医学紫外可见专题知识宣讲.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,紫外可见专题知识宣讲,光谱区域,电磁波谱,（,electromagnetric,spectrum,）,:,电磁辐射按波长顺序排列,光谱区域,:,如无线电波、微波、紫外,-,可见等,这些区的划分虽不特别严格，但特别重要,因为不同区域的电磁辐射，由于其能量高低不同，与物质发生相互作用时，物质获得的能量不同，其内部就会产生不同类型的能级跃迁，据此可提供物质不同种类的信息,各种光学分析方法的基础,电磁波的区分,2.2 Principles of molecular absorption spectroscopy,分子吸收现象,CuSO,4,溶液为蓝色，,KMnO,4,呈紫红色,物质的分子对白色光中某种颜色的光具有选择性的吸收,其颜色为透过光的颜色,互补色光,：,两种颜色的光按适当的强度比例混合后组成白光，则这两种光称为互补色光,紫,400,红,660,橙,600,黄,560,绿,530,蓝绿,500,绿蓝,450,蓝,420,光的互补,CuSO,4,溶液吸收黄色光,其溶液呈现,蓝色；,而,KMnO,4,分子强烈地吸收绿色光，溶液呈,紫红色,紫,400,红,660,橙,600,黄,560,绿,530,蓝绿,500,绿蓝,450,蓝,420,光的互补,问题：,Na,2,SO,4,溶液无色透明,其分子吸光情况?,CuS,(固态)呈黑色，其分子吸光又如何？,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,光谱示意,光的作用方式,表观现象示意,复合光,部分吸收,摩尔吸光系数，与物质的性质、入射光波长，温度有关,e,是一个重要的参数，常被用作为定量分析方法的灵敏度,在环境、材料及生命等学科中要求对含量极低的痕量组分进行定量分析，,如何寻找到一个摩尔吸光系数,e,大的方法或体系是光度法的一个重要任务,光的吸收定律,朗伯,-,比尔定律,A,=lg,I,0,/,I,=,e,b c,c,is the concentration of the compound in solution,mol L,-1,b,is the path length of the sample,cm,e,is the molar,absorbtivity,cm,-1,mol,-1,L,比尔定律的推广,吸光光度法定量测定的依据,吸光物质:分子或原子,状 态:,溶液，均匀的气体和固体状态的吸光物质,Why do molecules absorb light?,任何物质的分子每时每刻都处于运动状态，分子内部的运动有三种形式：,电子绕分子轨道高速旋转,原子在平衡位置附近的振动,分子绕着其重心的转动,因此，,分子的能量,由,分子的电子能量、,分子的振动能量,及分子的转动能量,所组成,E,分子,=,E,电子,+,E,振动,+,E,转动,分子内部各种能级的能量改变都是量子化的,各能级差的大小与分子的内部结构有关,分子中价电子能级间的能级差一般在,120 eV,，这恰好是,可见光和紫外光的能量,分子中原子的振动能级差为,0.05l eV,，相当于,红外光的能量,转动能级差更小，一般在,10,-4,0.05 eV,，相当于,远红外光及微波的能量,When an atom or a molecule absorbs energy,electrons are promoted from their ground state to an excited state:,M（ground state）+,hv,M*（excited state）,测出的,入射光谱,和被吸收后的,透过光谱,，其,差谱,为该分子吸收光的光谱，即分子吸收光谱,紫外-可见吸收光谱:,分子吸收光谱,(Molecular absorption spectroscopy),or,电子光谱,(electronic absorption spectroscopy),，,它是由于,分子中的价电子的跃迁而产生的,选择性定律,:,hv,=,D,E,=,E,1,E,0,hv,=,D,E,电子,+,D,E,振动,+,D,E,转动,只有当入射光子的能量与吸光物质的基态和激发态的能量差相差时，它们才发生,共振,，,光子才能被吸收,通过大量的实验发现，,物质对光的吸收是有选择性的,Different molecules absorb radiation of different wavelengths,物质对光的选择性吸收的规律对化学家来说非常有用:,能,通过测定吸收光谱，推测物质的内部结构信息，从而进行结构分析,因为不同物质由于结构上的差异导致其能级差不同，那么所需的跃迁能量也不同，对光的吸收不同，出现的吸收光谱的形状就不同,-胡罗卜素,咖啡因,阿斯匹林,丙酮,几种有机化合物的,分子吸收光谱图,Question 1,：,UV-Vis absorption spectroscopy is a continuous absorption band.Why?,问题,2,：如果用能量较低的红外光来照射被测物质，,吸收光谱会是什么样的情况？,IR的能量较小,，不足以引起电子的跃迁，但可以引起,基,态,振动能级的跃迁,同时转动能级的跃迁也会发生，所以红外光谱不会象分子吸收光谱那种连成一片，但非常丰富，能观察到一系列窄而紧靠的吸收峰,红外吸收光谱会有许多分子结构方面的信息，,比紫外,可见光谱要多得多,它与分子吸收光谱一样，可作为分子结构分析的工具。,紫外,-,可见吸收光谱的产生,由于物质对可见,-,紫外光的吸收一般都涉及到价电子的激发，因此如果将,吸收峰的波长,与所研究,物质,中存在的,键型,建立起相应的对应关系，找到规律，就可利用,吸收光谱来达到鉴定分子中官能团,的目的（,定性分析,），也可用它来,定量测定含有吸收官能团的化合物,（定量分析）,一.有机化合物的电子光谱,.跃迁类型,C,C,C,C,*,P,x,P,y,P,z,P,x,P,y,P,z,C,C,C,C,*,*,*,n,2.,化合物的电子光谱,C.,n,*,：,发生在远、近紫外线区之间 150nm250nm,CX键，X:S、N、O、Cl、Br、I 等杂原子,甲烷：,max,=125 nm 乙烷：,max,=135 nm,该类化合物的紫外-可见吸收光谱应用价值很小。,CH,2,=CH,2,：,max,=165 nm;CHCH：,max,=173 nm,随着共扼体系的增大或杂原子的取代，,max,向长波移动;,max,10,4,，强吸收带。,CH,3,OH：,max,=183 nm 、CH,3,NH：,max,=213 nm,但是大多数吸收峰,max,小于200nm。,D.,n,*,：,发生在近紫外线区与可见光区之间，是生色团中的,未成键孤对电子向,*,轨道跃迁。,属于禁阻跃迁，,max,100,，是弱吸收带。,A.,*,：,一般发生在远紫外线区，饱和烃类C-C键,B.,*,：,发生在近紫外线区 200nm,E.电荷迁移跃迁,：,电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁，发生在近紫外线区与可见光区之间。,hv,C,R,O,+,_,吸收谱带较宽、吸收强度大、,max,10,4,，是强吸收带。,电子接受体,电子接受体,电子给予体,电子给予体,N,C,H,3,C,H,3,+,hv,它们本身不能吸收波长大于,200nm,的光，但当它们与生色团相连时，会使其吸收带的最大吸收波长,l,max,发生移动，并能增加其吸收强度,红移和紫移,(,red shift and blue shift,),在有机化合物中，常因取代基的变更或溶剂的改变，使其最长吸收波长发生移动，若向长波方向移动称为红移，,反之则为紫移,常用术语,生色团,(,chromophore,),指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。,助色团,(,auxochrome,),指带有非键电子对的基团，如：,-OH,-NR,3,-SH,-Cl,-Br,-I,常用术语,增色效应,(,hyperchromic,effect),由于化合物结构改变，使其,e,增加的效应,如高效染料的合成,(,光电转换材料,),减色效应,(,hypochromic,effect,),二.无机化合物的电子光谱,1.电荷迁移跃迁,：,与有机物类似，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁，发生在近紫外线区与可见光区之间。,hv,hv,电子接受体,电子给予体,M,n+_,L,b-,M,(n-1)+_,L,(b-1)-,Cl,-,_,(H,2,O),n,Cl,_,(H,2,O),n,-,hv,Fe,3+,_,OH,-,hv,Fe,3+,_,CNS,-,2+,Fe,2+,_,OH,Fe,2+,_,CNS,2+,max,10,4,，是强吸收带,2.配位体场跃迁,A.,f,f,跃迁,镧系-4,f,锕系-5,f,由于,f,轨道被具有高量子数的外层轨道所屏蔽，受外界影响较小，并且不易受外层电子有关的键合性质的影响。,max,100，是弱吸收带,因此，呈现窄带吸收,B.,d,d,跃迁,2.3,紫外-可见分光光度仪,部件及性能,光 源,(light source),：,对光源的要求,：,强度大、分布均匀，稳定性好,在紫外光区，,氘灯,波长范围为,180,375nm,在可见光区，,钨灯或碘钨灯,波长范围为,320,2500nm,氙灯,:,200-800 nm,氙灯,氢灯,钨灯,两个理由,定量方面 比尔定律只有当入射光为单色光时才成立,定性方面 一个物质若含有生色基团，它就会产生紫外和可见吸收，反过来根据紫外-可见吸收光谱便可判断某些官能团的存在，即进行官能团的鉴别，但整张紫外-可见吸收光谱的获得是建立在测定出物质对不同波长光（单色光）吸收的基础上的,单色器,(,monochromator,),：,将光源发生的连续光谱分解为单色光,为什么要将连续光谱分解成单色光以后，再进行样品的分析测定？,色散元件(,单色器),:,棱镜和光栅,棱 镜,可用来色散紫外、可见和红外光,应根据应用范围来选材:,玻璃吸收紫外光，故玻璃棱镜仅用于,3503200,nm,石英棱镜可用于,1854000nm,形状有两大类,光栅,它是利用光的衍射与干涉作用制成的一种色散元件,棱镜的分辩能力,R,：,R,=,b,d,n,/d,l,提高棱镜的分辩能力:,采用大棱镜，仪器的设计造成不便,光栅的分辩能力与其刻痕条数有关,故,现代光学仪器一般采用光栅作为色散元件,光栅分光的优点：,适用波长范围宽，色散均匀，分辩率高，仪器可小型化,制作方法：在真空中将金属铝蒸发镀在玻璃平面上，再用金刚石在铝层上压出许多等间隔、等宽度的平行刻纹而成。,制作相当麻烦，价格很高,复制光栅:将可塑性材料浇铸在原始光栅上，将其剥离后再固定在刚性支架上即成。,吸收池,(,比色皿,),作用：用来盛放样品,要求：透明性,操作要求：,位置、清洁、,免受玷污和磨损,可见光区：玻璃吸收池，价廉,紫外光区：石英吸收池,检测系统,作用：将光信号转变为易于测量的电流信号,种类,：,原则,对光响应要快、灵敏,响应的波长范围宽,线性响应,不易疲劳,读数指示器,作用：信号的放大和读出,方式：记录仪、数字显示器,几种常用的分光光度计,一.定性分析,1.依 据,2.方 法,吸收光谱的形状,吸收峰的数目,max,(,),max,A.用经验规则计算,max,与测定的,max,比较,波谱学课程中学习,缺 陷：,只能定性分析化合物所具有的生色团与助色团；,光谱信息在紫外-可见光谱范围重叠现象严重。,一.定性分析,2.4 紫外-可见分光光度法的应用,定性分析、结构分析、定量分析,物理化学参数的测定：,分子量、配合物的配合比与稳定参数、酸碱离解常数、化学反应动力学常数等.,Sadtler,.,Sdandard,Spectra(Ultraviolet).,Heyden,London,1978.,共收集了,46000,种化合物的紫外吸收光谱,R.A.,Friedel,and M.,Orchin,Ultraviolet Spectra of Aromatic Compounds,Wiley,New York,1951.,共收集了,579,种芳香化合物的紫外吸收光谱,Kenzo,.Hirayama,Handbook of Ultraviolet and Visible Absorption Spectra of Organic Compounds,New York,Plenum,1967.,M.J.,Kamlet,Organic Electronic Spectra Data,Vol.1,19461952,Interscience,1960.,B.比较吸收光谱:,与标准物质吸收光谱的比较,标准吸收光谱谱图数据库：,比较未知物与标准物质在,相同化学环境与测量条件下,的紫外-可见吸收光谱，若,吸收光谱的形状、吸收峰的数目、,max,(,),、,max,完全相同，就可以确定未知物与标准物质,具有相同的生色团与助色团，,但并不能断定两者为同一化合物。,二、结构分析,可确定某些化合物的构型与构象,波谱分析课要详讲!,三、,定量分析,定量分析基础,如何进行,误差来源,减少误差的方法,紫外可见分光光度法是,测定低含量和痕量组分的一种常见方法,。,可用于一种组分的测定，也可用于多组分的同时测定,分析依据,比尔定律,比尔定律,A,=,e,b c,标准工作曲线法：,配标液：,c,1,、,c,2,、,c,3,c,n,，,在,选定的最大吸收波长和最佳操作条件下，测,吸光度,A,1,、,A,2,、,A,3,、,A,n,作,A,c,图,得一直线,再在完全相同的条件下，测试样液的,A,，,再从标准曲线上查到相应的浓度,如：抗菌素cefazolin药片中西发单灵含量的测定,西发单灵对照品（标样）,多组分同时测定,:,吸光度加合性,若各种吸光物质之间没有相互作用，且服从比尔定律，那么体系在某个波长下,总的吸光度应等于各组分吸光度之和,，即,A,=,A,1,+,A,2,+,A,n,=,e,1,bc,1,+,e,2,bc,2,+,e,n,bc,n,例：两组分体系X、Y，其吸收光谱曲线为双向重叠。要求其浓度,c,X,、,c,Y,=？,解：分别测定,l,1,、,l,2,的吸光度，,再据吸光度具有加和性，可得,可推广得更多组分,（,n,个组分要选择,n,个波长）,如何测定吸光度,A,A,=-,lg,T,=lg,I,0,lg,I,要准确测出入射光强和透射光强非常困难,:,被分析物质的溶液是放在吸收池中进行测量的，光在空气,/,吸收池壁以吸收池壁,/,溶液的界面会发生反射，导致入射光和透射光的损失,.,另外，尚存在大分子的散射和比色皿自身的吸收,如,黄光通过透明比色皿因反射约损失,8.5%,在实际测量中，,采用同一比色皿,或,等同的比色皿中放入纯溶剂,与被分析溶液的透射强度进行比较，即：,A,=lg(,I,溶剂,/,I,溶液,）,lg,I,0,/,I,单光束分光光度计,双光束分光光度计：,参比光路（R）纯溶剂,测定光路被测溶液,A,=,A,溶液,-,A,参比,误差来源,偏离比尔定律、仪器本身的测量误差,偏离比耳定律的原因,比尔定律本身的局限性,非单色入射光引起的偏离,比尔定律仅在,入射光为单色光时才成立,事实上,单色器,很难将光源的连续光色散成其正的单色光，而是具有较窄波长范围的,复合光,，,光通量为,0.01,5nm,补充作业：,试从多色入射光对比尔定律有影响的角度出发，说明为什么进行定量分析时，常采用最大吸收波长作为测定波长？,溶液的化学偏离,由于被测物质在溶液中发生缔合、离解、互变异构，生成逐级配合物等化学原因造成对比尔定律的偏离,例：,未加缓冲剂的,K,2,Cr,2,O,7,溶液存在下列平衡：,在测定时，在绝大多数波长处，K,2,Cr,2,O,2-,7,的值与CrO,4,的值很不相同，而溶液的总吸光度与其表现浓度不成正比，即：,（橙色）,（黄色）,A,e,b c,Cr,而应为,控制溶液的pH:在碱性溶液中，铬全部以CrO,-,4,形式存在，这时,A,=,e,b c,；,反之，在酸性溶液中，全部以Cr,2,O,2-,7,形式存在,问题：,如何消除这种干扰呢？,仪器测量误差及测量条件的选择,任何一台光度计都有一定的仪器测量误差，这些误差可能来源于：,入射光源不稳定 吸收池 检测器,这些误差的总和表现为透光度读数误差,T,，,从而导致,C,将,D,c,/,c,T,作图,当,A,=0.434时，,D,c,/,c,有最小值,问题：,如何减少因读数而造成的测量误差呢？,稀释,改变比色皿的,b,仪器制造商,T,选择合适的参比溶液,参比：比待测样品溶液浓度稍低的溶液，调节其透光率为,100%,，然后再测样品溶液的吸光度,差示分光光度法,的定量依据,高浓度组分的分析,-,差示吸光度,差示分光光度法：,测定各种试样中的,高含量,金属元素和有机物质,如,Hiskey,等用该法测定溶解在苯中的蒽,用,0.03 mg/,mL,蒽标液作参比,359nm,处长蒽的线性范围：,0.03,0.4 mg/,mL,3.4 显色反应与显色条件的选择,一些生物大分子和含有共轭电子的有机化合物，在紫外-可见光区有强烈的吸收，故可用紫外可见分光光度法来直接测定,象,Na,+,、K,+,、Ca,2+,、Mg,2,+,等许多无机阳离子对紫外可见光不吸收,Fe,2+,、Co,2+,、Ni,2+,等金属阳离子虽吸光，但摩尔吸光系数非常小,如何利用紫外-可见吸光光度法来测定这些无机阳离子的含量呢？,显色反应,M,(无色),+,R,(有色),MR,显色剂 （配合剂）,显色反应的要求,较高的灵敏度，保证低含量时仍能被测出,，,显色反应灵敏度,合成新的显色剂，寻找,高的显色反应,选择性强,R,不与其他共存离子发生反应,有色结合物的组成恒定、稳定,R,与,MR,色差明显,显色条件易于控制,显色条件的选择,显色剂的用量,对于形成逐级配合物的反应，R的用量必须严格控制,如：用SCN,-,作显色剂测定Mo时，要求生成较大的配位数为5的 Mo(SCN),5,，但SCN,-,过量时，,（红色）,（浅红色）,吸光度 A,减小,pH,值,酸度对显色反应的影响是多方的,R,的存在形态、颜色,M,的存在形式,MR,的组成等,显色温度,显色时间,溶剂的影响,萃取分光光度法：,MR,较,M,n,+,非,极,性增大，易溶于有机溶剂,浓缩，分离干扰,等,补充作业,:,在光度分析中，体系存在哪些干扰,?,应如何消除,?,最好举例说明。,2.6 具体应用示例,无机阴、阳离子的测定,利用高灵敏、高选择性的有机显色剂，与被测无机离子发生配合或氧化还原反应，可测定周期表中绝大多数元素,两组分的同时测定,例：临床中麻醉剂：普鲁卡因丁卡因注射液,它含有两种成分：盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因,这两种化合物结构相似，最大吸收波长分别为,291,和,312nm,。,但盐酸丁卡因的毒性比前者大,10,倍，因此配制时应严格限制其含量,双波长法的应用,可采用双波长，利用吸光度具有加和性来测定和求解，以减少二种化合物吸收峰重叠而产生的测量误差,原理:,自学北大教材(第2版)p.45-46,消除浑浊背景干扰,例：血清中胆红素的测定,胆红素的测定对治疗或预防脑核性黄疸有决定性意义，但高含量的胆红素容易导致样品浑浊，且血清中的血红蛋白在胆红素最大吸收（,460nm,）,处有吸收也干扰测定，采用波长组合为,461,、,551nm,测定胆红素，可有效地消除浑浊和血红蛋白的吸收干扰,已制成专用的双波长分析仪器，称为,胆红素仪,，,在临床实验室中广泛使用,有机化合物的定量分析,直接法,若有机化合物本身在结构上含有双键或,芳环，即含有共轭电子，则可直接测定其含量,间接法,被测组分不吸光或,很小,共存组分对测定有严重干扰,（1）氧化反应,常用于药物分析中,在5mol L,-1,H,2,SO,4,介质中，用0.1ml L,-1,K,2,Cr,2,O,7,氧化联苯羟胺为二苯酮，其,l,max,为257nm,（2）缩合反应,如微量氨基酸的测定,氨基酸的吸收,波长,在,280nm,左右，且 较小,低含量的氨基酸很难用直接法准确测定。可用茚三酮与各种氨基酸反应，生成无色还原型茚三酮，过量的茚三酮又与还原型茚三酮和氨缩合生成紫蓝色产物，称为,Ruhemann,紫，,l,max,=570nm,，利用此反应可测微量的氨基酸,这个反应还广泛应用于蛋白质序列结构分析中,食品中糖的测定,各种糖与蒽酮在,H,2,SO,4,介质中反应，生成的蓝绿色化合物(特效反应)。若改变反应时间、温度，可测出果蔬中葡萄糖、果糖、蔗糖的含量,蓝绿色,640nm,与金属离子生成有色配合物,安眠镇静药物苯并噻嗪类化合物，在,pH=2,时与,Pb,2+,反应生成红色配合物,本章小结,物质为什么会有色 （吸光）；,物质为什么会吸光,为什么可用吸收光谱曲线来定性,定量依据：比耳定律,A=,bc,如何进行定量分析,误差来源及消除方法,条件实验的必要性,参比溶液的选择,方法的选择,仪器的结构,开放作业,2.,通过阅读教材及查阅相关资料，探讨如何采用紫外,-,可见分光光度法测定某有色配合物的络合比及其稳定常数？,如何测定某染料的离解常数？,请各举一例说明！,