DNA测序技术及其应用pptPPT专业课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1,2,3,4,引言,第三代测序技术,测序技术的应用与展望,第一代测序技术,第二代测序技术,5,1,引言,DNA序列测定的意义,DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。,造福人类的HGP,人类基因组计划（,Human Genome Project,HGP,）于,1990,年正式启动，其主要目标有：识别人类,DNA,中所有基因（超过,10,万个）；测定组成人类,DNA,的,30,亿碱基对的序列,；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于,2003,年完成。,人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了,21,世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。,DNA测序技术的历史与发展,测序技术最早可以追溯到,20,世纪,50,年代。,早在,1945,年,就已经出现了关于早期测序技术的报导，即,Whitfeld,等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1977年,Sanger,等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和,Gilbert,等发明的化学降解法，,标志着第一代测序技术的诞生,。,此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括,Roche,公司的,454,技术,、,Illumina,公司的Solexa技术,和,ABI,公司的,SOLiD,技术,。,DNA测序技术的历史与发展,最近，,Helicos,公司的单分子测序技术、,Pacific Biosciences,公司的单分子实时(,Single Molecule Real Time,SMRT,)测序技术和,Oxford,Nanopore Technologies,公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。,测序技术正在向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。,2.,第一代测序技术,化学降解法,基本原理：利用特异的,选择性试剂,，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的,聚丙烯酰胺凝胶电泳,上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。,技术路线,将双链DNA样品变为,单链,每个单链的同一方向末端都用放射,性同位素,标记,以便显示DNA条带,分别用不同方法处理,获得只差,一个核苷酸的,降解,DNA群体,电泳,读取DNA的核苷酸顺序,化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。,而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自,原DNA分子,而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。,但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。,双脱氧链终止法,又称为Sanger法。,原理：利用DNA聚合酶，以待测,单链DNA,为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的,双脱氧核苷三磷酸,（ddNTP）作为链延伸终止剂。,在测序引物引导下，通过高分辨率的变性,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离，,放射自显影,检测后，,合成链序列,，由此推知待测模板链的序列。,双脱氧链末端终止法测序原理示意图,P,OH,dNTP,ddNTP,P,OH,OH,P,P,P,P,OH,Sanger,法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种,DNA,测序技术，其中最重要的是,荧光自动测序技术,。,荧光自动测序技术,荧光自动测序技术基于,Sanger,原理，用,荧光标记代替同位素标记,，并用,成像系统,自动检测，从而大大提高了,DNA,测序的速度和准确性。,目前，应用最广泛的应用生物系统公司,(applied biosystems,，,ABI)3730,系列自动测序仪即是基于,毛细管电泳,和,荧光标记技术,的,DNA,测序仪,。,3730全自动测序仪,杂交测序技术,该方法不同于化学降解法和Sanger法，是利用DNA杂交原理，将一系列,已知序列的单链寡核苷酸片段,固定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。,杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度,寡核苷酸芯片,能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。,通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000 bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5 美元,每天的数据通量可以达到600000 碱基。,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的,荧光自动测序仪,仍被广泛地应用。,2.,第二代测序技术,尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在,成本高,、,速度慢,等方面的不足，并不是最理想的测序方法。,随着人类基因组计划的完成，后基因组时代，即功能基因组时代已向我们走来。第一代测序方法已经不能满足,深度测序,和,重复测序,等大规模基因组测序的需求，这促使了第二代测序，又称下一代测序(next,generation sequencing)的诞生。,第二代测序技术包括：,454测序技术,、,Solexa测序技术,和,SOLiD测序技术,。,过程概述,基因组DNA,DNA片段（cDNA）,构建ssDNA文库,测序,（,聚合酶合成测序,，,连接酶合成测序,）,由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息,。,限制性内切酶酶切,片段两端加上不同的接头,固定，并进行PCR扩增,2.1,454,测序技术,原理：,在,DNA,聚合酶,、,ATP,硫酸化酶,、,荧光素酶,和,双磷酸酶,的作用下，将每一个,dNTP,的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测,DNA,序列的目的。,原理图：,构建文库,DNA磁珠捕获与PCR扩增,测序,焦磷酸测序,聚合酶,硫化酶,荧光素酶,测序数据输出：,指示器,相机,PTP盒,454测序法的突,出优势是,较长的读长,，目前GS FLX测序系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。,缺点是,无法准确测量同聚物的长度,。,小结,2.2 Solexa,测序技术,Illumina,公司的新一代测序仪,Genome Analyzer,最早由,Solexa,公司研发，利用合成测序,(,Sequencingby Synthesis,),的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。,原理：,将基因组,DNA,的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即,Flow cell,），这些,DNA,片段经过延伸和桥式扩增后，在,Flow cell,上形成了数以亿,Cluster,，每个,Cluster,是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的,SBS,（边合成边测序）技术对待测的模板,DNA,进行测序,。,原理图,构建ssDNA文库,单链DNA与流动槽附着,Bridge PCR,DNA簇线性化,测序,测序过程：,dNTP的3,羟基被化学方法保护,每轮合成反应只能添加一个碱基,测序过程：,GenomeAnalyzer,系统需要的,样品量低,至,100ng,，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到,250bp,，每次运行后可获得超过,20 GB,的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。,小结,2.3 SOLiD,技术,SOLID,通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：,文库准备,扩增,微珠与玻片连接,连接测序,与454测序类似,SOLiD,系统与454测序系统相比，每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。,测序过程,：,连接酶,八聚核苷酸,模板,通用测序引物n,超高通量,是,SOLID,系统最突出的特点，目前,SOLID 3,单次运行可产生,50 GB,的序列数据，相当于,17,倍人类基因组覆盖度。,小结,表1 三种二代测序技术对比,4.,第三代,DNA,测序技术,第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用,但是由于其,测序速度、成本、准确度,等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。单分子测序也就应运而生。,2009,年,12,月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立,“,中科院北京基因组研究所,浪潮基因组科学联合实验室,”,三代测序技术是以,单分子测序,为特点的测序技术,单分子即时,DNA,测,序技术(,SMRT,),HeliScope,单分子测序,基于荧光共振能量转移的即时,DNA,测序,纳米孔单分子测序技术,第三代测序技术,1,、,目前一期的读取速度为,3bp/s,2,、它实现了,DNA,聚合酶内在自身的,processivity,（延续性，也就是,DNA,聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。,3,、它的精度非常高，达到,99.9999%,。,标记荧光基因,DNA聚合酶作用,显微镜下进行荧光探测,零级波导的纳米结构,来实现即时观察和背景荧光干扰,4,.,1,单分子即时,DNA,测序技术,零级波导的纳米结构,小孔的尺寸低于光的波长，小孔底部形成消逝波，创造很小体积的,检测空间,DNA,链周围游离的荧光标记,dNTP,有限，非常快速进出于小孔，稳定的,背景荧光信号,荧光标记,dNTP,被掺入到,DNA,合成链，其携带的特定荧光会持续一小段时间,(,荧光光曝,),DNA聚合酶,4,.,2,HeliScope,单分子测序,优点：,采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到,单个碱基,的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCR扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。,DNA聚合酶,荧光标记的dNTP,产生荧光 CCD记录,发生了碱基延伸反应,平面基板模拟图,4,.3 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序,荧光供体,DNA聚合酶,荧光受体,4种dNTP,荧光共振能量转移,具体过程,优点：,游离的dNTP不发光，只有其掺入到新合成的DNA链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰,此方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少DNA聚合酶的光损伤作用，进一步延长了测序长度。,能量,DNA,分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的,DNA,碱基,优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。,4,.,4,纳米孔单分子测序技术,内部：核酸外切酶和环式糊精,由生物分子组成的纳米孔,优点：,直接测RNA序列。,既然DNA聚合酶能够即时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以应用于第三代测序平台。,直接测甲基化的DNA序列。,SMRT技术也可利用甲基化碱基特有的荧光信号来识别模板DNA中的甲基化修饰，如N6,甲基腺苷、5甲基胞嘧啶或5一羟甲基胞嘧啶,表2 各种测序技术比较,5.,基因测序的应用,未知基因组的测序,全基因组重测序,深度扩增子测序,转录组测序,关联突变的检测,病毒抗药性和传染病源快速检测,疾病相关区域、目标区域测定,环境基因组学和微生物多样性,DNA甲基化模式研究,全基因组小分子RNA（miRNA)分析,染色质免疫沉淀,表观遗传学,考古学,全基因组重测序,全基因组重测序是对已有参考序列（Reference Sequence）的物种的不同个体进行基因组测序，并以此 为基础进行个体或群体水平的差异性分析。通过全基因组重测序，研究者可以找到大量的单核苷酸多态性位点 （SNP）、拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）、插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）、结构变 异（Structure Variation，SV）等变异位点。这在人类疾病及动植物育种研究等方面具有重大的指导意义。,全基因组重测序,完成全基因组测序的部分的物种,全基因组重测序,全基因组重测序,转录组测序,（,Transcriptome sequencing,）,转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。,转录组测序,（,Transcriptome sequencing,）,新型病源体的快速鉴定,艾滋病毒抗药性,HIV sequencing,外显子&目标区域测序,外显子&目标区域测序是指利用特制的探针对客户感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获，富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定外显子&目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中外显子区域的研究效率，显著降低了研究成本。主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区域内的结构变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。,目标外显子组测序vs全基因组测序,目标外显子测序应用,利用NG SeqCap+GS测序检测白血病突变,基因测序的展望,利用光学成像技术设计的新型DNA测序简图,光影成像DNA测序技术,原理：当光照在一个物体上时，物体离光源越近，离成像面越远，则形成的影子越大，当DNA被光照后，可在光敏成像板上留下图像，通过比对可直接测定DNA序列。,组件介绍：1.光源需要条形光源，光源与高通透玻璃板之间要有金属通道，减少光能辐射递减,2.高通透玻璃板上含有固定DNA的芯片,3.光敏成像板为光敏变色材料,光影成像DNA测序技术,所面临的难题：,DNA在固定时要防止断裂，折叠，扭曲，变形,需要找到合适的光源，合适的波长避免发生衍射,光源与DNA的距离以及DNA与光敏成像板的距离有待探究,选取何种光敏材料，选取何种成像技术,数据分析系统需要建立比对系统,