免疫组织化学.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,是指用已知的抗原或抗体去检测待检组织中的抗体或抗原，抗原抗体结合后再用一系列呈色反应，在光镜下观察，确定组织的来源、属性和部位。,目前免疫组织化学已成为科学研究及病理诊断中最重要的手段之一，而且已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献。,一、免疫组织化学的定义,抗原（抗原，AG）,抗原是一类可以被机体的免疫系统识别，并刺激机体免疫系统合成和分泌免疫效应分子(,抗体,)，同时可以与免疫效应分子在体内或体外发生特异性结合的物质。,抗原的性质,异物性,它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物、异体大分子物质可产生免疫应答。,理化性状,抗原分子量越大，其相应的表面积也越大，接触、碰撞免疫细胞的机会就增多，它的免疫原性就越强。,抗原的类型,1.肿瘤相关抗原,2.分泌抗原,3.,吞沉抗原,抗原的纯化,为了获得理想的抗体，使免疫组化技术达到定性可靠和定位准确的目的，不论是哪一种抗原，都必须进行纯化，以排除杂质，否则将会产生非特异性染色。,抗体（抗体,AB）,机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白物质称为抗体。,1.多克隆抗体(Polyclonal抗体,PCAB),此类抗体成份较多，是多种单克隆抗体的混合物，可以跟抗原的多个决定簇起反应，故称多克隆抗体。,2.单克隆抗体（Monoclonal抗体,MCAB）,只能跟抗原中的某个决定簇起反应而获得的抗体称单克隆抗体。,(一)抗体的种类,二、免疫组织化学技术的发展概况,免疫荧光细胞化学技术,它的,基本原理,是把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。在荧光显微镜下，根据其形成的复合物所发的荧光，来判断检测物的来源、性质和部位。,常用的荧光标记法,直接法：,这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与抗原结合，形成复合物。,评价：,该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织中免疫球蛋白和病原体的检测。但此法敏感性较差，只能检测相应的一种物质。,间接法：,基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。,评价：,本法发出的荧光亮度强，敏感性强。适用于多种第一抗体的标记显示，目前本法应用较广泛。但制作好的切片不能长期保存，影响资料的积累。,常用的荧光标记法,免疫酶细胞化学技术,这种技术的,基本原理,是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时，抗原抗体复合物中带有标记上去的酶，可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物，通过显微镜来观察判断，确定组织的来源、属性和部位。,免疫酶细胞化学技术,评价：,优点：,只需用普通光镜检查。,切片可长期保存，有利于资料积累。,可以会诊，所得结果较为客观。,既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片。,技术较为简单，易于普及和推广。,免疫酶细胞化学技术,存在问题：,酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学结构。,酶标抗体分子量较大，对组织的穿透性较慢。,抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响阳性物的判断。,敏感性不强，目前已不被使用。,非标记抗体酶法,由于酶标抗体存在许多问题，1974年,Strernberger,等人建立了非标记抗体酶法，其中最具代表的方法是过氧化物酶法即,PAP法,。,染色原理,：应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体复合物与PAP复合物连接起来，形成较大的复合物，利用复合物中辣根过氧化物酶HRP水解底物而呈色。,非标记抗体酶法,优点：,PAP法具有较高的敏感性。,存在的问题：,1.第一抗体和第三抗体必须为同种属动物。如一抗为小鼠的，则三抗也必须为小鼠的。,2.抗体孵育时间过长。一抗要求置于4冰箱中过夜孵育，长时间的孵育容易产生背景染色，影响染色的成功率，而且容易掉片等。,3.复合物分子大，对组织的渗透力差，影响结果。,卵白素-生物素复合物法(ABC法),它的,原理,是根据卵白素-生物素高亲和力的生物学特性，利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，在抗原抗体活性部位沉淀下来。,卵白素-生物素复合物法(ABC法),优点:,1.敏感性强，卵白素与生物素有4个连接部位，据认,为它比PAP法敏感性更高，高出约20-40倍。,2.需时少，节省大量的时间。如PAP法的一抗孵育时,间需十几小时以上，而本法只需1-60分钟。,3.背景清晰，阳性物鲜艳易辨。,4.抗体可被高度稀释，增加标记病例，降低成本。,卵白素-生物素复合物法(ABC法),存在的问题：,需要预先形成卵白素-生物素复合物，该复合物在结合了其他物质后，体积增大，行动缓慢。,卵白素中含有约7%的糖类，它可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景的染色。,卵白素带较多的负电荷，纤维组织带较多的正电荷，两种电荷互相吸引造成背景染色。,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法,（APAAP法),该法的,基本原理,是在加入一抗后，依靠二抗的桥接作用，将抗原抗体复合物和APAAP复合物连接起来，然后通过复合物中的磷酸酶对底物的水解，生成鲜红色或蓝色的产物。,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法,优点：,在其它许多方法中，如ABC法和PAP法等，应用的显色剂都是DAB，据认为该试剂有致癌作用，为了避免使用上述试剂，因而创立了这种方法。,它敏感性高，不受组织中内源性过氧化物酶的影响和干扰，可产生出鲜艳的红色或蓝色阳性物，非常容易被鉴别，常被用作双标。,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法,存在问题：,切片不能长期保存。因为显色用的是快红或快蓝，经这些染料染色后的颜色，不能经过酒精的脱水处理，否则所着染的颜色将被全部脱掉。只能用水性胶封片，然该种封片法保存的切片时间不长，一般只有数月即会褪色。,切片的透明度较差，拍摄照片效果欠佳。,免疫金银法,（IGSS）,基本原理：,通过免疫反应，沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化作用，用对苯二酚将银离子还原为银原子，银原子沉积在金颗粒周围形成“银壳”。它本身具催化作用，使更多的银离子还原并促进“银壳”越来越大，最终在光镜下就能看到被放大的黑褐色物质。,免疫金银法,优点：,该法敏感性高，特异性强，背景较低，阳性物容易辨认，可用于任何切片，能检测微量的抗原。,存在的问题:,操作繁锁，步骤较多。,需要预先制备成胶体金，且需要在暗室中进行。,使用的金-银试剂，容易造成沉淀或污染。,LSAB法或SP法,为了解决ABC法存在的问题，90年代初提出了用链卵蛋白素替代卵白素生物素复合物。该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白，有四个和生物素亲和力极高的结合点。,LSAB法是目前国内使用最广泛的一种方法，它敏感性强，效果好，背景清晰，无杂质。,LSAB法或SP法,优点：,1.不需预先形成复合物，分子体积小，行动灵活，对组织参,透性强。,2.链卵蛋白素的等电点为5.5-6.7，接近中性，不易与组织中的,正电荷发生相互吸引，因而可降低背景的染色。,3.链卵蛋白素不含糖基，不存在与组织中含糖基类的物质起,反应的现象。,4.链卵蛋白素有4个与生物素结合的点，它们可以全部和二,抗上的生物素结合，从而增加其敏感性。,LSAB法或SP法,5.节省时间，每种抗体的孵育时间都在10-30min左右。,6.抗体可以高度稀释，增加标记病例，降低成本。,7.背景清晰，无非特异性染色，阳性物突出，明显易,辨。,8.染色时间短，提高了染色的成功率，减少了反复制,作的机会，提高工作效率。,二步法,EnVision Systems,该法是近几年在国内推广使用的一种方法，它的原理是将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶聚合形成复合物后，可直接与抗原抗体复合物聚合在一起，经DAB显色即可完成染色。,EnVision TM Systems,评价：,敏感性更高，效果更好。,步骤减少，省时省力。,抗体的孵育时间可节省。,该系统不含有生物素，可以免除由内源性生物素所造成的背景染色。,背景清晰干净，阳性物突出明显。,三、常用免疫组织化学染色方法,(注：下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行),ABC法,切片经二甲苯 5分钟。,切片经二甲苯 5分钟。,无水酒精 30秒。,无水酒精 30秒。,95%酒精 30秒。,95%酒精 30秒。,90%酒精 30秒。,80%酒精 30秒。,70%酒精 30秒。,自来水洗。,0.3%H,2,O,2,甲醇处理切片10-20分钟。,水洗。,抗原修复。,PBS洗3次，1分钟/次。,加入血清孵育20分钟。,注:后面所述各种方法中的切片脱蜡至水同上述ABC法中1-10步骤.,(一)ABC法,加入二抗孵育30分钟。,PBS洗3次，2分钟/次。,加入ABC复合物，孵育30分钟。,PBS洗3次，2分钟/次。,DAB-H,2,O,2,孵育切片5-10分钟。,PBS洗，水洗。,Harris苏木素染核5-10分钟。,水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。,(二)LSAB法(SP法),切片脱蜡至水。,0.3%H,2,O,2,甲醇处理切片10-20,min,。,水洗。,抗原修复。,PBS洗3次，1,min,/次。,加入血清孵育10,min,。,摔去血清，加入一抗孵育30-60,min,。,PBS洗3次，每次2,min,。,加入二抗，孵育20,min,。,PBS洗3次，每次2,min,。,加入SP复合物孵育20-30,min,。,PBS洗3次，每次2,min,。,DAB-H,2,O,2,孵育5-10,min,。,PBS洗，水洗。,Harris苏木素染核5-10,min,。,水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固,(三)二步法Envision Systems,切片脱蜡至水。,0.3%H,2,O,2,甲醇处理切片10min。,水洗。,抗原修复。,PBS洗3次，1min/次。,加入一抗孵育30-60min。,PBS洗3次，2min/次。,加入增强剂孵育20-30min。,PBS洗3次，2min/次。,加入酶标抗兔/鼠复合物，37,孵育30min。,PBS洗3次，2min/次。,DAB-H,2,O,2,孵育5-10min。,PBS洗，水洗。,Harris苏木素染核5min。,水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。,四、抗原修复,为什么要进行抗原修复？,组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，以致在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。,用什么方法进行抗原修复？,至今为止，抗原修复有多种方法，在这些方法中，有的是根据抗体的要求来进行，有的是根据抗原的表达程度来进行。,(一)真空负压抗原修复法,操作方法:,切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)，真空负压干燥箱预先调至95，真空负压处理10分钟。,(一)真空负压抗原修复法,评价:,这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。,优点:,1.各物质的分子在失重的情况下四处飘游，增加各分子间的碰撞机会；2.有恒定的温度，既能使甲醛固定的蛋白发生变性，又不需要使抗原修复液达到沸腾，不易掉片；3.不受器皿条件限制，不管是金属性还是非金属器皿都可以进行操作；4.可以一次性制作大批的切片。,(二)微波辐射抗原修复法,操作方法:,切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)，于微波炉内微波辐射10分钟，如检测ER和PR则需要20分钟左右。,(二)微波辐射抗原修复法,评价:,该法的特点是：产热迅速，容易操作，也容易引起抗原修复液的沸腾，使用微波炉时禁止使用金属性的器皿，以防引起失火或爆炸。,(三)高压抗原修复法,操作方法:,切片放入抗原修复液中，同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1-4分钟。,(三)高压抗原修复法,评价:,该法应用高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至沸腾，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121左右。该法被应用于一些较难修复的抗原，经多次实验认为，该法效果不错。,(四)隔水热抗原修复法,操作方法:,切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH0.6)中，同容器一起放入水浴锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后(92)。即开始计时，持续40分钟。,(四)隔水热抗原修复法,评价:,该法效果不及前面三种方法，它需要较长时间的热的作用，在早期应用于ER和PR染色的抗原修复时，我们的修复时间为40分钟，如果达不到这时间，效果将不理想。,(五),电炉加热抗原修复法,操作方法:,将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92后，即可拔离电源，当温度低于92时，再插上电源，如此反复持续10分钟左右。,(五),电炉加热抗原修复法,评价:,该法是在没有上述的设备时才选用的一种方法，当然效果是最差的，因为它只是单靠热的作用，这是远远不够的，另外，电炉加热必须常用温度计来测量温度，对其温度不好控制，有时需要多次关闭电源来维持所需的温度。,五、,做好免疫组织化学必须注意的问题,组织固定越新鲜越好。,组织脱水必须彻底干净。,切片必须完整、均匀、平展、无皱折。,切片的附贴必须牢固，使用合适的粘贴剂。,切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不脱片，又不至于破坏抗原。,切片脱蜡必须干净，否则将会影响结果。,注意事项,注意事项,彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。,适当合理地使用封闭试剂。,选择合适的抗体。,连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象。,复合物的使用及孵育时间的确定。,PBS的冲洗。,六、免疫组织化学在临床病理诊断中的应用,病理学教研室 帅萍,(一)免疫组化常用抗体标志物,上皮性标志物,1.细胞角蛋白（Cytokeratin,CK）,有20种不同分子量的CK，高分子量CK见于扁平上皮、低分子量CK见于腺上皮。,CK阳性的肿瘤有：绝大多数上皮源性肿瘤，另外脊索瘤、胸腺瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤和上皮性神经内分泌肿瘤等可呈阳性表达。,胃腺癌CK8阳性,食道鳞癌CK5阳性,2.上皮膜抗原,(epithelial membrane antigen EMA),EMA在乳腺与皮肤附件肿瘤中表达最强。,EMA 敏感性不如CK，在肝细胞癌、基底细胞癌、胚胎癌及许多内分泌肿瘤中不表达。,EMA 特异性比CK低，在浆细胞瘤、R-S细胞、CD30阳性间变大细胞淋巴瘤、神经膜瘤中可表达。,EMA与CK两者同时应用可提高诊断准确率。,乳腺小叶增生EMA阳性,非上皮性标志物,1.波形蛋白（Vimentin）,绝大多数间叶组织肿瘤阳性表达。,但肾细胞癌、肺大细胞癌、子宫内膜癌，甲状腺癌可呈阳性表达。,恶性纤维组织细胞瘤Vimentin阳性,2.肌组织标志物,结蛋白（desmin）：平滑肌及横纹肌肿瘤的标志物,肌动蛋白（actin）：平滑肌及横纹肌肿瘤的标志物,肌红蛋白（myoglobim MG）：横纹肌及其肿瘤的标志物,胃黏膜肌层Desmin阳性,平滑肌肉瘤SMA阳性,扁桃体外横纹肌Actin-Sarcomeric阳性,3.内皮细胞及其肿瘤标志物,第八因子相关抗原(F8):血管瘤及高分化血管肉瘤表达，低分化血管肉瘤不表达,CD34：血管良恶性肿瘤及胃肠间质瘤,血管F8因子阳性,小血管内皮细胞,CD34阳性,4.组织细胞标志物,CD68,溶菌酶（Lysozyme）,特异性不强、两者联合应用较好,肝脏kupffer细胞 CD68 AEC染色,恶性纤维组织细胞瘤 溶菌酶 AEC染色,淋巴造血组织标志物,1.白细胞共同抗原(LCA,CD45)，浆细胞及R-S细胞不表达。,2.CD3 CD45RO T细胞及T细胞淋巴瘤,3.CD20 CD79 B细胞及B细胞淋巴瘤,4.CD15 CD30 经典型霍奇金淋巴瘤R-S细胞标记物。,5.髓过氧化物酶(MPO)急性粒细胞白血病、粒细胞肉瘤。,扁桃体CD3（T细胞标志物）,扁桃体CD20(B细胞标志物),霍奇金淋巴瘤 CD15 R-S细胞标记物,神经源性肿瘤标志物,1.胶质纤维酸性蛋白(GFAP),各种胶质瘤及室管膜瘤表达，,可与脑膜瘤鉴别;,少突胶质瘤阴性。,脑胶质瘤GFAP,神经源性肿瘤标志物,2.S-100蛋白:神经鞘瘤、少突胶质瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤，软骨及脂肪组织肿瘤,敏感性高、特异性较差,恶性黑色素瘤,S-100,神经源性肿瘤标志物,3.神经纤维细丝蛋白（NF）,神经节瘤、神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤表达。,脑胶质瘤NF,4.神经特异性烯醇化酶NSE 及嗜铬素A(CgA)：,嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、类癌、尤文肉瘤、Merkel细胞瘤。,甲状腺髓样癌、肺小细胞癌等。,神经源性肿瘤标志物,胃神经内分泌癌CgA,其它,人类黑色素瘤抗体（HMB45）,黑色素细胞及黑色素瘤标志物,淋巴管肌瘤病，血管平滑肌脂肪瘤，肺透明细胞癌，透明细胞肉瘤可表达。,恶性黑色素瘤HMB45,(二)常用抗体细胞内准确定位,(1)细胞膜：,E-Cadherin,CD31,CD56,Catenin,dystrophin,EGFR,HER-2,C-kit-CD117,LCA,CD20,CD10,CD2,CD5,CD43,CD30,EMA,CEA,CA125,HER-2,(2)细胞核：,Cyclins,cdk,P16,ki67,PCNA,MyoD1,MG,TTF-1,CDX-2,P53,P63,Rb,WT1,TdT,ER,PR,AR,S-100,Calretenin,herpes,HBcAg,ER,(3)细胞质：,lysozyme,CD68,myeloperoxidase,HMB45,Melan A,granzyme B,syn,CgA,NSE,PTH,ACTH,insulin,FVIIIRAg,PSA,surfactant,CK,VIM,DM,GFAP,NF,MG,A,FP,HBsAg,Ig,CD3,CD79a,PCK,(三)免疫组织化学在肿瘤病理学中的应用,1.低分化恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断,如：低分化癌与肉瘤鉴别 CK vimentin,低分化癌与淋巴瘤鉴别 CK LCA,2.确定转移性恶性肿瘤的原发部位,如：淋巴结转移癌 Tg+,脑转移癌 PSA+,3.确定肿瘤的组织来源,如：梭形细胞肿瘤：Vimentin S-100 SMA,圆形细胞肿瘤：LCA S-100 NSE,HMB45 CD99 CK等,4.淋巴瘤的诊断及分型,CD系统目前确定抗原数从CD1-CD130，其可,标记T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞、单核,细胞、NK细胞、树突细胞、血小板等。,如：淋巴结反应性增生：CD20+，CD3+，,，,双项表达，bcl-2(-),滤泡性淋巴瘤：CD20+，CD3-，,，,单项表达，bcl-2(+),间变性大细胞淋巴瘤：CD30+，ALK+(T/B),弥漫性大B细胞淋巴瘤：CD20+，CD79+，CD3-，CD45RO-，ALK（-）,5.为临床判断患者预后及制定治疗方案提供参考,ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)。,乳腺癌 ER PR C-erbB-2 三苯氧胺 预后,+-+,+,-+,乳腺导管内癌ER(雌激素受体),乳腺浸润性导管癌PR(孕激素受体),肿瘤细胞增殖活性标记物PCNA、Ki-67,PCNA、Ki-67指数高表明肿瘤细胞生长活跃，多有浸润，容易转移，预后差。,胃腺癌Ki-67,食道鳞癌PCNA,多糖耐药基因编码酶的活性检测可指导化疗,P-gp(p糖蛋白)，GST-（谷胱甘肽S转移酶）的,表达水平增高,可致肿瘤细胞对某些化疗药物不敏感。,TOPO(拓朴异构酶)表达水平,降低或缺乏,表明肿瘤细胞对某些化疗药物具有耐药性。,结肠腺癌,P-gp(p糖蛋白),食道鳞癌GST-(谷胱甘肽S转移酶),肺鳞癌TOPO(拓朴异构酶),小 结,1.免疫组化是肿瘤病理的重要辅助诊断方法之一，特别是对肿瘤的分类具有重要意义。,2.肿瘤标志物由于其敏感性的限制可出现假阴性，由于其非特异性可出现假阳性。,3.HE切片是病理诊断的基础，当免疫组化结果与HE切片所见相矛盾时，应以HE切片所见为病理诊断的主要依据。,谢 谢！,