本科生《P》4-第四章PCR3-8.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,聚合酶链式反应技术,The polymerase chain reaction,1,教学目的与要求：,1.,扩增,DNA,的技术原理和方法；,2.,熟悉,PCR,引物设计的原则和方法；,3.,掌握RT-PCR、Nested PCR、Inverse PCR的主要原理和方法；,4.掌握RADP、RFLP、AFLP等原理及应用；,5.了解PCR的应用。,第一节,聚合酶链式反应技术概念及其发明历史,2,聚合酶链式反应,（,Polymerase Chain Reaction,），简称,PCR。是指体外酶促合成特异DNA片段的一种基因定向扩增技术。由,高温,变性,、,低温退火（复性）,及,适温延伸,等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。,Dr.Kary B.Mullis,1944-,Kary Mullis,1985年发明PCR技术，1993年获诺贝尔奖。,最初是使用DNA聚合酶中的Klenow大片段，该酶不耐热。,1988年，Saiki在温泉中分离获得水生嗜热杆菌中的一种耐热酶Tag E，使PCR技术得到广泛应用。,Tag,Tag,5,3,3,5,5,3,3,5,3,5,3,5,Primer,Primer,4,8,16,32,Etc,2,n,Denature,Primer,Repeat cycle,anneal,extension,cycle,PCR的基本用途：（1）Clone specific gene sequences from organism，（2）Identify specific sequence，（3）Forensic and diagnostic procedures,.,三、The design of primers for PCR,1 GGATCC,atg,aactctgattctgagtgcccactttctcacgatggatactgccttcacg,61 atggagtttgcatgtacatcgaggctcttgataagtacgcttgcaactgcgttgttggat,121 acatcggagagagatgccagtacagagaccttaagtggtgggagcttagaggaccaggac,181 catctgagaaggacgagctttag,taa,GAATTC,Human Epidermal Growth Factor,HEGF,GGATCC,atg,aactctgat tctgag,tg,CCTAGGtacttgagactaagactcac,aaggacgagctttagtaaGAATTC,t tcc tgc tcgaaatcattCTTAAG,Primer 1(up primer),5-ggatcc,atg,aactctgat tctg-3,Primer 2(down primer),5-gaattgaatgatttcgagcagg-3,22 nt 10X4+12X2=64,22 nt 9X4+13X2=56,Primer length:2030nt,Primer G+C 4555%,G or C=4 A or T=2,3,5,3,5,primer1,primer2,第三节 扩展的PCR技术,More exotic PCR techniques,模板：1）基因组DNA；,2）mRNA序列；,3）克隆在某一载体上的基因,要求：待扩增的DNA片段是已知的，至少两末端约20bp的序列是已知。,第三节 扩展的PCR技术,More exotic PCR techniques,一、PCR使用mRNA为模板,反转录PCR(Reverse transcriptase PCR，competitor RT-PCR)亦称RNA PCR，是以mRNA反转录得到的cDNA为模板，以特定的引物直接进行的PCR扩增反应，获得所需基因。,条件：,Template:,mRNA cDNA,Primer:,oligo-(dT),primer 1;,primer2,Material:,dNTP,Polymerase:,RTase,Taq polymerase,图,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,逆转录PCR(RT-PCR),RT-PCR,RT-PCR,二、PCR使用DNA模板,1.Nested PCR（嵌套式PCR，巢式PCR）,两对引物：内部引物和外侧引物。先以外侧引物扩增后，再以扩增产物作模板以内侧引物扩增其中的部分片段。这种方法提高PCR灵敏度和扩增产物的特异性。,2.Inverse PCR （反式PCR）,RE 1,RE 1,RE 2,Primer 2,Primer 1,RE 2,RE 1,P1,P2,RE 1,Primer 2,Primer 1,扩增已知序列两侧的未知序列：,1）酶切DNA模板,2）使酶切后的线形DNA连接成环状,3）另一种酶消化，使DNA成线状，,4）以已知部分序列设计引物，PCR扩增未知序列。,3.不对称PCR(asymmetric PCR),引物浓度不相等，比例为50:1或100:1。在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。,不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。,产生的单链DNA主要用于DNA测序。,高浓度引物,低浓度引物,4.锚定PCR(anchored PCR),通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列,用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（Poly G）的尾巴，然后分别用多聚dC(Poly C)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚定引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制酶识别位点polydC)一起作PCR扩增,cDNA末端的快速扩增（,r,apid,a,mplification of,c,DNA,e,nd,RACE),(a)5RACE：,GSP3,设计引物，合成cDNA第一链,AAAAA.AAAA,n,Poly(A)尾,TTTTT.TTTT,5,AP,AAAAA.AAAA,n,TTTTT.TTTT,5,用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链,TTTTT.TTTT,5,-,-,-,TTTTT.TTTT,GSP1,AUAP,GSP2,(b)3RACE,特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增,5.长程PCR(long and accurated PCR,LA PCR),选用TaKaRa的LA,Taq,DNA聚合酶或Ex,Taq,DNA聚合酶。,具有35校对功能，可信度高。扩增长度长。,6.,Alu,PCR,Alu,序列是人类基因组中的高度重复序列，遍布于全基因组中，两个,Alu,序列间隔约4 kb。根据,Alu,序列的高度保守区域设计引物，扩增,Alu,重复序列间的未知区域的PCR称为,Alu,PCR。,设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,图1 第1、2、3组引物多重PCR电泳图 1：正常对照；2：DL2000 marker；310：检出的缺失型患者,杜氏/贝克型肌营养不良症,一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%,65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点,8.其他种类PCR概念,多重PCR(multiplex PCR):,指利用多对引物同时扩增模板上的多个靶序列，以确定待检测基因存在与否及数量。此法主要用于法医分析与遗传病基因诊断。,原位PCR:,指对组织细胞中特异DNA或RNA进行PCR扩增，然后直接检测或用原位杂交对扩增产物进行分析的一种方法。应用于病毒的检测、RNA转运等。,定量PCR:,又称差示PCR（differential PCR），即通过PCR扩增来定量扩增体系中的DNA或RNA的起始拷贝数量。目前是利用双链DNA特异结合的荧光探针或颜料等动态检测PCR双链DNA产物的增加。,免疫PCR（immuno-PCR):,是一种将抗原检测系统与PCR 偶联起来的抗原检测系统。做法是将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，最后用常规免疫学方法检测PCR产物。理论上可以检测出存在于样品中的单一抗原分子。,原位PCR(In Situ PCR),原位PCR,是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。,差示PCR,differential PCR,d-PCR,d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR，电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5端标记上放射性同位素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。,现在的PCR定量方法是,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量，即荧光定量PCR。,差示PCR,免疫PCR(Immuno PCR),免疫,PCR,是一种抗原检测系统，将一段已知序列的,DNA,片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。免疫,PCR,集,PCR,的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2 ng/L的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。,免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA)包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(ProteinA-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA)(Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。,第四节 Real-time PCR,一、实时定量PCR定义,实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量 PCR是目前确定样品中DNA(或 cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。,二、荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物，扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。,Extension,5,3,5,3,5,3,5,3,Extension Continued,Apply Excitation,Wavelength,5,3,5,3,5,5,Taq,Taq,3,5,3,Taq,Taq,5,5,Repeat,DNA binding dyes,BD,BD,BD,BD,BD,BD,BD,BD,BD,BD,l,l,l,l,l,Ct值（Ct value）and Real-Time Quantitative PCR Theory（Threshold Cycle）,一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：,荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。,在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。,Ct值（Ct value）and Real-Time Quantitative PCR Theory（Threshold Cycle）,荧光阈值,是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号标准偏差的 10 倍。,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为,CT,值。,三、Ct值与模板起始浓度的关系,模板起始浓度越高，Ct值越小。Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系。,如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达；,如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达；,绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,四、荧光定量PCR和常规PCR技术的区别,常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（,定量不准确,）；,荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法（,准确定量,）,。,五、实时荧光定量 PCR技术的应用,1 DNA或RNA的定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。,2 基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证,3 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。,第五节 RAPD and several other acronyms,RAPD（随机扩增多态性DNA）:,random amplification of polymorphic DNA,AP-PCR（任意引物PCR）:arbitrarily primed PCR,Single primer,genome-specific band,For genomic fingerprinting comparative analysis,第五节 RAPD and several other acronyms,一、RAPD技术,RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组DNA进行PCR检测，以检测多态性。,由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异。,The principle of RAPD（随机扩增多态性DNA）,若位点2处碱基发生改变，则：,RAPD技术缺点,RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。,二、The principle of RFLP（限制性片段长度多态性）,限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和 一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。,限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism),技术原理：检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可引起酶切位点变异的突变均可导致RFLP产生。,RFLP 技术的缺点：,对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性，内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制。,三、The principle of AFLP（扩增片段长度多态性）,AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。由于不同物种的基因组DNA 大小不同,基组DNA 经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA 进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA 指纹的有无来检出多态性。,1,三、The principle of AFLP（扩增片段长度多态性）,2,3,基因组经限制性酶酶切后产生限制性片段，使用特定的双链接头与酶切后的DNA片段连接作为反应模板，利用含有选择性碱基的引物对模板进行扩增,基因组DNA经限制性酶酶切产生限制性片段,含有相同酶切位点的接头,4,5,6,7,接头与酶切片段连接作为模板,含有选择性碱基的引物,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,四、微卫星SSR（simple sequence repeats）,微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在110bp之间，常见的微卫星如TGTGTG=(TG)n或AATAATAAT=(AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。,技术路线：,建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列，设计特异性引物来扩增SSR序列。后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。,微卫星的优点：,（1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。据估计，在基因组中，平均3050kb就存在一个微卫星，为在整个基因组中定位更多的基因提供了极大的方便。（2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子。（3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。通过GeneScan检测，一个位点的检测一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测。,检验PCR产物常用的电泳法，核酸杂交法：,(1)Run electrophoresis gel for confirmation of the length of the DNA sequence，（2)Blot and hybridization to identify specific regions of sequence.,The End,Thank You!,