实验细胞-神经细胞.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验细胞-神经细胞,在神经生理、生化和神经药理的研究中、神经细胞的体外培养日益受到重视，因为它是研究单个神经细胞功能和结构的适宜方法。在体外培养条件下背根神经节、颈上交感节、胚胎脊髓和不同脑区(海马、下丘脑、大脑皮层、小脑和垂体细胞等)培养细胞的形态特征都不尽相同，这与它们具有不同功能有关。交感和感觉神经元以及不同脑区神经元的体外培养成功,为我们深入研究它们的结构和功能提供了合适的体外实验模型。,一、神经细胞培养,主要优点,:,1.,分散培养的神经细胞在体外生长成熟后，能保持结构和功能上的某些特点，而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系，这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。,2.,能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化，便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。,3.,易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件，观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。,4.,便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。,（,一）神经细胞的原代培养：,原代培养（,primary culture）,是指从活体上获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养。,（二）神经细胞系培养,大多数细胞经重复传代一定数量（一般为20-80代）将停止分裂，即开始进入衰老的过程。然而，也有某些细胞群可无限传代，并表现出相当稳定的表型，成为连续细胞系（,continuous cell line）。,在过去的30多年中，己经从神经系统肿瘤中克隆出许多细胞株，如神经母细胞瘤(,neurblastoma)、,神经胶质瘤（,glioma）、,嗜铬细胞瘤(,pheochromocytoma),等细胞株。,二、神经细胞的培养类型：,原代神经细胞培养的类型：,1鸡胚背根神经节组织块培养；,2新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养；,3新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养；,4胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养；,5新生大鼠海马神经元分散培养；,6新生大鼠隔神经元分散培养；,7新生大鼠下丘脑神经元分散培养；,8新生大鼠大脑皮层神经元分散培养；,9新生大鼠纹状体神经元培养；,10新生大鼠中脑黑质神经元培养；,11新生大鼠小脑神经神经元培养；,12新生大鼠脑腺垂体细胞培养；,13,神经胶质细胞培养,；,14,成年大鼠背根节神经元分散培养,；,15,海马脑片培养,；,16,新生大鼠海马神经干细胞培养,。,（一）神经胶质细胞培养,1雪旺细胞：,雪旺细胞是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞；它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。,材料和方法,雪旺细胞培养材料：各类哺乳动物的外周神经和背根神经节，孵化8-12,d,鸡胚、出生1-3,d,的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿。,无菌用解剖镊分离出神经节，剥除神经节被膜,用0.125%胰蛋白酶消化(37 30,min),后用培养液（90%,DMEM，10%,胎牛血清，2,mM,谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30,min,后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的35,mm,塑料培养皿中,种植密度为0.210,5,个细胞/,ml，,每皿2,ml,细胞悬液。,36、10%,CO,2,培养箱中培养。接种第3,d,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15,g/ml,和尿苷35,g/ml，,以进一步去除成纤维细胞,作用48小时后更换新鲜培养液，以后每周换液两次,每次更换一半新鲜饲养培养液。,雪旺细胞的生长和形态特征,培养15,d,后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双极梭状，核卵居中，相互平行排列，经,S-100,免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。,2星形胶质细胞,星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少。,星形胶质细胞分两类：,原浆性星形胶质细胞：突起短粗，分枝多。,纤维性星形胶质细胞：突起细长，分枝少。与少突胶质细胞源自同一前体细胞。,星形胶质细胞具有多种功能：,充填空隙，起结构的支持作用,突起构成血脑屏障,摄取和代谢某些神经递质如,-,氨基丁酸等,调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用，调节,K+,的水平而影响神经元的电生理活动；,能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌,IL、TNF、,和干扰素等多种细胞因子；,有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。,方法和结果：,选择出生 2,d,的,SD,大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37 30,min),后用培养液（90%,DMEM，10%,胎牛血清，2,mM,谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30,min,后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75,cm2,塑料培养瓶中,种植密度为110,5,个细胞/,cm,2,，,每瓶10,ml,细胞悬液置。置36、10%,CO2,培养箱中培养。每周换液2 次，培养10-14,h，,细胞分为两层，下一层为,I,型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是,O-2A,前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37摇床上振荡，16,h（180r/min）O-2A,前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75,mcm2,塑料培养瓶中，培养液使用20%胎牛血清促进,O-2A,前体细胞分化为,II,型胶质细胞即纤维型胶质细胞。可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。,纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体,（,GFAP）,染色确定。,（二）成年大鼠背根节神经元培养,材料和方法,取3-6 月龄的,SD,雄性大鼠。,无菌剪取一段脊髓，背侧朝上于灭菌毛玻璃片上，在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨，暴露脊髓和神经节，取出神经节。,置于含 1%胶元酶(,Collagenase),和1%消化酶(,Dispase),的2,ml,混合消化液中消化(37，1,h)。,分散后用种植(,Plating),培养液稀释成0.210,5,个细胞/,ml,密度的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35,mm,塑料培养皿中，每皿置2,ml,细胞悬液。,标本于36、10%,CO,2,培养箱中培养。24,h,后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(,Feeding),培养液培养。,接种第3天,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15,g/ml,和尿苷35,g/ml,作用48小时后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次，每次更换一半新鲜饲养培养液。,成年大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征,成年大鼠背根节神经元在含,NGF,的培养液中种植后4,h,细胞即开始贴附在胶元薄膜层上生长，背根节神经元的胞体一般为圆形，有时亦可见椭圆或梭形，体积较大,直径约8-14,m,左右，胞体周围呈现一圈光晕，神经元的细胞核大多偏于胞体一侧，核仁明显。接种后24,h，,部分贴壁存活神经元开始长出突起。培养2-3天后，神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络。随着培养时间的延长，神经突起网络变得更加稠密。神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗，神经元的胞体逐渐增大。成年大鼠背根节神经元可维持培养2周。,（三）,海马脑片培养,材料和方法,出生4-7,d,的,Wistar,大鼠,无菌取脑、分离出双侧海马，用双面刀片垂直于海马长轴将其切成厚约400,m,左右的脑薄片，接种于涂有小牛皮胶的35,mm,塑料培养皿中，每皿按切片顺序按,Z,字形接种10个脑片,置脑片于36湿盒内孵育2,h，,使脑片较牢固地贴附在胶原上，然后加入1.5,ml,饲养培养液，在36、含10%,CO2,的培养箱内培养。,接种第5,d，,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15,g/ml,和尿苷35,g/ml,或加入阿糖胞苷 3,g/ml,以抑制非神经细胞的过度增殖,作用48,h,后更换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换50%新鲜培养液。,海马脑片培养神经元的生长分化和形态特征,海马脑片种植后 24,h,，可见少数神经元和神经胶质细胞开绐从海马脑片的不同区域向外纤移生长，随着培养时间的延长，可见不同脑区越来越多的神经元和神经胶质细胞向外纤移生长，并形成密集的网络。当加入细胞分裂抑制剂抑制胶质细胞增殖后，可以获得较纯的不同脑区的培养神经元。,（四）新生大鼠海马神经干细胞培养,干细胞是指在一定时期具有自我更新能力和广泛发育潜能的细胞，神经干细胞的发现是近年来神经科学领域研究的重大突破，神经干细胞的研究成了近期研究的热点，不仅因为其具有研究神经系统发育的重要性，更主要的是其潜在的治疗价值；神经干细胞研究的主要难点是不能在体内将它们与其它细胞分开，故通常采用在体外培养一段时间后形成细胞克隆，分离出神经干细胞。体外培养可增殖，获得大量神经干细胞，这些细胞若能被诱导分化为某种特异神经元，用以代替损伤神经元，这将为神经再生和功能重建提供充足而理想的移植材料。,材料和方法,取当天出生的,Wistar,大鼠，在无菌条件下分离出双侧海马，用0.125%胰蛋白酶消化(36、30,min),分散后，用培养液（98%,DMEM,或,F12，1%,神经营养素，1%谷氨酰胺，,BFGF 20g/L，EGF 20g/L）,吹打分散制成细胞悬液，接种于75,cm2,塑料培养瓶中，种植密度为1105 个细胞/,cm2，,每瓶10,ml,细胞悬液。置36、10%,CO2,培养箱中培养。原代克隆形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，接种于75,cm2,塑料培养瓶中。此后每周机械分离克隆传代1次，方法同前。,新生大鼠海马神经干细胞的生长和形态特征,新生大鼠海马细胞在上述无血清培养基中培养 2,d,后，大部细胞死亡，部分细胞分裂形成，2-4个细胞的细胞团，随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，细胞团数目逐渐多。可用于进一步传代培养也可进行冷冻保存备用。,纯度鉴定可用,Nestin,染色确定。,NSE,GFAP,海马神经元原代培养10天 免疫组化鉴定,（五）海马神经元的无血清培养,无血清神经细胞培养研究越来越受到科学家们重视，主要原因：,（1）在进行神经细胞营养研究时，由于血清成份复杂且不稳定，妨碍对神经细胞营养要求的确切了解。,（2）在进行激素和药物研究时，血清成份与激素或药物结合的结果，干扰了其对神经细胞的作用。,（3）干扰对培养神经细胞释放产物的分析。,（4）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支原体。,因此，人们期望用不含血清的的培养液培养神经细胞。现将两种无血清培养海马神经细胞的方法介绍如下：,材料与方法：,取当天出生的,Wistar,大鼠，在无菌条件下分离出双侧海马。用0.125%胰蛋白酶消化(36、30,min),分散后，用种植培养液(79%,DMEM/F12，10%,马血清，10%胎牛血清，1%谷氨酰胺)，稀释成510,6,个细胞/,ml,密度的细胞液，接种于涂有小牛皮胶的35,mm,塑料培养皿中，每皿2,ml，,置标本于36、含10%,CO,2,的培养箱内培养。24,h,后顷去培养皿内种植培养液，改用无血清饲养培养液(98%,DMEM/F12，1%,神经营养素，1%谷氨酰胺)培养。接种第10,d，,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15,g/ml,和尿苷35,g/ml,或加入阿糖胞苷 3,g/ml,以抑制非神经细胞的增殖，作用48,h,后更换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换50%新鲜无血清培养液。,2新生大鼠海马神经元无血清培养时 的生长分化和形态特征,新生大鼠海马神经元种植后12,h，,大部分细胞可贴壁，呈圆形，其中少数神经细胞开始伸出1-2个突起。培养24,h,后，伸出突起的神经细胞逐渐增多,突起一般为20-40,m，,长者可达60,m。,改用无血清饲养培养液培养3,d,后,神经元突起进一步增多并延长，形成稀疏的网络。培养的海马细胞以锥体细胞为多见，胞体较大，直径6-12,m。,随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐增大，胞突主干和分技明显延长并增粗，形成更加稠密的网络。海马神经元在体外可维持无血清培养 1个月。,三、神经细胞培养的注意事项,1,NGF,是必不可少的营养因子,在背根节神经细胞培养过程中，早期感觉神经元发育阶段，,NGF,是必不可少的营养因子，但在培养后期，神经元已发育成熟，可能非神经细胞分泌的极少量,NGF,即能满足神经元生长需要，因此不另加,NGF,也能维持长期培养。,在上颈交感节细胞分散培养过程中，若最初1-2,d,在培养液中缺乏,NGF，,交感神经元突起不见生长，且大多死亡。培养15,d,或1个月时，如果培养液中未加入,NGF，,本来生长良好的神经元很快便出现颗粒变性或空泡，逐渐死亡。表明,NGF,对于促进神经突起生长和维持神经元生存有显著作用。,2 细胞接种密度,在神经细胞培养过程中，神经细胞的生长发育受到多种因素的影响，其中细胞接种密度对细胞生长发育影响较大，一般神经细胞的接种密度以0.5-1106 个细胞/,ml,密度为宜，如每毫升中超过310,6,个细胞/,ml,密度，将使细胞簇过大，而且培养皿内过分拥挤，影响存活和生长。但如果培养的细胞数目过少时，神经细胞的生长分化较差，因为神经细胞是一种细胞群体,它们相互之间具有营养和支持作用。其次是控制非神经元细胞过多增殖。,3,抗,DNA,药物加入培养液 抑制胶质细胞过渡增殖,原代分散单层培养是神经细胞与非神经细胞的混合培养。其中胶质细胞等可在体外继续增殖，神经元则不能增殖而只能生长分化。适量胶质细胞的存在是神经细胞长期培养的必要条件，如果神经胶质细胞过渡增殖时，神经细胞的生长分化便受到一定影响，常使神经细胞提早开始退化。,由于神经胶质细胞频繁分裂过程中，夺取了神经细胞生长中需要的某种营养成份。为保证神经元生长所需的营养，需在非神经细胞增殖的高峰即所谓“合流”时，将一定量的抗,DNA,药物加入培养液中以抑制其过渡增殖，实验证明，在培养第5,d,或第7,d,时用 5-氟-2-脱氧尿苷15,g/ml,和尿苷35,g/ml,或阿糖胞苷3,g/ml，,作用48,h,即停用可加快神经元的分化，延长培养时间。,4 培养液必须保持一定的等渗性,所配制的培养液必须保持一定的等渗性，溶解于培养基的物质浓度所产生的等渗性必须与细胞外液的液体一致，培养神经细胞可将培养液的渗透压调节到320-330,mOso,较为合适。如果培养液是高渗的，细胞会失去水份并发生皱缩，如果培养液是低渗的，细胞会吸收水分而膨胀。两者不利于神经细胞的存活和生长。,5 掌握换液的次数和数量,为了使神经细胞得到生长分化必须的营养，必须经常进行换液，但如果换液次数太多，并不利于神经细胞的生长分化，因为神经细胞在培养液中需要适当的环境，而且它本身也有创造良好环境的能力，如果频繁换液就会破环这种环境。一般每周换液二次，每次只换一半，保留一半原液。除此之外，培养液的,PH、,温度等均对神经元的生长发育有影响，因而在实验中必须加以注意。,复习题：,1 神经细胞培养的类型,2 神经细胞培养的注意事项,