蛋白质共价结构-生物化学.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质共价结构-生物化学,蛋白质共价结构内容提要,重点：,肽的结构和性质,掌握：,肽段中氨基酸序列的测定方法,了解：,肽和蛋白质的人工合成,4-1,蛋白质通论,蛋白质概念,蛋白质的化学组成,蛋白质的分类,蛋白质的大小和分子量,蛋白质的构象,蛋白质功能的多样性,蛋白质氨基酸顺序的遗传编码,一、蛋白质概念,蛋白质是由,20,种,a-,氨基酸通过肽键组成的高分子有机物,.,二、蛋白质的化学组成,蛋白质由,C,、,H,、,O,、,N,四种元素组成，多数含有,S,，有的含有微量铁、铜、锌、碘和磷等元素。,各种蛋白质的含氮量都接近于,16,蛋白质含量,=,蛋白氮,6.25,6.25,为蛋白质系数，即,1,克氮所代表的蛋白质量（克数）,凯氏（,Kjedahl,）定氮法测定蛋白质含量的基础。,碳,50,-55%,氢,6.5-7.3,氧,19-24,氮,16%,硫,0-3,其他 微 量,三、蛋白质的分类,蛋白质分子形状：,球状蛋白质：,globular protein,对称性好，溶解度高，能结晶，多数蛋白质属于此类；,纤维状蛋白质：,fibrous protein,对称性差，分为：可溶性纤维状蛋白质（肌球蛋白）；,不溶性纤维状蛋白质（胶原蛋白、丝心蛋白等）。,蛋白质分子组成：,简单蛋白质：,(simple protein),完全由氨基酸构成，如胰岛素；,结合蛋白质：,(conjugated protein),由蛋白质和辅基组成，如血红蛋白等。,生物功能：,酶、结构蛋白、防御蛋白等。,四、蛋白质的大小和分子量,分子量变化范围,从大约,6,000,到,1,000,000,道尔顿,(dation),或更大。蛋白质分子量的上下限是人为规定的。在表示蛋白质分子量时应说明测定方法,(,层析、电泳、质谱）。,有些寡聚蛋白质的分子量高达数百万甚至数千万，例如烟草花叶病毒（,TMV,），“分子量”约,410,7,。,大家应该也有点累了，稍作休息,大家有疑问的，可以询问和交流,8,五、蛋白质的构象,肽链形成的蛋白质的特有的空间结构即为蛋白质的构象。,如蛋白质二级结构：,a-,螺旋、,-,折叠等。,六、蛋白质功能的多样性,作为有机体新陈代谢的催化剂（酶）。,生物体的结构成分,(,胶元蛋白,),。,贮藏功能（作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。）,运输功能（血红蛋白）。,运动功能（肌动蛋白和肌球蛋白）,调节功能（激素）,参与高等动物的免疫反应（抗体和免疫蛋白）。,控制或调节遗传物质核酸的作用（组蛋白）。,七、蛋白质氨基酸顺序的遗传编码,三个连续的碱基顺序为一个密码单位即密码子或密码三联体，每个三联体代表一个氨基酸。,每条多肽链的氨基酸顺序由,RNA,的碱基顺序决定，而,RNA,的碱基顺序决定于,DNA,，因此一条多肽链的氨基酸顺序最终由,DNA,分子中的一段碱基顺序所决定。,4-2,蛋白质的共价结构,-,肽（,peptide,）,一、蛋白质的一级结构,二、肽键的性质,三、肽平面,四、肽链的方向性,五、天然存在的活性肽,A,链,B,链,A,链,21,个,aa,残基,B,链,30,个,aa,残基,一个链内二硫键,两个链间二硫键,分子量,5700,一、蛋白质的一级结构,1969,年，国际纯化学与应用化学委员会（,IUPAC,）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中,AA,的排列顺序，包括二硫键的位置。,多肽链即为蛋白质一级结构的主体。,-NCCNCC-,寡肽：由,2-10,个氨基酸组成的肽,。,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,二、肽键（,peptide bond,）,-C-N-,比大多数,C-N,键短，具有部分双键性质，不能自由旋转。,-C-N-,键上的,H,和,O,原子是反式的。,组成肽键的原子处于同一平面。,0.127nm,键长,=0.132nm,0.148nm,三、肽平面,-,CO-NH-,中的四个原子和与它相邻的两个,Ca,在一个平面上。,四、肽链的方向性,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序,通常在多肽链的一端含有一个游离的,-,氨基，称为氨基端或,N-,端；在另一端含有一个游离的,-,羧基，称为羧基端或,C-,端。,氨基酸的顺序是从,N-,端的氨基酸残基开始，以,C-,端氨基酸残基为终点的排列顺序。如果,C-,端有,NH2,，说明,C-,端酰化,五、天然存在的活性肽（,active peptide,）,生物体内以游离态存在的分子量较小的多肽，,这类多肽通常都具有特殊的生理功能。,如催产素、加压素、谷胱甘肽、,脑啡肽、激素类多肽、抗菌肽、蛇毒多肽等。,谷胱甘肽,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,CH,2,CH,2,CHNH,2,COOH,CH,2,SH,谷胱甘肽,存在与动、植物及,微生物中：,1.,参与体内氧化还原反应,2.,作为辅酶参与氧化还原反应,保护巯基酶或含,Cys,的蛋白质中,SH,的还原性，防止氧化物积累,4-3,蛋白质一级结构的测定,蛋白质的一级结构,(Primary structure),包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。,其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从,1953,年,F.Sanger,测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,一、,测定蛋白质的一级结构的要求,样品必需纯（,97%,以上）；,知道蛋白质的分子量；,知道蛋白质由几个亚基组成；,测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。,测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,蛋白质一级结构测定的基本策略,1,、,测定蛋白质中多肽链的数目；,2,、拆分蛋白质分子的多肽链，分离纯化各肽链；,3,、拆开多肽链内的二硫键；,4,、分析各肽链的氨基酸组成；,5,、鉴定多肽链的氨基末端残基和羧基末端残基；,6,、用两种不同的裂解方式裂解多肽链成较小的片段；,7,、测定各片段的氨基酸顺序；,8,、用片段重叠法重建完整多肽链的一级结构；,9,、确定二硫键的形成方式。,测定蛋白质分子中多肽链的数目,通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,多肽链的拆分,由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用,8,mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,二硫键的断裂,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用,8,mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，,用过量的,-,巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂,（,ICH,2,COOH,）,保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,巯基（,-SH,）的保护,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用,8,mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,4,、氨基酸组成的测定,酸水解是主要水解方法，同时辅以碱水解。,一般用,6mol,L HCl,于,110,o,C,在真空充氮的安玻瓶内进行水解，时间,10,24,小时。,所得氨基酸不消旋，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。,酰胺基：总量可由水解液中的氮量算出,色氨酸：可用碱水解蛋白质，能定量回收色氨酸。,蛋白质中氨基酸组成表示方法：,每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示,每,100,克蛋白质中含氨基酸的克数表示。,N-,末端分析方法,多肽链端基氨基酸分为两类：,N-,端氨基酸,(amino-terminal),和,C-,端氨基酸。,在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是,N-,端氨基酸分析法。,（,1,）二硝基氟苯（,DNFB,）法,（,2,）丹磺酰氯（,DNS,）法,（,3,）苯异硫氰酸酯（,PTC,）法,（,4,）氨肽酶法,（,1,）二硝基氟苯（,DNFB,）法,Sanger,法。,2,4-,二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链,N-,端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（,DNP,）。,在酸性条件下水解，得到黄色,DNP-,氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的,DNP-,氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,（,2,）丹磺酰氯（,DNS,）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与,N-,端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰,-,氨基酸。,此法的优点是丹磺酰,-,氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到,1,10,-9,mol,。灵敏度比,DNFB,法高,100,倍,水解后的,DNS-,氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。,（,3,）苯异硫氰酸酯（,PTC,）法,多肽或蛋白质的末端氨基能与,PITC,作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（,PTC-,多肽或蛋白质），它们在酸性有机溶剂中加热时，,N,末端的,PTC-,氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱离。,脱去,N,末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。,重复反应可以用来测定氨基酸顺序。,（,4,）氨肽酶法,氨肽酶是一类肽链外切酶，它能从多肽链的,N,端逐个地切下氨基酸。,根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的,N,末端残基顺序。,最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,C,末端测定的方法,肼解法；还原法；羧肽酶法,（,1,）肼解法,是目前测定,C,末端残基最重要的化学方法。,多肽与肼在无水条件下加热，,C-,端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。,肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与,C-,端氨基酸分离。,（,2,）还原法,肽链,C,末端氨基酸也可用硼氢化鋰还原成相应的,a-,氨基醇。,肽链完全水解后，代表原来,C,末端的,a-,氨基醇，可用层析法加以鉴别。,（,3,）羧肽酶法,羧肽酶是一种肽外切酶，它能从多肽链,C-端逐个水解。根据不同的反应时间测酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。,目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。,羧肽酶A能水解除,Pro,Arg,和,Lys,以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解,Arg,和,Lys,为C-末端残基的肽键。,多肽链的部分断裂和肽段的分离,可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,酶解法（常用的都是内切酶）,A,、胰蛋白酶；,B,、糜蛋白酶；,C,、嗜热菌蛋白酶；,D,、胃蛋白酶,化学裂解法：,A,、溴化氰；,B,、羟氨,肽段的分离提纯,多肽链断裂法：酶解法和化学法,胰蛋白酶,T,rypsinase,要减少胰蛋白酶的作用位点：,可通过化学修饰将其侧链基团保护起来。,Lys,：马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护,-NH,2,，则不被水解；,Arg,：用,1,，,2-,环己二酮修饰胍基，则不被水解。,增加胰蛋白酶的断裂点：,用氮丙啶处理，则,Cys,残基侧链被修饰成类似,Lys,的侧链，也具有,-NH,2,，胰蛋白酶就能断裂,Cys,羧基侧的肽键。,-HN-CH-CO-NH-CH-CO-,R1,R2,B,、糜蛋白酶,C,hymotrypsin,R,1,=Phe,Trp,Tyr,时水解快,;,R,1,=Leu,，,Met,和,His,水解稍慢。,R,2,=Pro,水解受抑制,要求：溶液,pH8,9,-HN-CH-CO-NH-CH-CO-,R1,R2,嗜热菌蛋白酶,thermolysin,R,2,=Phe,Trp,Tyr;Leu,，,Ile,Met,以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,R,2,=Pro,或,Gly,水解受抑制。,R,1,或,R,3,=Pro,水解受抑制。,-HN-CH-CO-NH-CH-CO-,R1,R2,胃蛋白酶,P,epsin,R,1,和,R,2,Phe,Trp,Tyr;Leu,以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。如,Phe,Phe,。,R,1,=Pro,水解受抑。,要求：,pH2,由于二硫键在酸性条件稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。,-HN-CH-CO-NH-CH-CO-,R1,R2,溴化氰,只断裂由甲硫氨酸残基的羧基形成的肽键。,蛋白质甲硫氨酸含量很少，因此,CNBr,裂解产生的肽段不多,水解产生的肽段可用胰蛋白酶处理成更小的肽段。,羟氨,专一性裂解,Asn-Gly-,之间的肽键，专一性不强,部分裂解,Asn-Leu,及,Asn-Ala,键,由于各种蛋白质中,Asn,Gly,键出现的几率很低，所以水解得到的肽段都很大,用于分子量大的蛋白质的测序。,肽段的分离提纯,肽段混合物常用以下方法进行分离提纯：,凝胶过滤,凝胶电泳,离子交换纤维素,离子交换葡聚糖柱层析,高效液相色谱（,HPLC,）,高效薄层层析,肽段氨基酸顺序的测定,主要使用,Edman,化学降解法，还有酶解法、酶解,-,肽谱重叠法及气谱,-,质谱联用法等。,Edman,化学降解法（,PITC,法）：,P.Edman,于,1950,年首先提出来的。,最初用于,N,末端残基分析。,降解试剂：苯异硫氰酸酯（,PITC,），能够不断重复循环，将肽链,N-,端氨基酸残基逐一进行解离。,Edman,化学降解法（,PITC,法,）,PTH-,氨基酸非常稳定，在紫外区有强吸收，最大吸收值在,268nm,处。,PTH-,氨基酸可用各种层析技术分离。,多肽链中肽段次序的决定,（,1,）确定多肽链,C,端和,N,端氨基酸残基,（,2,）需要两套成几套不同方法断裂得到的肽段,（,3,）借助两套肽段中的重叠肽确定肽段在多肽链中的位置。,A,法水解得到四个小肽：,A1 Ala-Phe,A2 Gly-Lys-Asn-Tyr,A3 Arg-Tyr,A4 His-Val,B,法水解得到四个小肽：,B1 Ala-Phe-Gly-Lys,B2 Asn-Tyr-Arg,B3 Tyr-His-Val,二硫键位置确定,一般采用胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白质。,水解专一性比较低，切点多，生成含有二硫桥的肽段小，易分离、鉴定；,作用,pH,在酸性范围（,2,），可防止二硫键发生交换反应。,水解得到的肽段混合物可用,Brown,及,Hartlny,对角线电泳技术分离。,+,-,+,-,第二向,第一向,a,b,Brown,和,Hartlay,对角线电泳图解,pH6.5,图中,a,、,b,两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段,二硫键位置确定,4-4,多肽与蛋白质的人工合成,一、多肽的人工合成有两种类型：,1,、由不同氨基酸按一定顺序控制合成,2,、由一种或两种氨基酸聚合或共聚合,二、接肽反应的保护基：,氨基保护基：,苄氧甲酰基（最常用）、三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，它们可用,HBr,CH,3,COOH,在室温下除去。,羧基保护基：,一般以盐或酯的形式保护。,三、羧基、氨基活化：,羧基的活化：,叠氮法、混合酸酐法和活化酯法，酰氯法,氨基的活化：,通常是在接肽时加入有机碱，保证氨基处于自由肽。,