农杆菌转化原理及技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,大家好,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,大家好,*,1,大家好,几种常用植物基因转化方法的比较,2,大家好,农杆菌介导法的优点,操作简便,外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝,转移,DNA,片段明确,可转移大片段,DNA,可直接用不同的植物组织进行基因转移,3,大家好,农杆菌介导遗传转化的原理,4,大家好,农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌（导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤，冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。,根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒（,Ti,质粒）。,根癌农杆菌的,Ti,质粒包括毒性区（,Vir,区）、结合区（,Con,区）、复制起始区（,Ori,区）和,T-DNA,区四个部分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是,Vir,区和,T-DNA,区。,5,大家好,T-DNA,区左右边界各有,25bp,的重复序列，其中,14bp,是核心，分,10bp,（,CAGGAATATAT),和,4bp,（,GTAA),不连续的两组，是完全保守的。,Vir,区为,30Kb,由,VirA,、,VirB,、,VirC,、,VirD,、,VirG,、,VirH,等七个操纵子共,24,个基因起共调控作用。,6,大家好,Ti,质粒结构示意图,7,大家好,农杆菌侵染过程,损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号,;,这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化,virA,和,virG,基因,再诱导,Vir,区的其他基因,;,Vir,基因的活化,作用于,T-DNA,的加工及,T-DNA,的转移,;,T-DNA,进入植物细胞后整合到核,DNA,上,;,T-DNA,在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素,;,农杆菌,Ti,质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因,(ocs),该基因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟一的碳源和氮源,;,冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活,tra,基因有利于,Ti,质粒的接合转移,扩大侵染范围,8,大家好,根癌农杆菌通过基因转化把,T-DNA,上的基因导入植物细胞并整合到核,DNA,上。,9,大家好,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,Biology of A.tumefaciens,Well known to induce crown gall tumor,A.tumefaciens lives around,root surfaces(in,rhizosphere),where it using nutrients,that leak from the root tissues,infects only through wound sites,and actively chemotactic to them,Plant wound produces,acetosyringone,Bacterial T-plasmid produces,receptors for acetosyringone,11,大家好,Produce callus,transform callus stimulate shooting by cytokinin addition,+cytokinin,This procedure is easy,for dicotyledone plants,(legumes etc),12,大家好,13,大家好,农杆菌介导转化水稻的方法,14,大家好,水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程,愈伤诱导,共培养,抗性愈伤的筛选与,再生成完整植株,整个操作过程约需,8,天,第一天（预培养）,第三天（划菌）,第五天（侵染、共培养,),第八天（脱菌、筛选）,NB,培养基为基本培养基加入相应植物生长调节剂,技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继代次数不超过,8,代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（,2-3,次筛选）；迅速分化再生。,一、培养基,基本培养基为,NB,培养基，愈伤诱导、转化及分化等培养基配方如下：,1.,诱导培养基：,NB+2,4-D2 mgL,-1,；,pH 5.8-5.9,。,2.,预培养培养基：,NB+2,4-D2 mgL,-1,；,pH 5.8-5.9,。,3.,共培养培养基：,NB+2,4-D2 mgL,-1,+AS100 ML,-1,；,pH 5.2,。,4.,选择培养基,：,NB+2,4-D 2mgL,-1,+,羧苄青霉素,250mgL,-1,+Hyg 30-50 mgL,-1,，,pH 5.8-5.9,。,5.,分化培养基：,NB+KT10mgL,-1,+NAA0.4 mgL,-1,；,pH 5.8-5.9,。,6.,生根培养基：,1/2MS,；,pH 5.8-5.9,。,16,大家好,二、胚性愈伤组织的诱导及继代,取水稻授粉后,15-20d,的未成熟穗，将未成熟种子剥壳，用,75%,乙醇浸泡,1min,，再转入,25,的次氯酸钠溶液中振荡灭菌,25min,，于超净工作台中无菌水冲洗,3-5,次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导培养基中，每皿约,30,粒，于,28,暗培养,7d,，切除胚根，继续培养,7d,，待愈伤长大后进行继代培养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化。,17,大家好,胚性愈伤,18,大家好,三、农杆菌介导转化水稻,1.,愈伤组织的预培养,选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为,2-3mm,的颗粒状愈伤，转接到预培养培养基中，置于,27,暗培养,4,天。,19,大家好,2.,农杆菌的培养及处理,从低温（,-85,）冻存管中刮取少量菌液于附加,Kan50 mgL,-1,和,Rif50 mgL,-1,YEB,固体培养基划线，然后在,28,暗培养,3672h,进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，,28,培养两天后，用适量添加有,100ML,-1,乙酰丁香酮（,AS,）的,AAM,培养基将菌洗脱，悬浮于添加有,100ML,-1,乙酰丁香酮,20 ml AAM,培养基中，剧烈摇动,1min,后，调整菌液浓度至,OD,600nm,=1.52.0,，静置,1h,，以便让农杆菌形成悬浮液。,20,大家好,3.,共培养,取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置,30min,，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，,25,暗培养,3d,。,21,大家好,4.,洗除农杆菌,挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗,3-5,次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含,250 mgL,-1,羧苄青霉素的无菌水静置,1h,，然后置于无菌滤纸上晾干。,22,大家好,5.,愈伤组织的筛选,将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转接,1,次。,抗性愈伤,非抗性愈伤,23,大家好,6.,抗性愈伤组织的继代与植株的再生,每两周将愈伤转移至新选择培养基上，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培养基上。,2,周后愈伤开始转绿，,3,周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养瓶,1,个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。,24,大家好,抗性愈伤的分化 抗性苗的生根,25,大家好,转基因植株田间种植,26,大家好,转化率、分化率和共转化率的计算,抗性愈伤获得率（,%,）,=,抗性克隆数,/,转化克隆数,100%,绿苗率（,%,）,=,再生克隆数,/,抗性克隆数,100%,27,大家好,Thank you!,28,大家好,谢谢,29,大家好,