第1章食品生物技术概论.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,现代生物技术定义,：,以现代生命科学为基础,把,生物,体系与,工程学,技术有机结合在一起,，,按照预先的,设计,，,定向,地在不同水平上,改造,生物遗传性状或加工生物原料,产生对人类有用的,新产品,(或达到某种目的)之综合性科学技术。,2、要点:,对象,是具遗传特性有生命物质:包括病毒、细菌、植物、动物、直到人类。,生物体系多个,不同水平,研究:从大分子(DNA、RNA、蛋白质、酶)、亚细胞、细胞、组织、器官到整个机体。,应用工程学原理:经人类思维,设计方案、定向修饰、加工制作过程等体外操作环节。,有,目的产品,:目的产品有三个新特征:,新遗传功能、新遗传性状、新物种,。要有合乎人类所需的工业、农业、医疗和食品产品。,高新技术,起重要作用。,对象:,在核酸分子(DNA或RNA)或基因上操作。,定义:,在体外对DNA进行切割、拼接,使遗传物质重新组合,经载体转移到细胞中扩增表达,获得人类所需产品,或组建新生物类型的技术。,（二）细胞工程,（Cell engineering）,基本原理,体外大量培养技术、细胞融合技术(也称细胞杂交技术)、细胞拆分、染色体工程和繁殖生物学技术等,定义,:,指在体外条件下对细胞进行培养、繁殖，按人们的意愿改变细胞某些生物学特性，获得有用的产品或达到改良生物品种的技术。,对象:,细胞,在细胞水平上实现基因转移或改变生物学性状。,（三）发酵工程,（Fermentation engineering）,主要原理,包括微生物生长动力学，发酵条件的优化和控制，生化反应器的设计，以及产品的分离、提取和精制等技术,对象,:,微生物在常规发酵工艺上发展而成。有时也称微生物工程。,定义,:,利用微生物特定性状（生长快、培养简单和代谢过程特殊等）,通过现代化工程技术,快速、连续生产人类所需物质的技术。,要点,:,核心是提高产率,过程包括,:,菌种选育、生产、代谢产物的利用。,所用技术包括大规模悬浮培养,细胞固定化,产物分离提取。,应用,:,药物生产,(,活性多肽、抗生素,),、单细胞蛋白生产、环境保护、微生物冶金技术。,（四）酶工程,（Enzyme engineering）,主要原理,酶固定化技术、细胞固定化技术、酶化学修饰技术和酶反应器设计等技术,对象:,酶分子修饰、生产应用和酶的固定化,定义:,利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。,（五）蛋白质工程,（Protein engineering）,对象:,基因序列DNA分子中改造,最终导致蛋白分子氨基酸序列改变。,定义:,蛋白质工程，是以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。,核心:,蛋白质空间结构,DNA重组,人工定向改造蛋白质功能域构象,使得功能改变。,这被称为是生物技术发展的第二浪,如通过增加或减少人工二硫键、置换氨基酸等修饰技术,提高或改变活性多肽(激素、酶、细胞因子)的稳定性。,1、生物技术与粮食,提高产量、品质,普通大米实际上不是“健康食品”,大米中含有一种叫做肌醇六磷酸的小分子，它能与铁紧紧地结合，使得小肠难以吸收食物中的铁,以大米为主食的人，易患铁缺乏症而导致贫血,哪种大米更有益身体健康？,转基因水稻,“,金大米,”：转入胡萝卜素合成相关基因提高大米中维生素A前体的含量，以减少亚洲人普遍存在的维生素A缺乏症,解决铁吸收的问题，往“金大米”中再转入三种基因：,一种是来自真菌的酶基因，这种酶能够把肌醇六磷酸降解掉；,一种是来自菜豆的铁蛋白基因，铁蛋白能够储存铁；,还有一种是来自印度香米的基因，它生产的蛋白质有助于人的肠道吸收铁,低过敏性转基因水稻,低蛋白转基因水稻,哪种大米更有益身体健康？,超级杂交稻,2005年5月13日，位于三亚市田独镇新村田洋的中国超级杂交稻第一块“百亩片试种示范田”正式通过了海南省级验收。经由全国多位农业专家共同检测，这批超级杂交稻的亩产高达833.23公斤,功能稻米,基尔米：拥有降血压、改善睡眠、减肥美容等功能的大米，售价最高的一种达元钱斤,生物技术与农业科学,2、抗性基因工程育种,基因工程为培育抗病虫的作物提供了新的手段,目前，已经获得的转基因抗虫农作物包括烟草、番茄、马铃薯、棉花、玉米等,在抗逆境育种上的应用为克服干旱、盐碱等提供新思路,美国斯坦福大学把仙人掌基因导入小麦、大豆等作物，育成抗旱、抗逆的新品种。,我国已克隆了耐盐碱相关基因，,通过遗传转化已获得了耐盐烟草、,水稻、西红柿、草莓等。,生物技术与农业科学,转基因抗虫棉,我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，约占世界产棉总量的,25%,以上,自,90,年代以来，由于棉铃虫在我国大部分棉区持续性大发生或暴发，给我国棉花生产带来了巨大的威胁，棉农谈虫色变，面积、单产、总产一直处于低谷的徘徊阶段,我国现已有18个国产抗虫棉品种通过了审定，目前种植的转基因品种中约有一半是国产品种。在全国各棉区正在大面积推广。,1990,年，美国利用生物技术，合成,苏云金,芽孢杆菌（,B.t,）杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花,抗植物虫害的基因有多种，日前经常使用的主要有三种：,Bt,基因,从植物中分离出的昆虫的蛋白酶抑制剂，其中应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因,(,CpTI,),植物凝集素基因,(,lectin,gene),生物技术与农业科学,3、花卉基因工程,花色工程,花卉香味工程,通过合成酶的引入，增强单萜的合成,花卉保鲜,通过导入反义ACC合成酶基因及反义ACC氧化酶基因可阻止乙烯生化合成，延长花期和鲜切花寿命,花卉抗性基因工程,运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动物,4、在畜牧业中的应用,生物技术与农业科学,中国科学院水生生物研究所朱作言首次用人的生长激素基因,(,hGH,),构建了转基因鱼，制作的主要目的是提高生长速度、增加抗逆性以及为发育生物学和插入突变提供研究的材料。,使用鱼类自身的基因元件构建转基因鱼，可以解决基因表达强度问题和推广转基因鱼的环境和伦理道德问题。,自,1984,年以来先后进行了泥鳅、鲤鱼、鲫鱼等的转基因研究。,5、生物技术与农药,绿色农药包括微生物杀虫剂、微生物杀菌剂、农畜抗菌素、植物源农药等,植物源生物水剂农药,（,松脂酸钠和茶皂素的复合制剂、,苦楝油）,生物农药菌种资源（苏云金杆菌）,特点,环保，良好的环境相容性,先天弱势：药效慢、击倒慢、适应力差,综合防治,生物技术与农业科学,农业领域的拓展,拓展领域,向食品轻工领域发展：酶工程、L-乳酸发酵工程,向能源：燃料：石油（黑金）作物（绿金）,向材料环保：,全淀粉乳酸聚合塑料、生物全降解塑料,生物农药及生物防治技术,发展趋势,生物资源创新工程专业、区域、企业、市场化,传统农业“高投入、低产出”“低投入、高产出”,投身生命科学,生物技术与农业科学,生物技术在食品领域的应用,主要应用,在食品生物,资源的改造,、,提高食品品质,和,改善食品风味,、,油脂生产,以及,食品卫生检测等,不是仅仅解决粮食问题,更重要的是，满足人们,对食物感官舒适、营养丰富、功能全面的完美要求,食品级壳聚糖,：,用于功能性食品，保健品，胶粘剂，人体补铁剂，可降解性食品包装袋等,一、,应用现状,主要技术,基因工程,细胞工程,酶工程,应用领域,发酵工程,食品添加剂:,用生物法代替化学合成，要大力开发功能性食品添加剂等,生物技术与食品业,二、在食品加工过程的应用,工程菌,改良食品微生物的生产性能,改变合成途径，改善风味,氨基酸生产,生产食品酶制剂，提高活性、稳定性（淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等，添加酶类进行食品组分的改性）,食品保鲜：乳酸菌肽防腐,生物技术与食品业,三、农副产品深加工和综合利用,玉米等深加工,作为新型糖源、变性淀粉、玉米油、发酵酒精、环状糊精以及工业用材料提供优质充足的原料,肉、奶、水产品加工,植物纤维素资源,生物技术与食品业,在食品检测中的应用,食源性病原菌快速检测,转基因食品检测,我国农业转基因生物安全管理,2004年10月，我国制定农业转基因生物安全管理条例,一般应经过中间试验、,环境释放和生产性试验,四、生物技术与食品安全性检测,生物技术与食品业,生物技术在能源开发上的应用,能源分类,不可再生能源：煤、天然气和石油（包括核能）等化石原料,可再生能源：太阳能、风能、地热能、生物能、海洋能和水能,生物能源是从太阳能转化而来的,绿色植物就是光能转换器和能源之源，碳水化合物是光能储藏库。,我国拥有丰富的生物质资源,每年7亿多吨作物桔秆、2亿多万吨林地废弃物、25亿多吨畜禽粪便及大量有机废弃物,生物能源制煤气：柴草桔杆气化炉,生物技术在环境科学方面的应用,一、什么是环境生物技术,是生物技术在环境治理和,环境保护中的应用而衍生,出的一门新学科和新技术,二、生物技术在环境保护中的应用,生物传感器为代表的环境污染监控技术,工业和生活污染物的微生物降解技术,生态环境生物防治和生物修复技术,环境友好可再生材料和能源的生物合成技术等,生物传感器,利用固定化生物层与目标污染物之间的专一性作用进行检测。,根据所用敏感物质可将生物传感器分为,生物催化和免疫,(,酶、微生物等,),利用核酸做探针的,DNA,传感器,生物技术与环境,1、环境污染监控技术,水污染监测,在水质评价过程中最常用、最重要的指标之一是生化需氧量(BOD),常规BOD测定方法是:在(20 1)培养5d,分别测定样品培养前后的溶解氧,二者之差即为5d 的生化需氧量,并以BOD,5,表示,生物传感器测定BOD 只涉及到初始氧化速率,两者之间的相关性可以通过对标准溶液的测定获得,将测定时间缩短到1h以内。,生物技术与环境,基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染,生物技术与环境,2、环境污染治理,：,生物降解：,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解油（烷烃类）、有机农药等多种污染环境的物质。,生物技术与环境,3、生态环境生物防治和生物修复技术,生物修复是指利用生物的代谢活动减少环境(包括土壤、地表及地下水或海洋)中有毒有害化合物的工程技术系统,应用土壤植物和微生物修复,生物技术与环境,4、环境友好可再生生物材料和能源开发技术,生物技术与环境,生物降解塑料,“,天然产品聚交酯”,微生物在不平衡生长（如氮或磷不足）条件下，以颗粒状态在细胞内储存各种,生物高分子聚合物,统称为聚羟基脂肪酸酯,二、食品生物技术的定义：,是现代生物技术在食品领域中的应用。是以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。,六、现代食品生物技术的作用,主要表现在两方面：,（一）现代食品生物技术对人类健康和营养的影响,营养水平,；,健康水平,；,提高水果和蔬菜的货架期,；,预防疾病,；,增加农产品的附加值,等,（二）现代食品生物技术对经济发展和环境的影响,缓解粮食短缺问题,；,提高农产品质量和产量,；,改进作物抗逆性特性,；,增加农产品的附加值，促进经济发展,；,污水处理，改善环境等,食品生物技术对人类的作用可以归结为,：,（1）解决食品短缺，缓解由于人口增长带来的压力；,（2）丰富食品种类，满足不同层次消费人群的需求；,（3）开发新型功能性食品，保障人类健康；,（4）生产环保型食品，保护环境；,（5）开发新资源食品，拓宽人类食物来源。,七、食品生物技术的发展趋势,食品生物技术,食品添加剂新品种,微生物保健食品,螺旋藻类藻类食品,虫类高蛋白食品,病原菌的检测,食品安全检测,农副产品深加工,推动食品工业可持续发展,食品组分改性及加工,转基因食品,什么是转基因生物(GMO)?,就是将某一个原生的物种，以人工的方法，转殖接入其它物种的基因，或者是将该物种的基因做修饰改造后，所产生的新的物种。这个新物种就具备新的基因型，也因此会有新的性状。,转基因食品？,就是以基因改造生物本身作为食品，或者是成份中含有基因改造生物的食品。一个物种的某一种性状通常是因为它具备了某个（些）基因，而因为这个基因表现，合成这个基因工的蛋白质，再由这个蛋白质来具体呈现该性状。,基因食品的类型,抗逆境型：,耐除草剂、抗逆境、抗虫害,控熟型：,使作物熟期提前或延迟，错开盛产期。,营养型：,转入作物中所缺乏的营养素产生基因，而生产高营养价值的作物，以避免营养素缺乏症。如黄金米。,保健型:,转入病体抗原基因或毒素基因至粮食作物或果树中，借由植物的摄取而获得疫苗。由将预防疾病（动脉硬化或骨质疏松症）的食物理成分相关基因转入植物，以获得保健上的功效。例如，无咖啡因茶和咖啡。,新品种：,利用基因重组技术形成新品种，改,善原产品的品质、质地、风味等，以适应或开拓市场。,加工型：,为从事食品加工是所需的而研发的基因改造食品。,增产型：,转入与产量相关的基因。,转基因食品有以下优点：,增强农作物的抵抗力,如对虫害的抵抗力，从而减少使用杀虫剂（防虫）。占美国玉米产量三分之二的抗虫玉米，可使一年的玉米产量增加一千万吨。,适应恶劣环境,使农作物更能适应不利的生长环境，如干旱（抗旱）、含高盐分土壤或特别湿润的环境。例如，改变作物的亚麻油酸含量，使其可以忍受低温及霜害。,转基因食品有以下优点：,增加农作物的产量,全球自1996年2010年为止，基因改造作物栽培面积已经从170万公,頃,，迅速窜升到,1.48亿,公,頃,，增加87倍。根据联合国世界粮农组织统计，2030年世界人口将由03年60亿人增加到81亿人，其中8亿1500万人可能将处于饥饿状态。2010年全球转基因作物的种植面积比上一年增加10%.,改良农作物的营养状态,增加稻米的蛋白质含量，或是降低作中的脂肪含量等等。至于维生素A、碘和锌等世界性营养缺乏的问题，更可能经由基因重组的技术，使作物成为营养强化的自然食品。,转基因食品有以下优点：,改良食品的外观、味道和口感,经基因重组技术改良过的番茄，可以延缓成熟，使采收到的运送到市场的时间可以延长，而消费者在拿到产品的有最佳的色泽和香味。,改良农作物的特性,使其易于加工，减少浪费和降低生产成本，如经基因重组技术改良过的马铃薯，淀粉含量较高，油炸时吸油量较少。,除去食物中某些可引致过敏的成分,转基因生物的缺点：,可能对昆虫造成伤害,可能影响周边植物的生长,可能在昆虫或病菌在演化中增加抵抗力,或产生新的物种之后一样有可能会伤害作物。,现代生物技术定义：,以现代生命科学为基础,把,生物,体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的,设计,，,定向,地在不同水平上,改造,生物遗传性状或加工生物原料,产生对人类有用的,新产品,(或达到某种目的)之综合性科学技术。,二、食品生物技术的定义：,是现代生物技术在食品领域中的应用。是以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。,1958年，F.Crick提出了解释DNA，RNA及蛋白质三者关系的所谓中心法则：,1.中心法则,DNA,RNA,蛋白质,根据中心法则DNA会自我复制，而RNA及蛋白质二者都不能够自我复制，因此生物体中能够永久保存代代相传下去的是DNA分子，或说是基因。,2.遗传密码,遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程，叫作基因的表达。它涉及遗传信息的,转录和转译,两个步骤。,转录,根据碱基互补原则，遗传信息从DNA的核苷酸序列形式转换成RNA核苷酸序列形式的过程叫作转录，也叫RNA合成。,转译,遗传信息从mRNA的核苷酸序列形式，转变成蛋白质多肽链氨基酸序列形式的过程叫作转译，也叫蛋白质合成。,当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，转译与转录不同，它不是简单的核苷酸序列的转换过程，而是将mRNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链上氨基酸语言的负责过程，是涉及到两种不同语言信号之间的更换问题。,因此，在从mRNA到蛋白质多肽链的转译过程中，必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才能够将RNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质多肽链分子上的氨基酸顺序联系。这种遗传密码在1966年已经完全破译。,原核细胞的基因结构,原核细胞基因,编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质,非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等,原核细胞的基因结构,RNA,聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。,真核细胞的基因结构,与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：,编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。,其中，能够编码蛋白质的序列叫做,外显子,，一般不能够编码蛋白质的序列叫做,内含子,。,真核细胞的基因结构,真核细胞基因,编码区,（间隔、不连续）,外显子：能编码蛋白质的DNA序列,内含子：不能编码蛋白质的DNA序列,非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,连续的,编码区是间隔的、不连续的,相同点,都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的,基因的基本组成部分,编码区,包括起始密码子，终止密码子和氨基酸密码子；,非编码区,5-,末端非转译区，,3-,末端非转译区，真核基因,的间隔区；,启动区,RNA,聚合酶结合部位，由此启动基因的转录作用；,终止区,具有终止转录作用的功能。,不管是真核基因还是原核基因，都具有如下4个基本的组成部分：,基因的种类,（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。,（2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。,（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。,启动子与终止子,启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。,终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,（1）基因,基因是遗传信息的基本单位。,基因是一种物理实体，是一种化学分子，通过改变这个分子的结构可以改变基因的信息内容，从而改变相应的生理功能。,基因通过指导蛋白质或,RNA,分子的产生，或者通过影响其他基因产生这些产物的方式来发挥其生理功能。,八基因及基因工程的概念,在染色体或,DNA,分子上，基因呈线性排列，并非所有的,DNA,序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区，,因此基因是有特定功能的,DNA,片段。,一般来说，一个基因大约含有,1500,个核苷酸对，基因本身也具有线性结构。,（2）基因组(Genome),基因组是指一个物种的单倍体的染色体所携带的全部基因。,对于多数只有一个染色体的原核生物来讲，如细菌、噬菌体它的整个染色体所包含的全部基因组成其基因组。但对于通常的二倍体高等生物来讲是指能维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体所包含的全部基因。,七基因及基因工程的概念,（3）基因工程（geneticengineering）,以分子遗传学为基础，在体外对DNA进行切割、拼接,使遗传物质重新组合,经载体转移到细胞中扩增表达,获得人类所需产品,或组建新生物类型的技术。,除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术(DNA Recombination)。,DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为基因克隆(Gene cloning)或分子克隆(Molecular cloning)。,基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。,（4）与基因工程相关的概念：,1.克隆,（,clone,cloning,）：,原意是指单细胞纯系无性繁殖。通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。获取这一群体的过程称为克隆化（,cloning,）。,现代概念是是按人类的意愿，在体外对,DNA,分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该,DNA,分子的大量拷贝的技术。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（,molecularcloning,）。,2.重组DNA技术,(DNArecombinationtechnique),是用酶学的方法将不同来源的,DNA,在体外切割，连接组成一个杂合的,DNA,分子的技术。基因工程包括,DNA,重组技术。,基因工程至少需要3种工具：,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,DNA连接酶“分子缝合针”,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,一限制性核酸内切酶,（一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）,1.定义 限制酶（restriction endonuclease,restrction enzymes）,是一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）,2.分类 限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。,（1）、型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说型识别核切割的位点一致，但罕见）。,（2）型 基因工程说到的限制酶是型酶，具有此类酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。型酶分子量小，仅需Mg,2,作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段,。,3.,命名（1973年Smith和Nathaus 原则、,型酶）,根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。,第一个字母大写 该微生物属名的前第一个字母,第二、三个字母小写 该微生物种名的前2个字母,第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母,罗马字母、从一种微生物中发现了几种限,制酶，按发现顺序排列,如,Eco,R是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。,(二)限制酶的识别位点,1,一般特征（4点）：,（1）型酶,识别的特殊DNA序列,称为限制酶的识别位点（或切割位点）。,（2）它能,识别dsDNA的46bp的回文序列并水解该部分的核苷键。,一般来说是46bp，有6个以上的，但没有4个以下的。,（3）,识别顺序呈二重对称，即180,0,旋转对称。,如：,GC CG GTNAC GAA TTC,Hha CG GC Mae CANTG EcoR CTT AAG,(4),酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。,双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。这段序列被称为回文序列。,其特点是在该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同（并非在同一条链上正读反读）。例如5GGTACC3,3CCATGG5,2.识别简并序列;,简并序列 是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：,GTYRAC Y=C或T R=G或A YR=CG或CA或TG或TA,Hin 实际上可以识别4个特定序列。,3.识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的(某些酶识别位点在切割位点附近),即产生特定的DNA片段，这是与型酶的区别之一。,Hga 识别位点GACGC5/10(核苷酸距离)dsDNA上切割,5 GACGC NNNNN NNNNN 3,3 CTGCG NNNNN NNNNN 5,先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为Distant cleavage,(三)限制酶的切割位点：,限制性对dsDNA 2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口：,1,形成平头末端（flush或bluntend）在识别序列对称轴处平齐切割DNA两条链而形成的平头双链末端。如,TCGA-smabsuR or TC3+5GA-,AG CT-Alu -AG5+3CT-,2.形成5粘性末端（5cohesive end即3延伸末端）,5-GAATTC3EcoR 5-G AATTC-3,+,3-CTTAAG5 3-CTTAA G-5,3.形成3粘性末端（3cohesive end）,5,CTGCAG 3 pst G-3 5-CTGCA,+,3GACGTC 5 ACGTC-5 3-G,粘性末端（sticky end）,限制酶切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端。,二DNA连接酶：,DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T,4,DNA ligase.,（一）功能：,催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。,（二）来源,噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD（1KD=1000道尔顿）。,（三）催化反应：,（1）需要ATP、Mg,2+,作辅助因子；,（2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。,（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）,三、逆转录酶,（一）概述,逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase,RDDP）。是由Baltimove从鼠白血病病毒（murine leukemia virus,MLV）和Mizutan从劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)中，于1970年分别各自发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循环中起主宰作用。,（二）功能,基因工程中主要用于逆转录mRNAcDNA（complementory DNA）。使用该酶可以获得目的基因，也可以用来标记cDNA作为放射性探针.,（三）商品化逆转录酶有两种,AMV（禽成髓细胞瘤）Mc-MLV(鼠白血病病毒)。,四、DNA聚合酶：,DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：,（一）大肠杆菌DNA聚合酶（E.coli DNA pol）,五核酸酶,常用的是单链特异的SI核酸酶（核酸酶SI,nuclease SI，SI）和BAL31。,六、碱性磷酸酶（alkaline phoptase,APE）,APE包括BAP（细菌碱性磷酶和CIP（小肠碱性磷酶）。功用如下：,（一）去除DNA、RNA和dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的5,磷酸根。,（二）去除5-P，防止DNA片段或载体自身环化。,（三）32p标记5末端前，先用其去除DNA或RNA上的5-P。,几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用,酶,来源,活性,底物,辅因子,特点,用途,1.限制酶（）(restriction endonuclease,restrction enzymes）,微生物,400RE/350M,内切,dsDNA,Mg,2,特异性识别和切割dsDNA,产生平头或粘性（5-3-）末端,1DNA重组2.组建新质粒3.构建物理图谱4.制备探针5.DNA序列分析6.分子杂交,2.连接酶（ligase）,T4phage,连接两个片段,dsDNA,Mg,2+,ATP,活力：粘端平端,1DNA重组2.DNA序列分析,3.DNA聚合酶（DNA pol）,E.coli,53聚合；3-5外切；5-3外切,ssDNA,dsDNA,dsDNA,ssDNA,Mg,2,对dsDNA外切活性可被53pol活性所,1.制备探针2.DNA序列分析,酶,来源,活性,底物,辅因子,特点,用途,4.逆转录酶（Reverse,Transcription）,RNA肿瘤病毒,RNAcDNA；,DNADNA,RNAseH解旋,ssRNA,ssDNA,RNA:DNA,cccDNA,Mg,2,RNA指导,DNA指导,解超螺旋,制备cDNA,5.SI核酸酶（Nase SI）,米曲霉,切单链,ssDNA,ssRNA,Zn,2,切除单链,切尾巴，产生平端，用于质粒组建和DNA重组,6.BIP/CIP,细菌/牛肠,切除磷酸,ds,ss,Ca,2,Mg,2,阻断片段或载体自身环化。,一、载体的功能、特征及质粒载体,克隆载体（clony vector）,：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。,目前基因工程中常用的载体有：,细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体等。,一）载体的功能,1.运送外源基因高效转入受体细胞,2.为外源基因提供复制能力或整合能力,3.为外源基因的扩增或表达提供条件,二）载体应具备的特征条件,1.能在宿主细胞内,独立和稳定的自我复制,2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有,多种单一的酶切位点,5.具有合适的,选择性标记,多克隆位点,(是包含多个（最多20个）,限制性酶切位点,的一段很短的DNA序列。),ori,复制起始点,遗传标记,(又称,标记基因,),Amp,polylinker,基因载体,三）质 粒,（plasmid）,质粒,是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的,共价、封闭、环状双链,DNA分子,（Covalently closed Circular DNA,ccc DNA,）。,不是细菌生长所必需的,可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力,分子量在1-200kb之间,1、质粒的基本特性,（1）自主复制性,携带有自己的复制起始区（ori）,控制质粒拷贝数的基因,能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制,（2）不相容性,同一复制系统的不同质粒在同一细菌中,不能相容,不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存,（3）可扩增性,质粒就其复制方式而言分为两类,松弛型复制,严谨型复制,（4）可转移性,在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。,2、质粒载体的构建,（1）天然存在的两种质粒,A、colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb,松弛型,复制20-30/cell,B、pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb,严谨型,复制5copy/cell,（2）质粒载体人工构建的目的,天然质粒存在缺陷,不适合用作基因工程的载体,必须对之进行改造构建,方法:,重组,，“,拼拼接接，挖肉补疮,”,（a）,加入合适的选择标记基因,（b）,增加或减少合适的酶切位点,（c）,缩短长度,，,增加装载量,（d）,改变复制子,，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝,（e）根据基因工程的特殊要求,加装特殊的基因元件,3、质粒的制备,实验室一般使用两种方法制备质粒,（1）碱裂解法,（2）沸水浴法,2、感染周期,噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入：,（1）,吸附,（2）,DNA注入,（3）,DNA复制,（4）,包装,:,只能包装-DNA分子的75%-105%,即包装范围为36.4kb-50.9kb的DNA,（5）,裂解,五）cos质粒（cosmid）,1、cos质粒的构建,cos质粒,含有-DNA两端cos区的质粒,能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb 6kb）载体,组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的cos位点,