碱法提取质粒.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,返回标题,一目的,二原理,附：原理示意图,三试剂,四器材,五注意事项,六操作步骤 1,六操作步骤 2,六操作步骤 3,GFPuv质粒的信息图片,GFPuv vectors Description,Location of features 1,Location of features 2,Location of features 3,Location of features 4,Vectors Primer Location,Propagation in E.coli,一目的,了解提取质粒的原理。,学习和掌握质粒提取的方法和技术。,三个基本步骤：,细菌的生长和质粒的扩增,菌体的收集裂解及质粒DNA的分离,质粒DNA的纯化,返回目录,返回目录,二原理,质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验技术。,质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒DNA提取出来。,原理示意图,返回目录,LB培养基,back,配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：,细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g,细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract)5g,NaCl10g,摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in,2,(1.03410,5,Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。,STE,back,0.1mol/L NaCl10mmol/L TrisCl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)在15 lbf/in,2,(1.03410,5,Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。,溶液 I,back,50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L TrisCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA(pH8.0),在10 lbf/in,2,(6.89510,4,Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。,溶液 II,back,0.2 mol/L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释),1%SDS,溶液 III,back,5mol/L 乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml,所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。,3M乙酸钠(pH5.2）,back,在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。,0.5 mol/L EDTA(pH8.0),在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na2H,2,O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。,1 mol/L Tris,Cl,(pH8.0),在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1 L，分装后高压灭菌。,TE(pH8.0),back,10 mmol/L TrisCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0),50,TAE,242g Tris 碱,57.1 冰乙酸,100ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0,),1,TAE,0.04 mol/L Tris-乙酸,0.001 mol/L EDTA(pH 8.0,),四,器材,1.恒温摇床,2.超净工作台,3.离心机,4.电泳仪和电泳槽,5.玻璃器皿与耗材,量筒、三角瓶、平皿;,EP管(1.5ml,0.5ml);,枪头(1ml,0.2ml,10,l,);,牛皮纸、纱布、牙签等,返回目录,五操作步骤 1,挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的,3,ml LB,培养液中，,37,振荡培养,1416,小时。,取,1.2,ml,菌液，,12,000,rpm,离心,1,分钟，收集菌体。,加入,500,l1ml STE buffer，,涡旋打匀，,12,000,rpm,离心,1,分钟，收集菌体。,加入预冷的溶液,I 100l，,涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴,5,分钟,(,重悬细胞,),。,加入,200,l,溶液,(,现配,),，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴,(,碱变性染色体,DNA、,蛋白质,),。,在,5,分钟内，加入溶液,III 150l，,轻柔颠倒,510,次，冰浴,10,分钟（利用,pH,差异，复性质粒,DNA）,返回目录,五操作步骤 2,12,000,rpm,离心,10,分钟，沉淀染色体,DNA，,及不溶的变性蛋白，取上清。,上清液用,Tris,-,HCl,饱和苯酚：氯仿：异戊醇（,25：24：1,）抽提,1-2,次，每次剧烈振荡,20,秒，,12,000,rpm,离心,5,分钟，可见溶液分三层，上层为质粒,DNA,溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。,上清液用氯仿：异戊醇（,24：1,）抽提一次，,12,000,rpm,离心,10,分钟。,上清液加入,1/10,体积,3,M,NaAc,，2,倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置,10-15,分钟。,在,12,000,rpm,离心,10,分钟得到质粒,DNA,沉淀。,返回目录,五操作步骤 3,去上清，加入,1,ml 75%,乙醇，洗涤沉淀。,12,000,rpm,离心,10,分钟。,去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。,加入,3050,l ddH2O,或,TE（pH 8.0），,溶解质粒。,加入,RNaseA,使终浓度为,20,g/ml，,室温放置,30,分钟,1,小时。,1%,琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒,DNA,纯度及浓度。,取,1-5,l DNA,样品，加水稀释至,1,ml，,混匀后转入 分光光度计的石英比色杯中，,测定,OD,260,及,OD,280,，,并计算,OD,260,/,OD,280,比值和,DNA,浓度：,DNA,浓度,=,OD,260,稀释倍数,50/1000,（,g,/l,）,返回目录,分次收集4ml菌液离心，留沉淀,五操作步骤 4,琼脂糖（,1%,）凝胶电泳,称取一定量琼脂糖凝胶，按,1,g,中100,ml,的量加入,1,TAE，,微波炉中加热约,2,min，,使琼脂糖溶解；,溶液冷至,60,，加入,EB,至终浓度为,0.5,g/ml，,混匀，注意戴手套操作；,将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为,0.3-0.5,cm，,迅速插上梳子，检查有无气泡；,待凝胶完全凝固后（约,30,min），,小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入,1,TAE,电泳,buffer，,让液面高出胶面,1,mm；,在,DNA,样品中加入,1/6,loading buffer，,混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为,1-5,V/cm（,长度以两个电极之间的距离计算）；,根据指示剂的位置，判断是否终止电泳。,返回目录,pGFP pBSK M,六,注意事项,为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：,加入溶液,I,后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；,加溶液,II,裂解要完全,(,快速轻柔颠倒,510次),，使蛋白质和核酸变性；,加溶液,III,后,PH,要达到中性,(,轻柔振荡,510,次,),，使质粒,DNA,复性，这样才能使质粒,DNA,与染色体,DNA,完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。,返回目录,周四：,熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5/0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等,50,TAE:,500 ml,0.5mol/L EDTA(pH8.0):,500 ml,1mol/L,Tris,.,Cl,(pH8.0):,500 ml,0.1mol/L CaCl,2,:,500 ml,ddH,2,O:,每组,100,ml,5 mol/L,NaOH,:,100 ml,配,LB,培养基,液体：全班,1000,ml,150 ml4,瓶（,Amp+）(,终浓度为,60,g/ml)，,用于两个质粒的接种,100,ml 4,瓶(,Amp-)，,留做感受态细胞,固体（含,1.5%,琼脂粉）：,每组,100,ml,，,共,1500,ml,，,可一起配再分装,每组倒,5,个平板（,Amp+），,用于次周转化,灭菌。,七,实验安排,周五：,用Kit 提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定,每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60l,取1-2l电泳，1-5l用dd H,2,O稀释后 在紫外分光光度计下测 OD,260,及OD,280,，并计算浓度,对质粒酶切过夜,周六：,酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳,用Kit对酶切后的DNA（pBSK 大片段和GFP基因片段）片段进行胶回收,每组用一个柱子回收,电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA的浓度后，存放于-20,冰箱中,七实验安排-续,GFPuv质粒的信息图片,返回目录,GFPuv vectors,Description,pGFPuv carries the“cycle 3”variant of GFP described by Crameri et al.(1).This gene was cloned between the two MCSs of the pUC19 derivative pPD16.43(2).The GFPuv gene can be easily excised from pGFPuv.Alternatively,the GFPuv coding sequence can be amplified by PCR.The GFPuv gene was inserted in frame with the lacZ initiation codon from pUC19 so that a b-galactosidase-GFPuv fusion protein is expressed from the lac promoter in E.coli.Note,however,that if you excise the GFPuv coding sequence using a restriction site in the 5 MCS,the resulting fragment will encode the native(i.e.,non-fusion)GFPuv protein.The pUC backbone of pGFPuv provides a high copy number origin of replication and ampicillin resistance gene for propagation in E.coli.,返回目录,GFPuv vectors,Location of features 1,lac promoter:95178,CAP binding site:111124,35 region:143148;10 region:167172,Transcription start point:179,lac operator:179199,lacZ-GFPuv fusion protein expressed in E.coli,Ribosome binding site:206209,Start codon(ATG):217219;Stop codon:10031005,5 MCS:234281,返回目录,GFPuv vectors Location of features 2,GFPuv gene,Start codon(ATG):289291;Stop codon:10031005,GFP chromophore:481489,wt GFP cDNA sequences(3):289454,Synthetic GFP gene with cycle 3 mutations from pBAD-GFPuv(1):4551007,Cycle 3 mutation F99S(TC):584,Cycle 3 mutation M153T(TC):7Cycle 3,Cycle 3 mutation V163A(TC):776,Cycle 3 silent mutation in L137(TC):699,Cycle 3 silent mutation in T225(AT):963,Q80R mutation(AG)(4):527,返回目录,GFPuv vectors Location of features 3,GFPuv gene,Arg codons optimized for E.coli:R73(AgACgT):505507,R96(AgACgC):574576,R12(AgACgT):652654,R168(AgACgC):790792,R1215(AgACgT):931933,Silent mutations(CccATccG)creating BspE I site:510&513,Silent mutation(AG)creating Mlu I site:612,Silent mutations(TtGgaACtCgaG)creating Xho I site:709,711&714,Silent mutations(AGTC)creating BamH I site:811812,Silent mutation(CG)creating Sal I site:894,Silent mutations(ActAGctC)creating Sac I site:993&996,Silent mutation in S72(AC):504,返回目录,GFPuv vectors,Location of features 4,3 MCS:1071091,Ampicilin resistance gene,Promoter:35 region:14671472;10 region:14901495,Transcription start point:1502,Ribosome binding site:15251529,b-lactamase coding sequences:,Start codon(ATG):15371539;Stop codon:23952397,b-lactamase signal peptide:15371605,b-lactamase mature protein:16062394,pUC plasmid replication origin:25453188,返回目录,GFPuv vectors,Primer Location,GFP-N Sequencing Primer(#6476-1):331352,(Note:The GFP-C Sequencing Primer cannot be used with pGFPuv.),返回目录,Propagation in E.coli,Recommended host strain:JM109 or DH5a,Selectable marker:plasmid confers resistance to ampicillin(100 mg/ml)on E.coli hosts.,E.coli replication origin:pUC,Copy number:500,Plasmid incompatibility group:pMB1/ColE1,返回目录,