失活。,是第一个真核生物的克隆载体。,2.,ColE,1,质粒载体,松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。,3.,pBR322质粒载体,“P”表示是一种质粒；,“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;,“322”表示实验编号。,pBR322的构建：,为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）,pBR322的结构来源,pBR322质粒载体的优点：,1、具有较小的分子量；,它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。,2、,具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。,pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致,tet,r,基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，,3、具有较高的拷贝数，而且经过,氯霉素扩增,之后每个细胞中可积累1000,3000个拷贝。,pBR322质粒载体的改良,为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。,4.,pUC质粒载体,人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：,1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2、氨苄青霉素抗性基因（amp,r,）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。3、大肠杆菌,-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因；4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。,Amp,r,ori,pUC18,(3 kb),MCS,(Multiple cloning sites,多克隆位点）,Lac promoter,lacZ,pUC质粒载体的形体图,pUC质粒载体的优点,第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。,第二，适用于组织化学检测重组体；,具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，用Xgal,（,5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷,）显,色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。,第三，具有多克隆位点MCS区段,方便，具有不同粘性末端的外源片断的插入。,第二节 噬菌体载体,（,Bacteriophage,，简称,phage,）,一、噬菌体的一般生物特性,可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。,除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：,1,、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏；,2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；,3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒；,4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒,1.,噬菌体的结构和其核酸类型,：,结构：,无尾部结构的二十面体型、,具尾部结构的二十面体型、,线状体型,核酸类型：最常见的是双链线性DNA、,双链环形DNA、,单链环形DNA、,单链线形DNA、,单链RNA。,2.,噬菌体的溶菌生命周期,噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期,只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。,烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：,1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上,2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞,3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所,4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质,5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒,6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来,3.,噬菌体的溶源生命周期,溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。,二、噬菌体载体,phage,48.5 kb in length,Linear or circular genome(,cos,ends,),溶菌阶段,(复制和释放),溶源阶段,(整合到寄主染色体上),噬菌体载体的主要类型,1.,插入式载体,一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。,2.替换型载体（取代型载体）,具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的,DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。,3.凯伦噬菌体载体,插入式载体：,噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。,cI,基因（,阻遏蛋白基因,）插入失活：如,gt10,、,NM1149,等载体，在,cI,基因上有,EcoR,I,及,Hind III,的酶切位点。外源基因插入后将导致,cI,基因的失活。,cI,基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。,Lac Z,基因插入失活：如,charon16A,载体，在非必须区段引入,lac,Z,基因，在,lac,Z,基因上有,EcoR,I,位点，插入失活后利用,X-gal,法筛选（兰白筛选）。,cI,EcoR I,LA 32.7,RA10.6,gt 10,lac Z,LA 19.9,RA21.9,EcoR I,Charon 16A,替换型载体（取代型载体）,外源,DNA,取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段,(,20kb,),高感染效率,(10,9,转化株,/,ug,载体,DNA,比质粒高,100,倍,),e.g.EMBL3,DASH,替换式载体,野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，,例如Charon 4A、EMBL 3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染,E.coli,使之在,E.coli,内繁殖，并裂解,E.coli,，形成空斑。,替换型噬菌体是使用最广泛的载体。,Lac 5,EcoR I EcoR I,EcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I,MCS MCS,Charon 4A,EMBL3/4,Charon 40,替换型载体克隆外源DNA的步骤,1.应用适当的核酸内切酶消化载体，,除去可取代的DNA片段；,2.将上述所得的,DNA载体臂同外源,DNA片段的连接；,3.对重组体的DNA分子进行包装和增,殖，以得到有感染性的重组噬菌体,体外包装,噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入,E.coli,细胞内。这是因为以,感染,方式导入细胞的频率可达10,6,10,8,/g DNA，而以转染（translation,）的方式导入的频率仅为10,3,10,5,/gDNA。,三、噬菌粒载体,噬菌粒载体,由,质粒,载体和,单链噬菌体,载体结合而成的新型的载体系列。,它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在,辅助噬菌体,的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。,常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119,1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆,10kb,的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；,2.一个amp,r,基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；,3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；,4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；,6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；,7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子,8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；,9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；,10.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。,pBluescript噬菌粒载体,基本结构：,1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；,2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；,3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；,4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。,T7,T3,用于体外转录,四、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体,cosmid载体,：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由,噬菌体的cos（cohesive）末端,及,质粒,（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,柯斯质粒载体的特点,具有,噬菌体的特性；,具有质粒载体的特性；,具有较高容量的克隆能力；,具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb,设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可像噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。,五、其他载体,酵母人工染色体载体,（yeast artificial chromosome,YAC）,细菌人工染色体,（bacterial artificial chromosome,BAC）,动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）,人基因组十分庞大，约含410,9,bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要,the capacity to clone large exogenous DNA fragments(up to 2 Mb)has made YACs a vital tool in physical mapping,The functional elements of a yeast chromosome,正常酵母人工染色体含有：,*四膜虫端粒（,tel),*酵母自主复制序列（ARS),*酵母着丝点(CEN),*酵母的选择标记(TRP1、URA1),YAC载体,