生物基因的表达及调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、基因表达的概述：,从基因到蛋白质,中心法则,：,DNA,mRNA,蛋白质,转录,逆转录,翻译,复制,二、基因表达调控的基本概念与原理：,基因表达调控的概念及方式：,基因：,一个遗传单位，是一段可表达的,DNA,序列。,基因组：,一个单倍体细胞或病毒颗粒的全套基因。人类基因组含约4万个基因。,基因表达：,基因所包含的遗传信息通过转录生成,RNA，,再经过翻译生成蛋白质的过程。一般而言，在某一特定时刻，高等生物仅有不到15%的基因表达。,基因表达调控：,基因表达有其特定的规律，并受到机体各种因素的调节和控制。对基因的表达实施精确的控制，使细胞适应不同阶段、不同环境条件下的生长与发育的需要，维持机体正常生命活动，有着重要意义。,可诱导基因：基因表达的时间特异性,基因表达的空间特异性（组织特异性）,看家基因:,2.基因表达调控的基本原理：,原核,生物和真核生物的基因表达调控尽管在细节上差异很大，但两者的调控模式和原理极为相似。,调节作用主要包括核酸之间的相互作用、核酸与蛋白质之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。,调控作用可能是正向的或负向的。,调控点可以位于基因表达过程的各个环节，如基因的激活、转录起始、转录后加工、,mRNA,降解、蛋白质翻译、翻译后加工和蛋白质降解等。,特异,DNA,序列对基因表达的影响：,真（原）核生物,DNA,分子上的特定序列构成了基因表达的基本信号：起始密码、调控序列、编码序列、终止密码、单拷贝序列、重复序列等。,三、原核生物的基因表达调控：,原核生物结构简单、无细胞核，转录和翻译过程耦联在一起，对环境条件的变化反应迅速，可以根据环境因素的变化迅速调整自身基因的表达，满足其生长和繁殖的需要。原核基因表达调控的特点为：,普遍存在操纵子调控模式,通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录,转录与翻译的耦联,转录水平的调控：,乳糖操纵子的调控：,阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节,2）其它转录调控机制：,转录衰减：,基因重组：,翻译水平的调控：,SD,序列对翻译的影响：,SD,序列是原核生物,mRNA,起始密码子,AUG,上游3-10碱基的由3-9个碱基组成的一个富含嘌呤核苷酸的序列，能与核糖体小亚基16,s rRNA3,末端富含嘧啶的序列互补，从而使核糖体与,mRNA,结合，开始翻译。,mRNA,的稳定性：原核细胞内,mRNA,通常很快被降解。例如：,E.,coli,的许多,mRNA,在37时的平均寿命只有大约2分钟。,翻译产物对翻译的影响：有些,mRNA,编码的蛋白质，本身就是在蛋白翻译过程中发挥作用的因子。这些因子可对自身的翻译产生调控作用。如起始因子3（,IF-3），,当它合成过多时，能有效地校正和抑制其自身的起始密码子与起始,tRNA,的,配对而抑制翻译的起始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。,四、真核生物的基因表达调控：,真核生物基因表达调控与原核不同点在于：,转录激活与染色体转录区特定结构相适应,正性调节占主导,转录与翻译在空间上的分离,更多、更复杂的调控蛋白,（一）、,DNA水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：,染色质（,chromatin）,结构对基因表达的调控作用：,真核基因通常与组蛋白（,histone,）,结合形成核小体，从而保护,DNA,免受损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达。影响基因表达水平的主要有：,组蛋白的含量,组蛋白的结构,调节蛋白与组蛋白,H1,和,H5,竟争和,DNA,的结合，从而解除组蛋白对基因表达的抑制作用。,基因修饰对基因表达的调控作用：,胞嘧啶经甲基化为5-甲基胞嘧啶（常出现在5端侧翼序列的,GC,丰富区），影响,DNA,特异序列与转录因子的结合，使基因不能转录或阻止转录复合物的形成。,基因丢失：,在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。,染色体破碎所致的不均等分配。,仅发生在低等生物中（原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。,基因扩增：,细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是细胞在短期内为满足某种需要（发育需要、外界环境因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。,基因重排：,基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一种熟知的以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接：,一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。,轻链：可变区、恒定区、连接区都由位于同一染色体不同位置的,DNA,片段编码，在形成活性基因前，上述各一个基因通过染色体内重组成连到一起。,重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区,（二）、转录水平的调控：,转录水平的调控是真核基因表达调控中,最重要,的环节，大多数生物基因在转录水平的调控是决定细胞质中mRNA水平的一个最重要方式，调控主要通过反式作用因子和RNA聚合酶的相互作用来实现。,反式作用因子,是一类细胞核内存在的蛋白质，是与特异的,DNA,序列（顺式作用元件）结合的调控蛋白。它通过识别并结合上游启动子元件和增强子中的顺式元件，激活或阻遏基因的表达。它包括三个功能域：,DNA,识别结合域（常有锌指结构）,转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）,蛋白质相互作用结构域（常具有亮氨酸拉链结构和螺旋环螺旋结构等）。,转录起始复合物:,转录起始复合物的形成过程有三步：,TATA,因子结合,TATA,盒（形成,TATA,因子,DNA,复合物）,RNA,pol,识别并结合,TATA,因子,DNA,复合物（闭合复合物，,DNA,双链没有打开，不能启动转录）,转录起始因子与,RNA,pol,结合，形成转录起始复合物（开放复合物，,DNA,双螺旋已打开，可以合成,RNA）,转录起始的调控：,基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和,RNA,聚合酶的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。,反式作用因子的活性调节：,表达调节：迅速合成、迅速降解,共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化,配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）,蛋白质与蛋白质相互作用：,max,蛋白,c-,myc,蛋白（核内的反式作用因子）,反式作用因子与顺式元件结合的调节：,顺式作用元件包括：,上游启动子元件,远距离的增强子元件（上游增强子元件、下游增强子元件）,反式作用因子作用方式的调节：,反式作用因子通过下列不同的方式作用到,RNA,聚合酶结合位点从而影响其转录活性：,成环,扭曲,滑动,连锁反应,反式作用因子的组合式调节：,几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。,（三）、转录后水平的调控：,转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列修饰、加工过程，主要包括mRNA选择性剪切、胞内定位以及mRNA稳定性调节：,DNA,（核内）,转录,mRNA,前体,加工,成熟,mRNA,运输,细胞质,mRNA,前体加帽、加尾以调控其稳定性：,5加帽（,capping）：7,甲基鸟苷三磷酸,3端加尾（,tailing）：,多聚,A（Poly A）,mRNA,前体的选择性剪接（,splicing）,与拼接：,选择性剪切：去除,mRNA,前体中的内含子,选择性拼接：从同一基因产生若干种有部分相同结构的蛋白质，即通过,Mrnau,前性的选择性拼接而产生不同的成熟,mRNA,，,然后翻译成不同的蛋白质。,选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定的细胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性的表达。,RNA,编辑的调控：,RNA,编辑（,editing）：,是指转录后的,mRNA,前体在,编码区发生核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括：,核苷酸的替换,核苷酸的插入或缺失,mRNA,转运的调控：,mRNA,前体,经过加帽、加尾、剪切等加工后通过核膜孔从核内运至胞浆。,大约只有20%的,mRNA,进入胞浆，留在核内的,mRNA,约,50%会在1小时内降解。,（四）、翻译水平的调控：,翻译水平的调控主要是控制mRNA的稳定性和mRNA翻译的起始频率，是一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采用的调控方式。,mRNA,的稳定性，取决于：,mRNA,的二级结构（不易受外切酶攻击）,帽子及其种类,polyA,尾的长短,与,mRNA,结合的蛋白质的种类,mRNA,翻译起始的调控（即控制,mRNA,的可翻译性）：,许多蛋白质因子可以影响蛋白质合成的起始，如真核生物起始因子2（,eukaryotic,initiation factor，,eIF,-2）,的磷酸化会使其活性降低，从而减少蛋白质合成。,Recruitment factor,可使,masked,mRNA,与核糖体、氨酰基-,tRNA,、,蛋白质结合。,真核生物蛋白质合成的自体调控：,某些蛋白可抑制其自身,mRNA,的翻译,（五）、翻译后水平的调控：,mRNA翻译的产物新生多肽链大多是没有生物学流行性的，必须经过加工、修饰才能成为有流行性的蛋白质，加工、修饰过程包括：,信号肽的切除：由1530个疏水氨基酸组成的信号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。,新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。,肽链的剪切与正确折叠,五、蛋白表达水平的检测,蛋白质的检测：,SDSPAGE,与,Western blot,ELISA,蛋白质芯片,mRNA,的检测：,Northern blot,RT-PCR,Nuclei run-on,基因芯片,DNA,的检测：,PCR,Southern blot,DNA,测序,SDSPAGE与Western blot,原理：,确保蛋白质解离为单个多肽亚基（,SDS）,通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离,将,蛋白质固定于尼龙膜上,以抗体识别待检蛋白（抗原）,固,定,物,1Ab,2Ab,E,蛋白质,（抗原）,2.操作过程,样品制备：,收集细胞,PBS,洗涤并离心沉淀细胞,加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟,高速离心，取上清（蛋白溶液）,加入等量2,XSDSPAGE,样品缓冲液,煮沸5分钟后上样（或保存于20）,制胶（不连续缓冲胶系统）：,胶的成份：,压缩胶,分离胶,胶,浓度的选择：,丙烯酰氨浓度,蛋白线性分离范围/KDa,15,12,10,7.5,5,1043,1260,2080,3694,57212,加样与电泳：,加适量的样品（2001000,ug,总蛋白量）、对照及蛋白分子量,marker,180200volts,电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（,Bio-,Rad,电泳装置）,凝胶染色：,考马斯亮蓝（,R250）,染色,银染,印迹转移：,原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上,4条件下，300,mA,电泳13小时（,Bio-,Rad,电泳装置）,封闭：,5%脱脂牛奶或5%,BSA，,室温下1小时（或4过夜）,一抗反应：,选择合适的第一抗体,适量抗体以5%脱脂牛奶或5%,BSA,稀释,室温下1小时（或4过夜）反应,二抗反应：,选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体,适量抗体以5%脱脂牛奶或5%,BSA,稀释,室温下1小时（或4过夜）反应,加生色底物显色,HRP,的底物：,生色：4氯1萘酚/,H,2,O,2,发光：,ECL,溶液（鲁米诺/4碘代酚/,H,2,O,2,）,AP,的底物：,生色：氮蓝四唑/5溴4氯吲哚磷酸,发光：,AMPPD,拍片或曝光、洗片,0 hr,2 hr,4 hr,6 hr,8 hr,10 hr,12 hr,14 hr,p53,p21,-,Tubulin,Time after irradiation,DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest,优缺点：,优点：,不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化,用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实,实验简单可靠、重复性好,缺点：,不能反映蛋白质变化的中间过程,灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化,对抗体的依赖度高,应用,：,直接检测蛋白质的有无、变化,可直接检测部分蛋白的功能,与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用,酶联免疫吸附试验（ELISA）,原理：,将可溶性蛋白质（单一组分或混合组分）固定于酶标板壁上,抗原或抗体,检测待检蛋白,抗体或抗原,2.操作过程（间接法、双抗体夹心法）,样品处理：,已知样品必须是可溶性蛋白溶于,PBS、,水等,样品可以是单一组分或混合组分,包板：,适量的抗原以高,PH,溶液（,PH7.67.8,的碳酸盐缓冲液）或低,PH,溶液（,PH4.8,枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板,4反应12天,PBS,洗涤后，即可使用该板或可较长期保存,封闭：,4%脱脂牛奶或4%,BSA，,室温下1小时（或4过夜）,一抗反应：,选择合适的第一抗体,适量抗体以4%脱脂牛奶或4%,BSA,稀释,室温下1小时（或4过夜）反应,二抗反应：,选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体,适量抗体以4%脱脂牛奶或4%,BSA,稀释,室温下1小时（或4过夜）反应,加生色底物显色：,HRP,的底物：,H,2,O,2,/TMB,终止：2,M H,2,SO,4,结果判断：,目测法,仪器法,优缺点：,优点：,用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实,方法简单（多样）、快速,可大批量检测标本,敏感性较高,缺点：,不能反映蛋白质变化的中间过程,多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化,特异性相对较低，重复性相对较差,对所用抗体的依赖度高,应用,：,大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化,Northern Blot,原理：,将,RNA,固定于尼龙膜上,以,DNA,探针识别待检,mRNA,2.操作过程,总,RNA,提取：,用,Rneasy,Mini Kit,抽取总,RNA（QIAGEN,公司）,用700,ul,SW1,洗一次,用500,ul,RPE,洗2次,用50,ul RNase,free ddH,2,O,洗脱两次,取2,ul,加入98,ul,ddH,2,O，,测取,OD260/280,并计算,RNA,浓度及总,RNA,得量,制胶（变性11.5%,Agarose,胶）：,制备100,ml,含有2.2,mol/L,甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶，加1.5克琼脂糖凝胶粉到72,ml,灭菌水中，煮沸溶解后置55水浴，均衡后10,ml MOPS,电泳缓冲液和18,ml,去离子甲醛，在化学通风橱内灌胶,加入足够量的1,XMOPS,电泳缓冲液，预电泳约5分钟。备用。,RNA,样品预处理：,在一灭菌,EP,管中建立变性反应：,RNA（,多达20,ug,）2.0,ul,10XMOPS,电流缓冲液2.0,ul,甲醛4.0,ul,甲酰氨10.0,ul,溴化乙淀1.0,ul,6520,分钟变性，立即置冰上10分钟,简短离心后备用,电泳：,上样：等量总,RNA/,样品,45,volts/cm,电泳57小时。,不能用过高的电压！,转移：,经典方法：搭建“金字塔”，转移过夜。,支持物,重物（400克）,琼脂糖凝胶,滤纸,滤纸桥,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,20XSSC,上行毛细管转移示意图,DNA,探针的制备：,在一灭菌,EP,管中建立反应：,2.0,ul,模板,GAPDH PCR,产物（150,bp,100ng/,ul,）,6.0ul10 X,EcoPol,buffer,6.0ul,dNTPs,（,无,dCTP,）,3.0ul5-GAPDH(100ng/,ul,),3.0ul3-GAPDH(100ng/,ul,),31.0ul,ddH,2,O,煮沸10分钟，立即置冰上10分钟：,加入：2.5,ulKlenow,6.5ul,32,P-,dCTP,室温下孵育6小时,过柱纯化已标记探针（,Phamarcia,试剂盒）,取,相等,CPM,量,RNA，,加入2,ml TES/0.6M,NaCL,10mM TES,10mM EDTA,0.2%SDS,在杂交炉中，68反应过夜,用2,XSSC/0.1%SDS,洗膜三次,用0.1,XSSC/0.1%SDS,洗膜三次,曝光于,X,光胶片,Crosslink,预,杂交,加入10,ml,杂交混合液，,68反应45分钟,杂交,H2A,H3,H4,GAPDH,0 hr,2 hr,4 hr,6 hr,8 hr,10 hr,12 hr,14 hr,Time after irradiation,C,.,H2B,H1,DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest,HCT116（p53+/+,p21+/+),D.,E,.,0 hr,2 hr,4 hr,6 hr,8 hr,10 hr,12 hr,14 hr,24 hr,H2A,H4,GAPDH,Time afer GFP-p21 induction,H1,H2B,H3,Inhibition of CDK activity disperses NPAT from histone gene promoters and down-regulates histone gene expression,A.,0,20,40,60,80,100,120,0,4,6,8,10,12,14,Time after irradiation(hr),%control,S phase,H1,H2A,H2B,H4,H2A,H4,GAPDH,H2B,H1,0 hr,4 hr,6 hr,8 hr,10 hr,12 hr,14 hr,Time after irradiation,HCT116（p53-/-,p21+/+),Down-regulation of histone gene expression induced by,DNA damage depends on p53 and p21,S phase,H1,H2A,H2B,H4,B,H2A,H4,GAPDH,H2B,H1,Time after irradiation,0 hr,2 hr,4 hr,6 hr,8 hr,10 hr,12 hr,14 hr,0,20,40,60,80,100,120,%control,0,4,6,8,10,12,14,Time after irradiation(hr),2,HCT116（p53+/+,p21-/-),Down-regulation of histone gene expression induced by,DNA damage depends on p53 and p21,优缺点：,优点：,真实反映细胞处理后,mRNA,水平的变化,敏感性较高,缺点：,使用同位素,不能反映蛋白质变化的最终结果及,mRNA,变化的原因,多用于检测细胞内较高丰度,mRNA,的,变化,实验过程较为复杂,应用,：,观察细胞处理后,mRNA,水平的变化，以印证蛋白质的变化,Nuclei Run-on,原理：,迅速冷冻，使细胞核内正在转录的,mRNA,复合体处于冻结状态,加入,ATP/GTP/CTP/,32,P-UTP,，,重新恢复,mRNA,的转录并使之结束（标记冻结时正在转录的,mRNA,)，,提取,mRNA,以,cDNA,探针及对照,cDNA,标记尼龙膜后检测目标,mRNA,细胞核的提取,处理细胞（培养于10厘米培养皿）,吸去培养液，迅速将细胞放于冰上,用10,ml,冰预冷的,PBS,洗细胞一次,加10,ml,冰预冷的,PBS，,刮下,细胞，移入离心管,500,g,离心5分钟后弃去液体,边混悬边加入4,ml NP40,裂解液,10,mM,Tris,-HCL,PH7.4,10mM,NaCL,3mM MgCL2,0.5%NP-40,置冰上孵育5分钟，同前离心，弃去上清,2.操作过程,以4,ml NP40,裂解液重悬沉淀、洗涤，同前离心并弃去上清,以200,ul,甘油储存液重悬沉淀，保存于液氮中甘油,50,mM,Tris,-HCL,PH8.3,40%,甘油,5,mM,MgCL2,0.1mM EDTA,Run-on,将冻存的细胞核解冻,加入200,ul,2X,反应缓冲液,10,mM Tris,-HCL,PH8,5,mM,MgCL,2,0.3M KCL,5,mM,DTT,1mM ATP,1mM CTP,1mM GTP,加入,32,P-UTP,100uCi,于30反应30分钟，同时震荡,总,RNA,提取：,加入1.4,ml RLT（QIAGEN,公司）,用,Rneasy,Mini Kit,抽取总,RNA,用700,ul,SW1,洗一次,用500,ul,RPE,洗4次,用110,ul RNase,free ddH,2,O,洗脱两次,取3,ul,加入液闪检测液测取,CPM,值,探针,cDNA,标记尼龙膜：,0.5,N,NaOH,处理尼龙膜,510,ug/,样点膜,自然晾干,Crosslink,4)杂交：,取,相等,CPM,量,RNA，,加入2,ml TES/0.6M,NaCL,10mM TES,10mM EDTA,0.2%SDS,在杂交炉中，68反应过夜,用2,XSSC/0.1%SDS,洗膜三次,用0.1,XSSC/0.1%SDS,洗膜三次,曝光于,X,光胶片,GAPDH,H1,H3,Irradiation,+,-,+,-,GAPDH,H2B,H4,0,20,40,60,80,100,p21+/+,p21-/-,%control,H1,H2B,H3,H4,A.,B.,p21,+/+,p21,-/-,DNA damage induces down-regulation of,histone gene transcription,优缺点：,优点：,反映的是,mRNA,转录水平的变化,用于观察细胞处理后最早期蛋白合成的变化,缺点：,不能直接反映蛋白质的变化,大剂量同位素应用,操作过程复杂，实验中同位素极易污染环境,仅用于检测优势表达的蛋白变化,应用,：,检测,mRNA,水平变化是否发生在转录水平，即早期。,