牛结核病胶乳凝集方法的研究以及临床的初步应用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,汇报内容,一、文献背景及研究目的意义,二、研究思路与策略,三、试验方法、结果与讨论,四、小结与展望,五、研究成果,一、文献背景及研究目的意义,文献背景,结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病。据WHO估计全球约有20亿人感染，每年新病例达800-1000 万，约300万人死亡。,牛结核病被国际兽医局（OIE）定为B类动物传染病。历来是严重威胁奶业健康发展的重大传染病。,除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会取得成功。,The whole genetic sequence of,Mycobacterium,tuberculosis,M bovis,M bovis BCG,检测机体反应,体液免疫,细胞免疫,IFN-gamma assay,检测病原,DNA,蛋白,PCR,皮内变态反应,感染,免疫,新结核疫苗,细菌,培养,感染?免疫？,二、研究思路与策略,总体策略,胶乳凝集方法,ELISA,PCR,mpb70,pMD18-T,测序双酶切,pET-28a,E.coli BL21,转化,原核表达,MPB,70,EDC,羧化乳胶颗粒,制备0.5,的乳胶试剂,组装成,奶牛结,核病乳,胶凝集,抗体检,测试剂盒,研究思路与策略,技术路线,三、试验方法、结果与讨论,克隆牛型结核分枝杆菌,mpb70,表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70,建立牛结核病乳胶凝集抗体检测方法,临床样本检测,结果分析讨论,试验方法、结果与讨论,本论文中构建的重组载体,试验方法、结果与讨论,克隆牛型结核分枝杆菌,mpb70,用PCR方法克隆牛型结核分枝杆菌,mpb70,Items,Volume(L),模板,5,引物(10pM),2,dNTP(2.5mM),2,10,Taq buffer(含Mg,2+,),5,双蒸水,36,Taq polymerase,0.5,总共,50,试验方法、结果与讨论,表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70,把PCR方法克隆的,mpb70,片段连接到pMD18-T，构建重组质粒，转化DH5；小提质粒酶切回收,mpb70,片段并连接到pET-28a，构建重组质粒，然后转化到BL21中，诱导表达MPB70,试验方法、结果与讨论,胶乳颗粒偶联蛋白模式图,羧化乳胶微球颗粒Carboxyl(COOH)microparticles羧基基团通过水溶性碳化二亚胺,（EDC）活化后，再与蛋白质上的氨基基团结合。,建立乳胶凝集抗体检测方法,最佳偶联MPB70蛋白量的确定,在4mL浓度为0.25的羧化胶乳中，分别加入不同量的MPB70，从10g、20g、30g、50g递增至150g，在硼酸缓冲液中室温作用6h后收集上清，经UV120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，,The best quantity of linked MPB70 protein,建立乳胶凝集抗体检测方法,最佳偶联时间的选择,在1mL浓度为1的羧化胶乳中，加入150g MPB70，改变致敏时间，于0.5、1、2、4、6、8、10和12h进行致敏,致敏后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量。,建立乳胶凝集抗体检测方法,最佳胶乳浓度的确定,确定上述条件的基础上，在4mL浓度为0.25的羧化胶乳中，加入150g MPB70蛋白，改变胶乳最终致敏浓度，使胶乳微球的终浓度分别为2，1，0.5，0.25和0.125，在室温作用6h后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量,试验方法、结果与讨论,乳胶凝集方法条件优化的结果,确立乳胶致敏MPB70的一系列最佳反应条件：乳胶最终浓度0.5%；EDC与乳胶最佳反应时间为3h；MPB70的最佳致敏量为0.1mg/ml乳胶；MPB70最佳反应时间为6h；以及一系列的缓冲液的离子浓度和pH值等。,建立乳胶凝集抗体检测方法,偶联反应终止剂,抗原与乳胶微球过度偶联会导致抗原失活，从而降低抗原-微球基质与抗体结合的能力。所以需要在反应体系中引入其它氨基基团以终止偶联反应。常用的终止剂为乙醇胺和甘氨酸。经试验验证乙醇胺的终止效果要好于甘氨酸，故选用乙醇胺作为终止剂，所用的浓度0.1M，剂量为1mL浓度为1的羧化乳胶中加入50L，终止时间为15min。,建立乳胶凝集抗体检测方法,封闭剂的选择,乳胶微球上未结合抗原的位点需要用封闭剂封闭以防止出现非特异性反应，但同时过度的封闭会降低乳胶试剂的敏感性。所以需要优化合适的封闭条件。在实验中，发现用BSA封闭后乳胶试剂的敏感性会有所降低，而当不用封闭剂封闭时，并没有出现非特异性反应，所以，制备乳胶试剂时不进行封闭。,建立乳胶凝集抗体检测方法,LAT的特异性和敏感性试验,批内重复实验结果,批间重复实验结果,建立乳胶凝集抗体检测方法,重复性试验,同样方法处理乳胶5批，每批5个重复；,批内：从5批中抽3批，每批中抽取3个，做批内比较；,批间：从5批中抽3批，每批中抽取3个，做批间比较；,结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本胶乳凝集方法的批内和批间重复性良好。,建立乳胶凝集抗体检测方法,临床样本检测,对武汉市奶牛场A临床检测的70头奶牛中，TST、MPB70-LAT、IHA及Serum-ELISA的分别检出阳性牛44、32、34、42；,对武汉市奶牛场B临床检测的61头奶牛中，TST、MPB70-LAT、Milk-ELISA及Serum-ELISA的分别检出阳性牛44、47、52、42,；,几种检测方法的检出率和符合率见下表：,建立乳胶凝集抗体检测方法,武汉市牛场70份临床样本检测结果,建立乳胶凝集抗体检测方法,武汉市B牛场61份临床样本检测结果,四、小结与展望,MPB70是一种牛分枝杆菌特异性分泌蛋白质，其分泌量占牛分枝杆菌培养基蛋白总量10%；,MPB70在大肠杆菌中可以高效率的表达，且具有天然的热稳定性，为诊断方法的建立及诊断试剂的保存提供了有力条件；,以羧化的聚苯乙烯乳胶为载体，采用了共价偶联，双功能试剂，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。,五、小结与展望,通过临床检测结果，与国际金标准,TST,的比较，说明,MPB70,蛋白乳胶凝集方法符合特异快速敏感检测方法的标准。与皮内变态反应联合应用可以为我国的牛结核病检疫防控提供有效的工具。,基于以上临床试验和分析讨论，可见本方法的优点，有望开发成诊断试剂盒，在临床上广泛推广应用。本实验室已经递交了新兽药证书申请材料，临床试验已获审批，且正在进行。,研究成果,在读期间发表文章,钦博，胡巧云，喻正军，晁彦杰，张桂荣等.牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用，中国预防兽医学报,胡巧云，钦博，张桂荣等.结核分枝杆菌CFP10蛋白基因的原核表达及在免疫诊断上的初步运用，全国结核病分子生物学与免疫学研究及应用研讨会，湖南，张家界，2005.09,张桂荣，陈颖钰，钦博等.牛结核菌素ELISA方法用于诊断奶牛结核病的研究，中国畜牧兽医学会家畜传染病分会第十一次学术会议，四川，雅安，2005.09,Zhengjun yu,Meiling Jin,Xiaojuan Xu,Ruihua Zhang,Hongbo Zhou,Qiaoyun Hu,Haiya Wu,Bo Qin,Yadi Tan,Huanchun Chen.Development of a specific Latex Agglutination Test based on recombinant HA proteins for detecting antibodies to H5 avian influenza viruses,Avian Disease.,本论文是在指导老师谭亚娣副教授，郭爱珍教授和导师陈焕春院士的悉心指导下完成的。他们渊博的学术理论、宽广的待人胸怀、严谨治学的科学态度、孜孜不倦的工作热情是我一生学习的榜样。在此，向谭亚娣副教授，郭爱珍教授和陈焕春院士致以最崇高的敬意和诚挚的谢意。,在实验期间，我得到了金梅林、吴斌、方六荣、周锐、曹胜波、吴美洲、等老师在学习和实验技术上的关心和帮助，在此深表谢意。,特别感谢喻正军同学，同时也感谢陈剑峰、张安定、但汉并、马燕、郭洪、郭红燕等同学在实验和生活中给予我的支持和帮助。,感谢张桂容、李川、胡巧云、吴波、张书环、曹莎、晁彦杰、陈颖玉、陈鑫、朱堂明等给予的大量帮助。,最后还要感谢我的家人，是他们的无微不至的关怀和无私的爱心给予了我今天的一切。,致 谢,Thank you!,