淫羊藿苷干预关节软骨细胞对NF-κB信号通路表达的影响课件.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,立项依据：国内外研究现状及发展动态分析,骨关节炎,是一个世界性骨骼健康问题，严重影响老年人寿命和生活质量，,目前研究的重心主要基于分析蛋白酶对软骨细胞凋亡及软骨细胞外基质降解的作用方面。,其中对于淫羊藿苷,抑制软骨破坏，发挥软骨保护的作用,已被广泛认可。,立项依据：课题组相关研究概况,我科前期在江苏省中医药局科技项目及南京市医学科技发展项目的资助下我们就淫羊藿苷促成骨形成机制方面进行了相关的动物及蛋白组学方面的研究，并圆满结题。,我科近年来开始就淫羊藿苷对于软骨细胞保护的机理方面开展探索工作。,立项依据：前期研究及相关文献查阅,1.,在呼吸系统方面、心血管疾病方面，已有,大量试验发现淫羊藿苷可以抑制,NF-B,通路的活化，达到抑制炎性细胞因子表达的作用,1-2,2,.,在骨科疾病方面，,大量研究证实,NF-B,信号通路与,OA,形成与发展具有密切的联系。,NF-B,首先是由于细胞外刺激，通过细胞内的级联反应，最终导致软骨降解和关节损伤,3,3.,穿心莲内酯能够通过抑制,NF-B,信号通路的激活，显著地下调,IL-1,刺激人关节软骨细胞，降低,MMP-3/13,等多种炎性介质的表达,4,1,杜文静；补肾中药组分淫羊蕾昔对哮喘小鼠嗜酸粒细胞凋亡的影响,d;,复旦大学,;2011,年,2,CHEN SR,，,XU XZ,，,WANG YH,，,et al,Icariin Derivative Inhibits Inflammation through Suppression of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase and Nuclear Factor-B Pathways,J,Biol Pharm Bull,，,2010,，,33(8):1307-1313,3.,周庄，张柳等,NF-B,信号通路在骨性关节炎发生发展中作用机制的研究,J,中国骨质疏松杂志，,2012,，,18(1):78,82,4.Ding QH,JiXW,Cheng Y,et al.inhibition of matrux metalloprteinases and inducible nitric oxide synthase by andrographolide in human osteoarthritic chondrocytesJ.modRheumatol,2012 Dec 15.,假设,：,淫羊藿苷干预,软,骨细胞,的过程,中，,淫羊藿苷是否也可以通过抑制,NF-B,通路的活化,，抑制炎性细胞因子表达，从而达到保护软骨细胞作用？同时，,在抑制,NF-B,通路的活化后，是否对下游调控因子,uPA,系统产生影响,，而进一步达到抑制蛋白酶对软骨细胞外基质的降解，起到保护关节软骨的作用？,立项依据：,本课题科研假设,立项依据：,前期研究工作基础,我们,之前,在淫羊藿苷对大鼠成骨细胞蛋白质组学影响的研究中发现,10ng.ml,-1,浓度的,淫羊藿苷能快速促进,SD,大鼠成骨细胞的增殖和分化,7,。,7.,钱卫庆，尹宏，孙海涛。不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响,中国医药导报,2011,36:23-25,。,前期研究：,Icariin,干预,OB,后,细胞增殖,情况,研究方案：实验分组及干预,原代成骨细胞传代,24,小时后,分为,5,组,:,(1),空白组,:,10%IMDM,正常培养,;(2)PDTC,组：加入,0.5mmol/L,NF-B,阻滞剂,PDTC(3),淫羊藿低剂量组,:,加入,0.1mg/mL,淫羊藿苷,(4),淫羊藿中剂量组,:,加入,1mg/mL,淫羊藿苷,(5),淫羊藿高剂量组,:,加入,10/mL,淫羊藿苷,以每孔,1 10,6,个细胞的密度接种软骨细胞于,6,孔板，培养,2 h,后，除空白组外均以,IL,110 gL,1,刺激,1 h,研究方案：软骨细胞培养及鉴定,2,周龄新西兰白兔,3,只，处死，,75%,乙醇浸泡,;,剪取股骨头、膝关节、肩关节、肋骨以及剑突处软骨组织，,采用酶消化法原代培养兔软骨细胞。,型胶原免疫组化染色法兔对软骨细胞进行鉴定,研究方案：淫羊藿苷对,NF-B,信号通路表达的影响检测,采用,RT-PCR,法检测,MMp3/13,，,uPA,，,NF-B mRNA,含量,。,采用,Western blot,法检测,IB,（,NF-B,的抑制蛋白）,、,PAI,（,uPA,抑制物）、,uPAR,（,uPA,受体）蛋白,水平,凝胶阻滞分析实验检测,NF-B,与,DNA,的结合活性,。,研究方案：统计学处理,采用,SPSS 13.0,统计软件分析，各组数据以均数,标准差（,s,）表示，组间比较用,One-Way ANO-VA,方差分析，均数比较采用,S-N-K,检验，,P,0.05,为差异具有统计学意义。,研究方案：技术路线,兔软骨细胞的体外培养和细胞活性的鉴定,判断淫羊藿苷对软骨细胞损伤的保护与治疗,用,10 gL,1,的,IL,一,l,作用于关节软骨细胞,正常空白组,淫羊藿苷低剂量组,:,加入,0.1mg/mL,淫羊藿苷,淫羊藿苷中剂量组,:,加入,1mg/mL,淫羊藿苷,淫羊藿苷高剂量组,:,加入,10/mL,淫羊藿苷,real,一,timePCR,技术检测,MMp3/13 mRNA,、,uPA mRNA,、,NF-kb mRNA,PDTC,组（,NF-B,阻滞剂,）,Westen,检测磷酸化的,I-B,、,PAI,EMSA,检测,NF-B,与,DNA,的结合,本项目的特色与创新,1.,淫羊藿苷对骨关节炎软骨细胞,NF-KB,信号转导途径及其下游的调控因子,uPA,系统的影响，目前国内外尚未见报道。,2.,本科题首次在细胞分子水平上观察淫羊藿苷对白介素,IL,1(IL,1),诱导下兔软骨细胞,NF-KB,信号通路及,uPA,系统的影响，及何种浓度的淫羊藿苷的疗效最佳。,研究意义,:,1).,将淫羊藿苷作用于兔软骨细胞，观察,NF-KB,信号通路上蛋白的改变，,从而完成对淫羊藿苷作用靶点的研究，,这将为小分子中药有效成分，,尤其是植物补肾壮骨中药的,机理研究提供一种新的研究思路和技术手段。,从而进一步为利用淫羊藿苷,研制新的保护软骨药物打下基础。,前期研究：,近期发表与本项目有关的论著,1,）钱卫庆，尹宏，口服与骨折局部应用淫羊藿对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响,中国中西医结合杂志,2012,年第,06,期：,822-826,。,2).,尹宏，钱卫庆，磷酸钙骨水泥,-,淫羊藿复合材料促进骨质疏松大鼠骨折的愈合,中国组织工程研究,2012,年第,16,卷,29,期：,5389-5395,。,3).,尹宏，钱卫庆，淫羊藿对骨质疏松型骨折局部骨形成蛋白,mRNA,表达的影响,中国骨质疏松杂志,2012,年,18,第,8,期：,717-720,。,4).,钱卫庆，尹宏，孙海涛，不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响,中国医药导报,2011,年第,36,期：,23-25,。,5).,丁仁，尹宏，钱卫庆等，骨保护素在预测和治疗绝经后骨质疏松症中的应用,国际骨科学杂志,2011,年,1,月第,32,卷第,1,期：,53-55.,6),。孙海涛，尹宏，钱卫庆等，淫羊藿对体外培养成骨细胞影响的研究进展，,医学综述,2010,，,24,：,43-45,。,Thank You!,