第四章--动物检验检疫技术--WSC.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 动物检验检疫技术,检验检疫样品,细菌分离及鉴定,病毒分离及鉴定,其它病原微生物分离及鉴定,寄生虫检查,现代生物技术的应用,第一节 检验检疫样品,一、病料采集和运送,(,一,),病料采集基本原则,:,（,1,）在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出,初步诊断,。,（,2,）采取病料所用容器、手术器械都应事先消毒，确保无毒，采样时应,无菌操作,。,（,3,）应做好人身防护，严防,人畜共患病感染,。,（,4,）应,防止污染环境,，防止疫病传播，做好环境消毒和病害肉尸的处理。,（,5,）如果动物已死亡，有特殊要求,如果动物已死亡，取样应注意,:,急性死亡动物,如怀疑是,炭疽,，不可随意解剖，应从耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片,染色镜检,万不得已时局部解剖作脾脏触片的显微镜检查。排除,炭疽,后方能剖检取样,采取病料时间,原则是越早越好,内脏病料的采取，如患畜已死亡，应尽快采集，最迟不超过,6h,。夏季要在动物死亡后,2,小时内采取病料；,采取,病料的种类,，根据不同的疾病或检验目的，采其相应的脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。在无法估计病因时，可进行全面的采集。,填写好病料送检单和剖检病理变化记录。,（二）使用器械的消毒,刀、剪、镊子,等用具煮沸消毒,30min,。,器皿,(,玻制等,),经高压灭菌或干烤灭菌；或放于,0.5%,1%,的碳酸氢钠水中煮沸,10min,15min,；,软木塞和橡皮塞,置于,0.5%,石碳酸水溶液中煮沸,10,分钟,载玻片,在,1%,2%,的碳酸氢钠水中煮沸,10min,15min,；水洗后用清洁纱布擦干，保存于酒精、乙醚等溶液中备用,一般使用一次性针头和注射器。采取一种病料，使用一套器械与容器；,5,、采过病料的用具应,先消毒后清洗,。,（三）病料的采取方法,血液,一般组织（包括内脏组织）,体液,皮肤,肠内容物或粪便,胃液及瘤胃内容物,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小家畜、家禽,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,猪前腔静脉采血,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,（,2,）采血方法,对动物采血部位的皮肤先剃毛,(,拔毛,),，,75%,的酒精消毒，待干燥后采血；,采血可用针管、针头、真空管或用三棱针穿刺，将血液滴到开口的试管内。,禽类等的少量血清样品的采集，可用塑料管采集。用针头刺破消毒过的翅静脉，将血液滴到直径为,3mm,4mm,的塑料管内，将一端封口。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,（,3,）血样种类,全血样品,进行血液学分析，细菌、病毒或原虫培养，通常用全血样品，样品中,加抗凝剂,。,抗凝剂可用,0.1%,肝素、阿氏液或,4.0-5.0%,枸橼酸钠液。,采血时应直接将血液滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。也可将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内，震荡脱纤维蛋白。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,血清样品,进行血清学试验。血液中,不加抗凝剂,，血液在室温下静置,2h,4h,，待血液凝固，有血清析出时，用无菌剥离针剥离血凝块，然后置,4,冰箱过夜，待大部分血清析出后取出血清，必要时经低速离心分离出血清。,在不影响检验要求原则下可因需要加入适宜的防腐剂。,做病毒中和试验的血清避免使用化学防腐剂,(,如硼酸、硫柳汞等,),。若需长时间保存，则将血清置,20,以下保存，但要尽量防止或减少反复冻融。,样品容器上贴详细标签。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,血浆的采集,采血试管内先加上抗凝剂，血液采完后，将试管颠倒几次，使血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待细胞下沉后，上层即为血浆。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,2,、一般组织（包括内脏组织）,（,1,）采样方法,用常规解剖器械剥离死亡动物的皮肤，体腔用消毒的器械剥开，所需病料按无菌操作方法从新鲜尸体中采集。剖开腹腔后，注意不要损坏肠道。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,（,2,）采样种类,病原分离样品的采集,用于细菌分离的样品的采集，首先以烧红的刀片烫烙脏器表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂耳伸入孔内，取少量组织或液体，作涂片镜检或划线接种于适宜培养基上,组织病理学检查样品的采集,采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放入,10,倍于组织块的,10%,福尔马林溶液中固定。组织块厚度不超过,0.5cm,，切成,1cm2,2cm2,。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如作冷冻切片用，则将组织块放在,0,4,容器中，尽快送实验室检验。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,3,、液体病料,采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时，用烫烙法消毒采样部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入，吸取内部液体材料，然后将材料注入灭菌的试管中，塞好棉塞送检。也可用接种环经消毒的部位插入，提取病料直接接种在培养基上。,供显微镜检查的脓、血液及粘液抹片的制备方法,:,先将材料置玻片上，再用一灭菌玻棒均匀涂抹或另用一玻片推抹。组织块、致密结节及脓汁等亦可在两张玻片中间，然后沿水平面向两端推移。用组织块作触片时，持小镊将组织块的游离面在玻片上轻轻涂抹即可。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,4,、皮肤,病料直接采自病变部位，如病变皮肤的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。采取病变局部的皮肤,(10cm10cm,左右,),，放入甘油盐水缓冲溶液中，或,10,饱和盐水溶液中，或,10,福尔马林液中。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,5,、肠内容物或粪便,肠道只需选择病变最明显的部分，将其中的内容物弃去，用灭菌生理盐水轻轻冲洗；也可烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取内容物，将肠内容物放入盛有灭菌的,30%,甘油盐水缓冲保存液中送检。或者，将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断送检。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,6,、胃液及瘤胃内容物,（,1,）胃液采集,胃液可用多孔的胃管抽取。将胃管送入胃内，其外露端接在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即可自动流出。,（,2,）瘤胃内容物采集,反刍动物在反刍时，与食团从食道逆入口腔时，立即开口拉住舌头，另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃内容物。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,7,、脑、脊髓,（,1,）全脑、脊髓的采集,采取脑、脊髓做病毒检查，可将脑、脊髓浸入,30%,甘油盐水液中或将整个头部割下，包入浸过消毒液的纱布中，置于不漏水的容器内送往实验室。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,（,2,）脑、脊髓液的采集,采样前的准备：专用穿刺针,采样方法：,颈椎穿刺 、腰椎穿刺,采样数量：,大型动物颈部穿刺一次采集量,35mL,70mL,，腰椎穿刺一次采集量,15mL,30mL,。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,8,、呼吸道,应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分泌物，蘸取分泌物后立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。,常用的保存液有,pH7.2,7.4,的灭菌肉汤或磷酸盐缓冲盐水。一般每支拭子需保存液,5mL,。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,9,、眼睛,眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，放在灭菌的,30%,甘油盐水缓冲保存液中送检。,有时，也采取病变组织碎屑，置载玻片上，供显微镜检查。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,10,、小家畜及家禽,将整个尸体包入不透水塑料薄膜、油纸或油布中，装入木箱内，送往实验室。,小动物,禽和鱼等可整体送检。在距离实验室很近,又有隔离运输条件时,也可将发病小动物直接送检。,血液,一般组织,体液,皮肤,粪便,胃液,脑、脊髓,呼吸道,眼睛,小动物,二、病料的保存,1,、细菌检验材料的保存,将采取的器脏组织块，保存于灭菌液体石蜡、饱和氯化钠溶液或,30,甘油缓冲盐水溶液中，容器加塞封固。液体装在封闭的毛细管或试管运送。,寄送肠道时，先清除肠内粪团，用灭菌盐水清洗后，置于盛有上述保存剂的试管中即可。粪便可移入灭菌容器中寄送。,2,、病毒检验材料的保存,将采取的器脏组织块，保存于,50,甘油缓冲盐水溶液，容器加塞封固。,3,、病理组织学检验材料的保存,将采取的器脏组织块放入,10,福尔马林溶液或,95,酒精中固定，固定液的用量为送检病料的,10,倍以上。,为防病料冻结，可将固定好的组织块取出，保存于甘油和,10,福尔马林等量混合液中,三、病料的记录、包装和运送,1,、送检样品的记录,送往实验室的样品应有一式三份的送检报告，一份随样品送实验室，一份随后寄去，另一份备案,2,、送检样品包装和运送,所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。,24h,内的放在,4,左右的容器中运送。,24h,内不能运送的，把样品冷冻，并以此状态运送,四、病料的处理,1,、性状观察,采集的病料，在接种培养前,应对其性状进行观察，如是否脓性带血或腐败，有何异味,并作记录,2,、涂片,各种病料在分离培养前均应制备涂片,作革兰氏染色,镜检,以了解细菌的形态,染色特性,并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果,对病料中可能含有的病原菌作最初步的估价。,3,、污染病料抑菌培养,如果病料被杂菌污染严重,则需采用一些对病原菌无害,但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法,以抑制杂菌生长。,4,、集菌处理,有些病料含菌太少,则应先作集菌处理,然后接种,以提高检出率,其集菌方法有离心法和过滤法,.,第二节 细菌分离及鉴定,一、细菌的分离与接种,1,、平板划线接种法,通过平板划线后,可使细菌分散生长,形成单个菌落,有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。,A,分区划线法,首先将接种环灭菌后,沾取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分,(,第一区,),将接种环火焰灭菌,待冷却后只通过第一区,3-4,次后连续划线,(,为第二区,),依次可共划线,3-5,区,每一区细菌数可逐渐减少,直到分离出单个菌落为止,.,B,连续划线法,首先将标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分,然后由此开始，在培养基表面自左向右连续划线并逐渐向下移动，直到下边缘。,2,、斜面接种法,采用该法目的是进行纯培养。其方法是从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯种,移种至斜面培养基上,先从斜面底部自下而上划一条直线,再从底部开始向上划曲线接种,尽可能密而匀,或者直接自下而上划曲线接种。,3,、倾注培养法,此法适用于乳汁和尿液等液体标本的细菌计数。其方法是取原标本经适当稀释，置于无菌平皿内,倾入已融化并冷至,50,左右的培养基约立即混匀待凝固后倒置培养。,4,、穿刺接种法,多用于双糖,明胶等具有高层的培养基进行接种,方法是用接种针挑取菌落或培养物,由培养基中央直刺到距管底约,0.3-0.5cm,处,.,然后沿穿刺线退出接种针；,若为双糖等含高层斜面的培养基则光穿刺高层部分,退出接种针后直接曲线接种斜面部分。,5,、液体接种法,多用于普通肉汤,蛋白胨,水等液体培养基的接种,方法是接种环沾取菌种,倾斜液体培养基管,先在液面与管壁交界处研磨接种物,(,以试管直立后液体能淹没接种物为准,),然后再在液体中摆动,2-3,次接种环,塞好棉塞后轻轻混合即可。,二、细菌的培养方法,需氧培养法,二氧化碳培养法,厌氧培养法,形态学特征,生理学特征,生态学特征,生物分类的传统指标,三、细菌的鉴定,1,、微生物分类鉴定的经典方法,纯培养的病原微生物可进行系统鉴定。,系统鉴定就是通过病原菌的形态结构、生长特征、抗原性和病原性等检测，并用已知标准血清确定分离细菌的属、种和型。,微生物鉴定程序通常是根据其形态生长、生化特征等定种，最后根据抗原的免疫血清检查定型,常用的形态学特征有,培养特征,细胞形态,染色特性,特殊的细胞结构,运动性等,（,1,）形态学特征,（,2,）生理生化特征,营养类型,与氧的关系,对温度的适应性,对,pH,的适应性,对渗透压的适应性,代谢产物,细菌毒力,细菌毒力,病原性细菌致病能力的强弱程度称为,毒力,。,测定微生物毒力大小系用递减剂感染易感动物来进行。试验时,须注意实验动物的种别,年龄与体重,试验材料和剂量,感染途径以及其它因素。,通常用来表示微生物毒力大小的单位有：,最小致死量,(M.L.D):,能使特定动物感染后,在一定时限内发生死亡的最少的活,的,微生物量或毒素量,半数致死量,(LD50),：,在一定时限内能使半数动物发生感染死亡所需的活的微生物量或毒素量。,2,、微生物分类鉴定中的现代方法,（,1,）核酸分析鉴定微生物遗传型,特点：直接比较不同微生物之间基因组的差异,DNA,的碱基组成,(G+C mol%),核酸的分子杂交法,主要方法,计算机鉴定微生物基于数值分类法,即通过广泛比较分类单位的性状特征，然后计算它们之间的相似性，再根据相似性的数值划分类群的一种分类方法。,（,2,）应用计算机鉴定微生物学,第三节 病毒分离及鉴定,要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：,从患病者体内分离出病毒；,在实验动物或寄主细胞中可以培养；,证明这种培养物具有滤过性；,在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；,能重新分离出病毒,.,病毒材料采集与检验结果的关系,采取标本的时期,检查病毒及其成分,测定抗体,潜伏期及前驱期,刚发病或急性期,恢复期及康复期,较难查见,最多查见,很难查见,未增多,未增多或增多不明显,明显增多,（常超过,4,倍）,一、检材的采集与处理,发病初期从感染部位采集足量标本，低温运送、保存，尽快送检，分离培养前去除标本中的沉渣、细菌、真菌和毒性物质等，必要时需浓缩、提纯。,二、病毒的分离及鉴定,病毒检验的大致程序：临床标本分离培养初步鉴定最后鉴定,病毒分离培养方法：包括组织培养、鸡胚接种、动物接种,3,、病毒的初步鉴定依据,动物感染范围及潜伏期、对鸡胚的敏感性、细胞形态变化类型、红细胞吸附、病毒干扰现象、血凝性质、理化性质（核酸类型测定、大小形态、乙醚敏感试验、耐酸试验）,4,、病毒的最后鉴定依据,主要是血清学方法（中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验）和分子生物学方法。,一、标本的处理,（一）除菌处理,粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4过夜。,鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4作用4小时。,对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4过夜除菌。,（二）研磨和稀释,对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液（,pH7.6,肉汤或10脱脂牛乳生理盐水或0.5水解乳蛋白,Hanks,液）制成组织悬液，然后经2000转分离心20分钟。必要时可加抗生素处理（同上）。,病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（,动物接种,）、鸡胚（,鸡胚接种,）或离体细胞进行分离培养（,细胞培养,）。,二、病毒的分离培养,(,一）动物接种法,接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。,按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径,。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。,动物接种的优缺点：,优点：,（1）,不需要复杂的仪器设备；,（2）技术简单；,（3）易成功,缺点：,（,1）个体差异大,（2）价格昂贵,（3）数量有限,（4）需要隔离畜舍,（二）鸡胚接种,1.,鸡卵的选择,一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。,2.,孵育,孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38-39，相对湿度为4070，孵育8日后，鸡卵应每天翻动12次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。,3.,检卵,鸡卵孵育45天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。,（,1,）未受精鸡卵：,在检卵器上仅见到模糊的阴影。,（,2,）活鸡卵：,鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。,（3）死胎,：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。,鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。,鸡胚,羊膜腔,接种：用,12,14,天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查（图,7-8,）。常用于流感病毒的初次分离。,鸡胚卵黄囊接种,：用,5,8,天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查（图,7-7,）。常用于某些嗜神经病毒的分离。,4.,接种,绒毛尿囊膜,接种：用,10,l 2,天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开,小窗，然后将材料滴在绒毛尿囊膜上孵育后。观察膜上有无斑点病变,(,图,7-10),。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。,尿囊腔,接种 用,9,12,天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查,(,图,7-9),常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。,5.,剖检及收获,收获前鸡胚应置4冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。,鸡胚接种的优缺点：,优点,：,技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大,、,不需特殊设备。,缺点：,很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。,(,三）细胞培养,根据细胞的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种。,细胞培养(,cell culture),是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。,原代细胞培养,即从机体内取出细胞置试管或瓶内生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病毒疫苗,.,这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和传代,故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和地鼠肾原代细胞。,传代细胞,它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的,染色体数为非整倍体,细胞随时可以获得,生长迅速,可无限传代,.,细胞培养的方法,静置培养：,实验室常用。细胞悬液装瓶，5%,CO,2,温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。,旋转培养：,大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。,组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。,病毒的获得,优点：,每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；,无个体差异，准确性和重复性好；,可严格执行无菌操作；,细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；,应用空斑技术可进行病毒的克隆化。,三、病毒鉴定,1.,形态学鉴定,细胞病变效应（,cytopathic effect,，,CPE,）,病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落，这些改变称为细胞病变效应（,cytopathic effect,，,CPE,）,。,CPE,出现的时间也是鉴定病毒的标志之一。,细胞病变,正常细胞,细胞折光性，变圆，局部全层，死亡脱落，如：肠道病毒,细胞聚集成丛，似葡萄串状，细胞间常有细丝状间桥连接，细胞变圆或膨大，如：腺病毒。,细胞融合现象,病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。,细胞融合现象,包涵体,定义：,是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。,包涵体的性质,病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的,Negri,氏体；,大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体；,细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体。,胞浆内有空泡形成，如：猴病毒,SV40,、呼肠孤病毒等,。,感染细胞具有吸附红细胞的能力,感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用,2.,血吸附和血凝作用,多见于以出芽方式释放的病毒。,红细胞吸附,正常细胞,（,1,）血吸附作用,吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒。,（,2,）血凝作用,血凝试验,血凝抑制试验,有血凝素（,HA,）的病毒能凝集,人,或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应,抗体,与,病毒,结合后，阻止病毒表面,HA,与,红细胞,结合,.,四、电子显微镜检查,病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。,透射电子显微镜,1.,正染法：超薄切片法,取材,固定,戊二醛,四氧化锇,清洗与脱水,浸透,包埋,聚合,切片,染色,铀染,铅染,鸡痘病毒（超薄切片）,超薄切片法的优缺点：,优点：可观察病毒形态和形态发生过程,缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存,2.,负染技术,负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。,铜网,样品,滤纸,1-2,分钟后电镜观察,染液,（常用磷钨酸）,口蹄疫病毒的电镜负染,负染法的优缺点：,优点：,快速简易（,10-20min,）；分辨率高；图象清晰地病毒结构,缺点：,敏感性低，要求病毒量在,10,7,以上；所有样品应处于悬浮状态,免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。,3.,免疫电镜技术,(,Immune electron microscopy,，,IEM,),（,1,）免疫凝集电镜技术,抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。,（,2,）免疫电镜定位技术,特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。,酶标记染色,五、血清学试验,是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用,ELISA,、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。,virus,1.,中和反应,观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。,2.,补体结合反应,Ag,Ab,红细胞,溶血素,补体,Ab,Ag,红细胞,补体,溶血素,溶血 （,-,）,不溶血 （,+,）,3.,免疫扩散,4.,酶联免疫吸附试验,（,ELISA,）,将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。,（,1,）间接,ELISA,（,2,）夹心,ELISA,3,3,5,5,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,模板,DNA,双链,形成新的双链,DNA,退火,变性,六、分子生物学技术,聚合酶链反应,（,PCR,）,2.,核酸杂交技术,核酸探针（,probe,）是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，可检测待检样品中特定的基因顺序。,分离病毒的病原学意义,从,组织、脑脊液、血液、眼部、水泡液,分离到任何病毒均可认为具有高度病原学意义。尿液中检出病毒也具有病原学诊断意义,从,呼吸道、阴道、肠道,标本分离病毒，需要考虑这些病毒是否有无症状携带者和长期排毒者。,第四节 其它病原微生物分离及鉴定,立克次氏体,2,衣原体,4,螺旋体,3,1,支原体,3,3,一、螺旋体,1,、形态结构及染色特征,螺旋体是一类菌体细长、柔软、弯曲呈螺旋状、能活泼运动的原核单细胞微生物、它的基本结构于细菌类似。,革兰氏染色阴性，但大多不易着色。在普通显微镜下难以看到，常用镀银染色法染色。,2,、生物学特性,螺旋体多为需氧菌，对热、酸、干燥和一般消毒剂均敏感。,钩端螺旋体是唯一可用人工培养基培养的螺旋体。,电镜下的钩端螺旋体,3,、致病性,主要传播途径是,接触传播,。钩端螺旋体具有较强的侵袭力，能通过皮肤微小伤口、眼结膜、鼻或口腔粘膜而侵入人体。,其次，也可以通过,消化道传播,，如进食了排泄物污染的食物，螺旋体就从消化道粘膜侵入体内。,首先发生钩端螺旋体败血症，出现高烧头痛，随着钩端螺旋体侵入肝、肾、肺、脑等引起多种脏器的损害。临诊表现形式多样，主要有发热、黄疸、血红蛋白尿、流产、皮肤和粘膜坏死、水肿等。,4,、微生物诊断,（,1,）病料的采集与检查,发病早期,以采取病畜的血液为宜，,发病后期,肾脏中的病原体大量增加，宜采取尿液。,死后,采样肝、肾、肾上腺等实质器官，研磨后取上清制片镜检。,暗视野显微镜检查,以上材料制成压滴标本片，用暗视野显微镜检查。螺旋体在暗视野显微镜下似一串发亮的小珍珠，运动活泼,标本染色镜检,用姬姆萨染色或方氏镀银法和钩端螺旋体媒染法。,（,2,）分离培养,常用柯氏培养基和捷氏培养基培养。接种量要大，血液直接接种，尿液过滤后接种。,（,3,）动物感染实验,（,4,）血清学检验,动物感染钩端螺旋体发病早期，其血清中即有特,异性抗体出现，此抗体长期存在。诊断用已知抗原,检查动物血清中的抗体。,最常用的方法是凝集溶解实验，暗视野检查。,二、立克次氏体,1,、形态结构,立克次氏体形态为细胞多形，可呈球形、球杆形、杆形，甚至哑铃形或丝状等，但主要是球杆状。单个或成对排列，有时呈短链状。革兰氏染色阴性，但不易着色,2,、生物学特性,专性细胞内寄生,大小介于细菌和病毒之间,革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈紫或蓝色,对理化因素抵抗力不强，尤对热敏感，一般在,56,，,30min,即被灭活。对一些广谱抗生素敏感，但磺胺药不敏感且反有促进立克次体生长作用，不能用于治疗。,立克次氏体,3,、致病性,致人畜疾病的立克次氏体，多寄生于网状内皮系统、血管内度细胞或红细胞，并常天然寄生在虱、蚤、蜱、螨等节肢动物体内，通过叮咬、抓伤或吸入，从一个宿主传播到另一个宿主动物或人体。,4,、微生物诊断,病料采集,：立克次氏体分离培养的病料，应采自未用抗生素的急性期或发热期患病动物，已死亡的动物应尽早采集。病料,-70,保存。根据需要可采取急性期或发热期患病动物的血液；病死动物的脾、肝、肾、脑、脊髓及胎盘、乳汁等。,病原检查分离,将所采病料制成血片或组织抹片，经适当方法染色后镜检。或将病料处理后接种于鸡胚卵黄囊内或适宜的易感动物或接种细胞，培养出立克次体。,抗体检查,可用已知抗原作凝集试验、补体结合试验或中和试验，以证实患病动物血清中的相应抗体，从而诊断该病。中和试验可用豚鼠或鸡胚进行。,由于某些变形杆菌菌株可与某些立克次体多糖抗原的抗体发生交叉反应，故在医学上，常用这些变形杆菌菌株制成凝集抗原，用凝集试验检查某些立克次体病。这种凝集试验称为,魏,-,裴二氏反应,三、支原体,1,、形态结构及染色特性,支原体是目前发现的最小的最简单的，也是唯一一种没有细胞壁的原核细胞，细胞柔软具有高度的多形性。,常呈球形、杆状和丝状，偶见有梨状、分枝状、环状、螺旋状等不规则的形状。,支原体的大小为,0.2,0.3um,可通过滤菌器革兰氏染色呈阴性，通常着色效果不好，故常用,姬姆,萨染色,染色法将其染成淡紫色,2,、生物学特性,支原体基因组为一环状以双链,DNA,，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一）,支原体的生物合成能力较弱，虽然能够在人工培养基上生长，但营养要求比一般细菌高，常常需要在培养基中加入胆固醇、血清、腹水、牛肉浸膏和酵母浸汁等特殊成分。,对环境渗透压敏感,3,、致病性与免疫性,除了少数的支原体为腐生或共生菌，大多数为寄生菌。,病原性支原体常常定居于多种动物的呼吸道、泌尿生殖道、消化道黏膜表面、乳腺以及眼等部位，并且对胸腺、腹膜、关节滑液囊膜的间质细胞以及中枢神经系统的亲和力较强。,4,、微生物学诊断,直接镜检意义十分有限，应该取病料进行分离培养和形态学检验，做生理生化以及血清学试验方能进行鉴定。,（,1,）病料采集和保存,由于支原体侵害动物的黏膜表面，一般可用灭菌棉花拭子涂抹取样。,也可根据病变部位，取其肺、胸水、乳汁、鼻咽分泌物、关节液、淋巴结等，病料可经滤器除菌后再接种。,（,2,）培养方法,培养基中培养,鸡胚接种培养,动物接种培养,（,3,）菌落形态和染色观察,支原体在适宜的固体培养基上能长出具有“油煎蛋状”或“桑葚状”菌落,肺炎支原体菌落,电子显微镜镜下肺炎支原体呈现多型性,四、衣原体,1,、形态结构,革兰氏阴性，圆形或椭圆形体；,姬姆萨染色，胞浆内有球形和椭圆形的衣原体,2,、生物学特性,介于立克次氏体与病毒之间,，能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生，生物学特性更接近细菌而不同于病毒。具有细胞壁，其组成与革兰氏阴性菌相似，在显微镜下能观察到；,有独特的发育周期,，行二分裂方式繁殖。,专性寄生,，不能在人工培养基中生长；,对多种抗生素敏感,，衣原体对热和常用消毒剂敏感,3,、致病性,衣原体通过创面侵入机体后，原体吸附于易感的柱状或杯状粘膜上皮细胞并在其中繁殖，也能进入单核吞噬细胞繁殖。,在宿主细胞内存在原体和始体两种形态。具有感染性的原体通过胞饮作用进入宿主细胞，逐渐增大成为始体。始体无感染性，但能在空泡中以二分裂方式反复繁殖，形成大量新的原体，积聚于细胞质内成为各种形状的包涵体，宿主细胞破裂，释放出的衣原体则感染新的细胞。,4,、微生物诊断,衣原体鉴定要点,在细菌培养基上不能生长，衣原体培养方法有鸡胚卵黄囊接种、小鼠腹腔、鼻内接种和多种细胞培养。,严格胞内寄生，在感染细胞的细胞质内可见衣原体原体和始体，感染细胞破裂后释放于胞外,寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查等三个方面。,一、病原学诊断,根据寄生虫生活史的特点，从病体的血液、组织液、排泄物、分泌物或活体组织中检查寄生虫的某一发育虫期，这是最可靠的诊断方法,病原学诊断方法检出率较低，对于在组织中或器官内寄生而不易取得材料的寄生虫其检出效果不理想。,第五节 寄生虫检查,粪便检查,寄生虫,病原学,检查,1,2,3,4,血液检查,排泄物与分泌物等的检查,其他器官组织检查,在动物检疫中，常用的方法有以下几种：,1,、虫卵检查法,相对密度较小的虫卵，常用虫卵漂浮法，以相应密度的漂浮液进行离心，即可收集漂浮在上的虫卵；密度较大的虫卵，多用水洗沉淀法，在沉渣中收集虫卵。多用于肠道寄生虫和球虫的检查。,2,、虫体检查法,采用剖检或采集相应的标本（粪便、血液、阴道分泌物、尿液、痰液、组织活检或骨髓穿刺等），直接检出虫体。,二、免疫学诊断,寄生虫侵入机体，刺激机体引起免疫反应，利用免疫反应的原理在体外进行抗原或抗体的检测，达到诊断的目的。,三、生物学检查,包括核酸探针技术和,PCR,技术。但这两种技术在寄生虫检测中多限于同一虫种的鉴别。,第六节 现代生物技术在动物检验检疫中的应用,在动物疫病诊断中和检疫中，现代生物技术的应用主要体现在两个方面：一是基于抗原,-,抗体反应的免疫血清学技术；二是基于病原核酸检测的分子生物学技术。,免疫血清学技术主要包括中和试验、凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、免疫酶标记技术等,分子生物学技术主要包括聚合酶链式反应,PCR,、核酸杂交、寡核苷酸指纹图谱、限制性片段长度多态性等。,一、免疫血清学技术的应用,1,、凝集反应,凝集反应是指,颗粒性抗原,例如细菌、红细胞等与相应的抗体在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集物。,凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。既可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。,凝,集,反,应,直接凝集反应,：是指颗粒性抗原与抗体直接结合而出现的凝集现象,间接凝集反应,：指可溶性抗原或抗体吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒,(,即载体颗粒,),表面，然后与相应抗体或抗原作用而出现的特异性凝集反应。,2,、沉淀反应,是指,可溶性抗原,与相应抗体结合，在有适量电介质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物,沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。,同相应抗体比较，抗原分子小，单位体积内含有的抗原量多，做定量试验时，为了不使抗原过剩，应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价,沉淀反应的实验方法大体可分为,环状法,、,絮状法、琼脂扩散法,三种基本类型。,（,1,）环状沉淀试验,将免疫血清加到直径小于,0.5cm,的反应管底部；将含有可溶性抗原的材料重叠于上；,抗原与抗体在两液界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀,（,2,）絮状沉淀试验,将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在时，抗原与抗体结合形成絮状沉淀物。,这种沉淀试验受到抗原与抗体比例的直接影响，通常采用固定抗体稀释抗原的方法，二者比例适合时，产生反应最快；一种过剩则沉淀减少，甚至无沉淀。,（,3,）琼脂扩散试验,可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。,琼脂凝胶形成网络状结构，抗原和抗体在凝胶内可自由扩散；,Ag-Ab,复合物为超大分子，由于网孔的限度，而被网在琼脂中；,单向琼脂扩散试验,将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后在琼脂上打孔,再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。,双向琼脂扩散试验,是将半固体琼脂倾注于平皿内或玻片上，待其凝固后，在琼脂板上打孔。,将抗原、抗体分别注入小孔内，使两者相互扩散。,如果抗原、抗体相互对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰可见的沉淀线,。,3,、酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,酶联免疫吸附试验是应用酶标记的抗体（或抗原）在固相支持物表面检测未知抗原（或抗体）的方法。,ELISA,的特点是特异性高灵敏度强,（,1,）,ELISA,的基本原理,有三条,抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；,抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。,酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,（,2,）常用的,ELISA,方法,有以下两个方面：测定抗原和测定抗体,四种常用方法方法：,直接法,测定抗原；,双抗体夹心法,测定抗原；竞争法测定抗原；,间接法,测定抗体；,直接法测定抗原,将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原,抗体复合物；加底物。,底物的降解量抗原量。,双抗体夹心法测定抗原,将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原,-,抗体复合物；加酶标抗体；加底物。,底物的降解量抗原量。,竞争法测定抗原,将抗体吸附在固相载体表面；加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；加底物。,对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,间接法测定抗体,将抗原吸附于固相载体表面；加抗体,形成抗原,-,抗体复合物,;,加酶标抗体；加底物。,测定底物的降解量抗体量,病原菌检测,毒素检测