线粒体病的分子生物学检验技术课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十五章,线粒体病的分子生物学检验技术,“,千手观音,”,21,位聋哑演员中,18,人有药物史,部分患者使用正常剂量也会致聋,“,一针致聋,”,现象,线粒体基因突变（,A1555G,）,+,环境（使用氨基糖苷类）,线粒体（,Mitochondrion,）,3,1.,真核细胞中的细胞器，,二分裂方式进行新陈代谢,，平均寿命,10,天,2.,多数细胞含几个到几千个线粒体,3.,每个线粒体含,2-10,线粒体,DNA,（,mtDNA,）,线粒体的主要功能,1,、参与人体很多重要的,生物化学过程,（三羧酸循环、脂肪酸,氧化、氨基酸分解代谢、血红素合成和部分尿素合成过程,）被称为,“,细胞的能量工厂,”,2,、线粒体体积大小，数量增减反应,器官功能负荷的变化,。,第一节,线粒体基因组及其表达系统,第一节 线粒体基因组与线粒体病,人体细胞中的线粒体,DNA,具有自主的,DNA,复制、转录功能，为非孟德尔遗传方式，故称为,25,号染色体。,25,号染色体,7,（一）人类线粒体基因组,1,、基因组小,16569 bp,2,、双链环状,DNA,外环富含鸟嘌呤称为,重链,，,内环富含胞嘧啶称,轻链,3,、,1,）编码区,13,结构基因,/mRNA,22 tRNA,基因,2 rRNA,基因,2,）,非编码区,D-loop,（,约,1120bp,）,L,链,复制起始区,（,约30,50bp,，,tRNA,Asn,-tRNA,Cys,）,一、,线粒体基因组及其表达系统,1,、结构基因,7,个,为,NADH-CoQ,还原酶复合体,（,复合体,）的亚基（,ND1,、,ND2,、,ND3,、,ND4L,、,ND4,、,ND5,和,ND6,）,1,个,编码的结构蛋白质为,CoQH2-,细胞色素,c,还原酶复合体,（,复合体,）中细胞色素,b,的亚基,3,个,为,构成细胞色素,c,氧化酶（,COX,）复合体,（,复合体,）催化活性中心的亚单位（,COX,、,COX,和,COX,）,2,个,为,ATP,合酶复合体,（,复合体,）,F0,部分的,2,个亚基（,A6,和,A8,）,1,、结构基因,2,、,tRNA,基因,22,个,tRNA,基因,可转录,20,种,tRNA,满足线粒体内蛋,白质翻译的需要。,tRNA,Leu,tRNA,Ser,都有,2,个基因外，,其余,18,种均只有,1,个基因。,3,、,rRNA,基因,1,、,mtRNA,编码两种,rRNA,即,12SrRNA16SrRNA,2,、位于,H,链,tRNA,Phe,tRNA,Leu,之间以,tRNA,Val,相隔,3,、变异常发生在二级结构茎环上。,4,、非编码区,D-loop,（,约,1120bp,）,位于,tRNAPro,和,tRNAPhe,基因之间，约,1120bp,是,mtDNA,中变异最多的区域，参与并调控,mtDNA,的复制和转录。,L,链,复制起始区,（,约30,50bp,，,tRNAAsn-tRNACys,可折叠成茎环结构。,（二）线粒体基因表达系统及特点,1,、密码子,1979,年，,Barrell,报道了人线粒体,DNA,所用的遗传密码。,通用遗传密码和线粒体遗传密码的差异,密码子,线粒体,DNA,编码,核,DNA,编码,UGA,色氨酸,终止,AUA,起始,异亮氨酸,AGG,终止,精氨酸,（二）线粒体基因表达系统及特点,2,、,mtDNA,复制特点,D,环复制为主要模式，重链以逆时针方向复制，轻链以顺时针方向复制。,nDNA,只在细胞分裂时复制，,mtDNA,一直处于分裂状态，并由,nDNA,编码的调控因子控制。,mtDNA,复制特点,mtDNA,可进行半保留复制，其,H,链复制的起始点（,OH,）与,L,链复制起始点（,OL,）相隔,2/3,个,mtDNA,。复制起始于,L,链的转录启动子，首先以,L,链为模板合成一段,RNA,作为,H,链复制的引物，在,DNA,聚合酶作用下，复制一条互补的,H,链，取代亲代,H,链与,L,链互补。被置换的亲代,H,链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或,D,环，故此种,DNA,复制方式称,D-,环复制。,（二）线粒体基因表达系统及特点,3,、,mtDNA,转录的特点,对称性转录，重链启动子启动重链顺时针方向转录，轻链启动子启动轻链逆时针方向转录。,成熟的,mRNA,只在,3,末端加,polyA,尾巴，,5,末端不修饰帽子结构,（二）线粒体基因表达系统及特点,4,、线粒体蛋白质的合成特点,自主编码合成,13,个多肽，其余功能所需蛋白均由核基因组编码，与细菌合成蛋白质体系十分相似。,“,共生学说,”,18,核基因组编码了,1500,多个线粒体蛋白,线粒体基因组只编码了,13,条多肽链,“,交叉对话（cross-talk）,”,机制,（三）,mtDNA,与,nDNA,的相互关系,1,、,nDNA,的表达状况可直接影响和调控,mt,DNA,的表达和线粒体蛋白质的生物合成。,2,、,mt,DNA,突变可直接影响,mt,DNA,所编码蛋白多肽的合成，而影响有氧呼吸、物质代谢和能量代谢，并进一步通过线粒体功能变化反馈影响,nDNA,的复制和表达。,3,、各种转录因子是其通讯的基础。,“,交叉对话（cross-talk）,”,机制,二、线粒体病的概念,因线粒体功能受损或缺陷而导致的疾病。,主要累及大脑和肌肉组织。,分为线粒体肌病，线粒体脑病、线粒体脑肌病,线粒体功能涉及众多的组织器官,21,三、线粒体病的特征,（一）母系遗传,与遗传早发,线粒体疾病的母系遗传,(,二,),同质性突变与异质性突变与发病阈值效应,24,线粒体基因,同质性（,Homoplasmy,）,0,或,100%,异质性（,Heteroplasmy,）,0-100%,核基因,纯合子（,Homozygous,）,0,或,100%,杂合子（,Heterozygous,）,50%,mtDNA,同质性,/,异质性突变与阈值,25,线粒体,DNA,的突变率极高，约比核,DNA,高,10-20,倍。,线粒体,DNA,排列紧凑，没有内含子，任何,mtDNA,的突变都可能影响其基因组的重要功能；,线粒体,DNA,缺少组蛋白的保护；,线粒体,DNA,容易被呼吸链生成自由基氧化损伤；,线粒体中没有,DNA,损伤的修复系统；,四、线粒体病的分子生物学检验标志,四、线粒体病的分子生物学检验标志,（一）,mtDNA,碱基位点,1,、点突变,1,）结构基因点突变包括同义突变和错义突变，错义突变导致氨基酸的替换，由此引起蛋白质结构和功能的改变，导致疾病。,Leber,视神经病（,LHON,）：,G11778A,（在,ND4,基因），,G3460A,（在,ND1,基因）,1,、点突变,2,）,tRNA,基因的点突变，可以降低线粒体内蛋白质的生物合成的能力，从而影响线粒体氧化磷酸化的功能，导致疾病的发生。,MELAS,综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：,A3243G(80%),T3271C,（在,tRNA Leu(UUR,),基因）,四、线粒体病的分子生物学检验标志,2,、单核苷酸多态性位点,单个核苷酸变异引起的,mtDNA,序列的多态性，与不同人群有关。,3,、线粒体单体群 在进化过程中，母系遗传的,mtDNA,为适应环境所形成的碱基位点多态性集合。,（二）,mtDNA,缺失或插入片段,大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。,大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体,OXPHOS,功能下降，产生的,ATP,减少，从而影响组织器官的功能。,常见缺失：,8483,13459,：,Kearns-Sayre,综合症（,KSS,）、缺血性心脏病；,8637,16073,：与衰老有关的退行性疾病；,4389,14812,：能量代谢受到严重破坏。,（二）,mtDNA,拷贝数的变化,mtDNA,拷贝数可作为评价线粒体功能的指标，当拷贝数减少时导致细胞能量缺乏，由此引发疾病，在胃癌、食管鳞癌等肿瘤细胞中,mtDNA,拷贝数下降，有可能成为一种新的肿瘤标志物。,第二节,线粒体病分子生物学检验技术及质量控制,一、线粒体病分子生物学检验策略,二、线粒体病的分子生物学检验技术,（一）,PCR-RFLP,技术,PCR-RELP,的质量控制,（,1,）模板,DNAD,的制备和引物设计：设计合适的引物扩增目的模板,DNA,（,2,）酶的选择：去除干扰物质，根据酶活性要求选择适宜的缓冲液、活性剂等，酶的用量不超过总体积的,10%,。,（,3,）,PCR,扩增体系和酶切反应条件：优化保证,PCR,产物的纯度和精度，设计好酶切反应体系，根据内切酶活性，适时终止反应。,（,4,）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增基因的变异情况。,二、线粒体病的分子生物学检验技术,（二）变性高效液相色谱法,在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现,DNA,突变。异源双链,DNA,与同源双链,DNA,的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。,DHPLC,检测的质量控制,1,、,DHPLC,检测的样本要求,（,1,）片段大小：最好在,200-500bp.,敏感性最好。,（,2,）样品质量：检测前不许纯化，核苷酸和引物会很早被洗脱，模板大分子在样品峰后洗脱。引物二聚体和非特异性扩增及碱基数类似的污染物需优化,PCR,去除。,（,3,）样品含量：,PCR,浓度必须足够大，要求,2,微升产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带，相当于浓度至少,20ng/ul.,（,1,）,PCR,引物的设计：引物长度,200-500bp,范围，且只有一个溶解区域，无错配的,PCR,片段,（,2,）,PCR,反应条件的优化，控制好温度和时间达到模板双链完全变性、复性,（,3,）,DHPLC,检测上样前要验证,PCR,产物质量，以保证结果准确性。,（,4,）结果分析：在部分变性条件下出现异源双链峰，表明异质性突变位点，反之则为同源单峰。建议购买阳性质控品。,2,、,DHPLC,检测的条件优化,二、线粒体病的分子生物学检验技术,（三）,DNA,芯片技术略,（四）,DNA,测序技术略,三、线粒体病的分子生物学检验应用,（一）,MELAS,综合征,11,月,23,日，读初三的晓炎从学校回家后，顾春娜就感觉女儿脸色不好，以为晓炎在学校吃的没有营养，就赶紧给女儿做了顿好饭。可晓炎吃过饭后不久，就开始呕吐。,当晚凌晨,2,点钟，晓炎出现了全身抽搐的症状，看到女儿四肢颤抖，嘴眼歪斜，顾春娜赶紧拨打,120,，急救车将女儿送到医院救治。,入院后的晓炎，直接被送进了,ICU,重症监护室。经过医院的多次检查，也没有最终确诊，院方建议顾春娜带晓炎去北京治疗。到了北京儿童医院，终于确诊晓炎患上的是一种因遗传基因的缺陷而导致的线粒体结构和功能的异常，病症名称为线粒体脑肌病。,MELAS,综合征发病特点,母系遗传,10,40,岁发病，,10,岁前发育正常。,首发症状为运动不耐受、卒中样发作、偏轻瘫、失语、皮层盲或聋。并有肢体无力、抽搐或阵发性头痛、智能低下,痴呆及乳酸血症,MELAS,基因,已发现,4,种点突变与大多数,MELAS,病例有关，其中2种分别在第,A3243,G、,T3271,C位核苷酸，最常见其中,80%,是,A3243,G,的突变,45,399bp,307bp,92bp,M,Un-cut 143B 43B 1 2,A3243G,为异质性突变,PCR-RFLP,（限制酶,Apa,）,PCR-DHPLC,WT,A3242G,mt3243,突变,DNA,序列测定,3243,正常序列,突变杂合子,三、线粒体病的分子生物学检验应用,（二）,Leber,遗传性视神经病变,Leber,遗传性视神经病是以德国眼科医生,Theodor Leber,的名字命名的，又称,Leber,视神经萎缩，为一种急性或亚急性发作的母系遗传病，男女病人比例,5:1,，至今尚未发现一个男性患者将此病传给后代。,视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急性亚急性视力减退，,中心视野丧失明显，,导致失明。,突变位点,基因,同质性,/,异质性,首次报道,*,G3316A,ND1,同质性,Saillard,et al.,(2000),T3394C,ND1,同质性,Hofmann,et al.,(1997),G3460A*,ND1,同质性,/,异质性,Huoponen,et al.(1991),C3497T,ND1,同质性,Kong,et al.,(2003,）,G3733A,ND1,同质性,/,异质性,Valentino,et al.,(2004),C4171A,ND1,同质性,/,异质性,Kim,et al.,(2002),T4216C,ND1,同质性,Torroni,et al,.(1994,）,A4435G,tRNA,Met,同质性,Herrnstadt,et al.,（,2002,）,G7444A,CO,同质性,Huoponen,et al.,（,1993,）,T10663C,ND,同质性,Brown,et al.,(1995),G11696A,ND4,同质性,/,异质性,Zhou,et al.,（,2006,）,G11778A*,ND4,同质性,/,异质性,Wallace,et al.,(1988),T12338C,ND4,同质性,Wong,et al.,（,2002,）,G14459A,ND6,同质性,/,异质性,Jun,et al.,(1994),C14482G/A,ND6,同质性,/,异质性,Howell,et al.,(1998),T14484C*,ND6,同质性,/,异质性,Johns,et al.,(1992),A14495G,ND6,异质性,Chinnery,et al.,(2001),T14502C,ND6,同质性,Ozawa,et al.,（,1991,）,C14568T,ND6,同质性,Wissinger,et al.,(1997),A14693G,tRNA,Glu,同质性,/,异质性,Tzen,et al.,（,2003,）,A15951G,tRNA,Thr,同质性,Li,et al.,（,2006,）,School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,49,原发性突变：,G3460A,，,G11778A,，,T14484C,的突变，占全部,LHON,的,80-90,继发性突变：,T3394C,，,T4216C,，,C4019T,，,G5244A,，,C4777T,，,G9438A,，,G13708A,，,G15257A,新突变：,A4435G,位于,tRNA,Met,基因,可以,调节,ND4 G11778A,突变,的外显率,与,Leber,遗传性视神经病变相关的,mtDNA,突变,11778GA 90.9%,3460GA 1.8%,14484TC 7.3%,是目前公认的致病性最强的三种原发性突变,11778GA,发病时视力多低于,0.1,，视力预后也最差；,14484TC发病时视力及视力恢复情况明显好于11778GA患者,11778GA,导致编码,NADH,脱氢酶亚单位,4(ND4),中第,340,位的,Arg,精,His,组，改变,ND4,空间构型，,NADH,脱氢酶活性降低，线粒体产能效率下降，视神经细胞提供能量不能长期维持视神经完整结构，导致神经细胞退行性变、死亡。,11778 GA,3460GA(ND1),14484TC(ND6),Leber,病变相关的,mtDNA,突变常用检测技术,PCR-RFLP技术,PCR-SSCP技术,DHPLC,技术,DNA测序技术,School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,52,G3460A,，,G11778A,，,T11484C,原发性突变测序图,三、线粒体病的分子生物学检验应用,（三）药物性耳聋,突变位点,基,因,同质性,/,异质性,疾,病,首次报道,a,T961delT+C(n)ins,961insC,12S rRNA,同质性,药物性耳聋,/,非综合征型耳聋,Bacino,et al,.(1995),Tang,et al,.(2002),T1095C,12S rRNA,同质性,/,异质性,药物性耳聋,/,非综合征型耳聋,Thyagarajan,et al,.(2000),C1494T,12S rRNA,同质性,药物性耳聋,/,非综合征型耳聋,Zhao,et al,.(2004),A1555G,12S rRNA,同质性,/,异质性,药物性耳聋,/,非综合征型耳聋,Prezant,et al,.(1993),G1606A,tRNA,Val,异质性,综合征型耳聋,Tiranti,et al,.(1998),A3243G,tRNA,Leu(UUR,),异质性,综合征型耳聋,van den Ouweland,et al,.(1992),G7444A,CO1,/tRNA,Ser(UCN,),同质性,/,异质性,药物性耳聋,/,非综合征型耳聋,Pandya,et al,.(1999),A7445G,CO1,/tRNA,Ser(UCN,),同质性,/,异质性,非综合征型耳聋,Reid,et al,.(1994),7472insC,tRNA,Ser(UCN,),同质性,/,异质性,综合征型耳聋,Tiranti,et al,.(1995),T7511C,tRNA,Ser(UCN,),同质性,/,异质性,非综合征型耳聋,Sue,et al,.(1999),T7512C,tRNA,Ser(UCN,),同质性,/,异质性,综合征型耳聋,Nakamura,et al,.(1995),A8344G,tRNA,Lys,异质性,综合征型耳聋,Shoffner,et al,.(1990),G8363A,tRNA,Lys,异质性,综合征型耳聋,Santorelli,et al,.(1996),T14709C,tRNA,Glu,同质性,综合征型耳聋,Rigoli,et al,.(2001),G15927A,tRNA,Thr,同质性,药物性耳聋,/,非综合征型耳聋,Wang,et al,.(2008),第二节 线粒体基因组与耳聋,耳聋相关的,mtDNA,突变的检测,PCR-RFLP技术,DHPLC技术,DNA测序技术,基因芯片技术,55,检测位点,引物序列,(5,3),退火温度,(,),产物长度,(bp,),A1555G,C1494T,CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT,58,802,TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA,A7445G,ACG CCA AAA TCC ATT TCA CT,58,987,CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT,三、线粒体病的分子生物学检验应用,（四）线粒体糖尿病,线粒体糖尿病,美国糖尿病协会,(1997)/,世界卫生组织,(1999),制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于,细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的,1,3,据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为,2.96%,线粒体DNA突变与糖尿病,突变位点,累及基因,同质性,/,异质性,疾病,首次报道,C1310T,12S rRNA,同质性,糖尿病临床表型,Guan et al.(2010),A1438G,12S rRNA,同质性,糖尿病临床表型,Vawter,et al.(2009),A3243G*,tRNA,Leu,(UUR),异质性,糖尿病合并耳聋,Van den et al.(1992),C3254A,tRNA,Leu,(UUR),异质性,妊娠糖尿病,Ng et al.(2000),T3264C,tRNA,Leu,(UUR),异质性,糖尿病,Matsuoka et al.(1997),T3271C,tRNA,Leu,(UUR),异质性,糖尿病,Jaksch,et al.(1995),G3316A,MT-ND1,同质性,非胰岛素依赖性糖尿病,Ogihara,et al.(1995),T3394C,MT-ND1,同质性,非胰岛素依赖性糖尿病,Wallace et al.(1995),T3398C,MT-ND1,同质性,糖尿病合并耳聋,Jaksch,et al.(1995),A3399T,MT-ND1,同质性,妊娠糖尿病,Ng et al.(2000),T4291C,tRNA,Ile,同质性,糖尿病临床表型,Lifton,et al.(2004),A4833G,MT-ND2,同质性,非胰岛素依赖性糖尿病,Onaya,et al.(2000),A7472C,tRNA,Ser(UCN),同质性,糖尿病合并耳聋,Hanna et al.(2005),A8296G,tRNA,Lys,同质性,/,异质性,糖尿病合并耳聋,Ohsawa,et al.(1998),A10398G,MT-ND3,同质性,2,型糖尿病,Kato et al.(2003),A12026G,MT-ND4,同质性,糖尿病,Onaya,et al.(1998),C12258A,tRNA,Ser(AGY),异质性,糖尿病合并耳聋,Turnbull et al.(1998),T14709C*,tRNA,Glu,同质性,/,异质性,糖尿病合并耳聋,Moraes,et al.(1995),T16189C,MT-DLOOP,同质性,2,型糖尿病,Poulton,et al.(1998),School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,57,58,携带,tRNA,Leu,(UUR),A3243G,突变的糖尿病家系,School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,59,399bp,307bp,92bp,M,Un-cut 143B 43B 1 2,A3243G,为异质性突变,RFLP,DNA Sequencing,DHPLC,Control,A3243G,A3242G,WT,School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,60,School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,第十六章,肿瘤的分子生物学检验技术,滨医附院检验科 袁笑,常见肿瘤标志物与肿瘤,前列腺癌,PSA,EAP,睾丸癌,AFP,hCG,胰腺癌,CA 199,乳房癌,CA 153,卵巢癌,CA 125,肝癌,AFP,肝癌,AFP,肿瘤 首选标志物 补充标志物,肺癌,CEA,、,NSE,、,CYFRA21-1 TPA,、,SCC,、,ACTH,、降钙素、,TSA,肝癌,AFP AFU,、,GT,、,CEA,、,ALP,乳腺癌,CA15-3,、,CEA CA549,、,hCG,、降钙素、铁蛋白,胃癌,CA72-4 CEA,、,CA19-9,、,CA242,前列腺癌,PSA,、,f-PSA PAP,结肠直肠癌,CEA CA19-9,、,CA50,胰腺癌,CA19-9 CA50,、,CEA,、,CA125,卵巢癌,CA125 CEA,、,hCG,、,CA19-9,睾丸肿瘤,AFP,、,hCG,宫颈癌,SCC CA125,、,CEA,、,TPA,膀胱癌 无,TPA,、,CEA,骨髓瘤 本,-,周蛋白、,2-,M,常用肿瘤标志物联合检测的临床应用,肿瘤的分子诊断,肿瘤从本质上来讲是基因出现了问题，本质上是一种基因病,同一种肿瘤其驱动基因可能完全不同，对治疗的反应，肿瘤的发展以及预后可能完全不同,不同的肿瘤其驱动基因可能相同，对相同的针对性治疗方案反应相似,因此，针对肿瘤的分子诊断愈发重要,第一节,肿瘤的分子生物学检验策略,一、肿瘤的分子生物学检验策略,1,、检测肿瘤相关基因,包括癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因等。,2,、检测肿瘤相关病毒的基因,致瘤性,DNA,病毒：,HPV,HBV,EBV,等,致瘤性,RNA,病毒：人类,T,细胞白血病,/,淋巴瘤病毒,1,和,HCV.,3,、检测肿瘤标志物基因或,Mrna,在血液中的含量能反应恶性肿瘤的发生发展以及对治疗的反应,二、肿瘤的分子生物学检验技术,1,、标本的来源：,容易获得（无创或微创）,2,、分析方法的选择：,敏感性高、特异性强，适合相应样本的检测方法,分析,DNA,RNA,仍然是分子杂交、,PCR,、基因测序。,3,、新技术产生：基因芯片，高通量测序，分子病理学，分子显像技术，高通量质谱技术等。,68,肿瘤分子诊断的常用方法,染色体数目异常：荧光原位杂交技术,FISH,致病基因结构异常检测,（,1,）斑点杂交（,dot blot hybridization,）,（,2,）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（,ASO,）,（,3,）单链构象多态性（,SSCP,）,（,4,）限制性内切酶图谱（,restriction map,）分析,（,5,）限制性片段长度多态性（,restriction fragment length polymorphism,RFLP,）,（,6,）,DNA,分子杂交（,Southern blot,）,致病基因表达异常检测,（,1,）,mRNA,检测,定量,PCR,（,2,）蛋白检测免疫组化：定性、半定量、定位,Western blot,：定量,第二节,肿瘤诊断的生物标志物,70,肿瘤诊断的生物标志物的发展,第,1,阶段,（,1963-1978,）：癌胚性抗原,1963,年,Abelev,AFP,1965,年,Gold&Freeman CEA,第,2,阶段,（,1979-1989,）：糖链抗原为主,1980,年,Koprowski CA19-9,（,1116-NS-19-9,）,1981,年,Bast CA125,（,OC125,）,第,3,阶段,（,1990,以后）：基因标志,肿瘤基因标志,71,一、肿瘤相关的染色体异常,1,、数目异常：某个癌细胞的染色体共,104,条，包括许多异常的染色体,72,2.,染色体结构异常,易位,、,缺失、重复、环状染色体和双着丝粒染色体,例：,Ph,染色体,（费城,1,号染色体），慢性粒细胞性白血病（,CML,），,9,号和,22,号染色体长臂易位,9,号原癌基因,abl,和,22,号,bcr,基因组合成融合基因,增高的酪氨酸激酶活性。,Ph,临床意义在于,：,95,的,CML,都是,Ph,阳性，可以作为诊断的依据。有时,Ph,先于临床症状出现，故又可用于早期诊断,。,73,二、肿瘤相关基因表达异常,原癌基因,:,sis,、,VEGF,、,EGFR,、,c-myc,抑癌基因,:APC,、,BRCA,、,p53,、,Rb,细胞周期调节基因,:,cyclins,、,CDKs,、,CKIs,细胞凋亡相关基因,:,Bcl-1,、,p53,、,bcr-abl,基因组稳定相关基因,(DNA,修复基因,):,APE1,肿瘤转移相关基因,:,nm23,、,WDNM,、,sis,、,p53,肿瘤血管生成相关基因,:,VEGF,、,EGFR,、,p53,（一）原癌基因,普遍存在于人类或其他动物固有的一类基因，其在生物进化过程中高度稳定，对细胞无害，而且在控制细胞生长和分化中起重要作用。在环境致癌因素作用下，原癌基因发生,点突变、易位激活、原癌基因扩增、癌基因甲基化程度降低,被激活成活性形式的癌基因才引起细胞癌变。,(,一,),原癌基因点突变,(point mutation),癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活性,75,mutation,(,二,),基因易位或重排使原癌基因激活,基因易位（,translocation,）基因重排（,rearrangemant,）：有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生,76,(,三,),原癌基因获得外源启动子而激活,肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的,mRNA,或翻译产物蛋白质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因，使其表达产物增多 病毒的增强子常位于,5,端的长末端重复序列,(1ong terminal repeat,，,LTR),内。如果增强子插入到原癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的表达比正常表达增高几十甚至上百倍,77,(,四,),原癌基因甲基化程度降低而激活,DNA,分子中的甲基化,(methylation,),对阻抑基因的转录具有重要作用,78,（二）抑癌基因,又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成起阻抑作用的蛋白质基因，正常情况下抑制细胞增殖、促进细胞分化。,抑癌基因失活方式：,1,）,DNA,点突变或缺失,导致一个等位基因失活。,2,）,DNA,甲基化和组蛋白去乙酰化,抑制一个等位基因表达。,（三）细胞周期调节基因,细胞周期：正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的连续动态过程，也是多阶段多因子参与的精确而有序的调控过程。,特点：,1,）单向性：,G1 S G2 M,2,）阶段性：因某种原因停滞下来，条件好转，进入下一时项,3,）检查点：细胞各时项交叉处存在检查点，通过检查点才能进入下一个时项。,细胞周期运行的动力主要来自细胞周期蛋白依赖性激酶，它的活性受细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂调控。这些调控方式相互制约，形成一个复杂的细胞周期分子调控网络。,1,、细胞周期依赖性蛋白激酶,CDK1-13,2,、细胞周期蛋白,CCND1,3,、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,CDK,4,、细胞周期检查点,Chk1,(,三,),细胞周期调节基因,（四）细胞凋亡相关基因,大致分为三组,1,、促进细胞凋亡基因,2,、抑制细胞凋亡基因,3,、细胞凋亡过程中表达的基因,（五）维持细胞基因组稳定相关基因,DNA,修复基因及基因组不稳定性基因,（六）促进和抑制肿瘤转移的相关基因,（七）肿瘤血管生成相关基因,VEGF(,血管内皮生长因子,),84,三、肿瘤相关单核苷酸多态性,1.SNP,与肿瘤,肿瘤易感基因、肿瘤药物治疗相关基因,肿瘤个体化诊疗,2.SNP,的研究思路,研究对象差异性,研究技术：,PCR,、芯片,研究难点：样本采集,85,四、肿瘤相关表观遗传异常,（一）表观遗传（,epigenetics,）是指,DNA,序列不发生变化,，但,基因表达却发生了可遗传的改变,。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。,（二）分子机制：,1,、基因印记丢失，一对等位基因只表达来自亲本一方的等位基因，而与性别无关。,2,、,DNA,甲基化：例如启动子区域的,CpG,岛高甲基化所致抑癌基因转录沉默,3,、组蛋白修饰与染色体重塑,86,五、肿瘤相关,miRNA,1,、,miRNA,与肿瘤,miRNA,与肿瘤发生、发展、诊断、治疗、预后,2,、,miRNA,类肿瘤标志物的研究思路,研究对象：实体瘤、细胞、循环血、其他,研究技术：定量,PCR,、,western blot,、芯片、免疫组化、细胞培养（增殖、迁移、浸润）等等,第三节,肿瘤分子生物学检验的临床应用,肺癌,肺癌的分子遗传特征,1,、细胞色素,P450,家族，绝大多数的致癌物包括内源性和外源性都需经过,P450,转化，研究最多的,CYP1A1,2,、谷胱甘肽转移酶（,GST,）家族,使致癌物失活,3,、,NAT2,家族，解毒作用,90,肺癌的分子生物学检验,1,、,EGFR,（原癌基因表皮生长因子受体）基因检测,大多数在,NSCLC,中过表达且是重表皮生长要是治疗靶标，,EGFR,是表皮生长因子相关酪氨酸受体家族的成员，通过与配体的结合，受体同源和异源二聚体化，从而激活受体内源性的酪氨酸激酶，并引发下游信号级联反应，主要包括,Ras-Raf-MAP,激酶信号通路、,P,3K-Akt,信号通路和,STAT,通路。这些信号通路对细胞的增值、分化、迁移和血管生成有很强的刺激效应。,91,肺癌的分子生物学检验,2,、,K-ras,检测,ras,基因，特别是,K-ras,基因，与肺癌的发生及预后有 关。有,20%-30%,的,NSCLC,患者存在,K-ras,基因突变。,80%-90%,的突变是,12,密码子,G-T,引起的，导致,K-ras,蛋白组成性活化，,NSCLC,患者伴随,K-ras,突变与预后不良有关，,K-ras,突变与,EGFR,突变是相互排斥的。,伴随,K-ras,突变的,NSCLC,患者,EGFR-TK,3,药物敏感性较差,92,肺癌的分子生物学检验,3,、甲状腺转录因子,1,（,TTF-1,）,是一种分子量为,38-40,的核蛋白，在胎儿肺组织及成人,型肺泡上皮中存在，而在,型肺泡上皮中不表达，,TTF-1,高表达则,EGFR,突变率高，是服用,EGFR-TK,3,药物的优势人群。,93,肺癌的分子生物学检验,4,、癌胚抗原（,CEA,）,表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，用于检测上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。,靶向,EGFR,的,抗肿瘤药物,类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（,EGFR,TKI),作用机制：抑制,EGFR,胞内区,酪氨酸激酶活性，阻断,EGFR,信号通路；,药物代表：,吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替尼,（罗氏）。,类别二：单克隆抗体,(,mAb,),作用机制：与,EGFR,胞外区,结合，阻断配体与,EGFR,的结合；,药物代表：,西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗氏）,。,乳腺癌,乳腺癌基因检测的意义,BRCA1:1990,年研究者发现一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因，命名为,BRCA1,，,1994,年又发现另外一种与乳腺癌有关的基因，称为,BRCA2,。,乳腺癌遗传检测适宜人群,(,如果有以下因素，强烈建议接受乳腺癌,BRCA,检查,),1,、一个或多个直系亲属有乳腺癌史，如母亲或姐妹,2,、家族成员里有早发乳腺癌患者，发病年龄早于,40,3,、家族成员里两代以上出现乳腺癌患者,4,、家族成员有双侧乳腺癌患者,5,、家族成员里有卵巢癌患者,6,、家族成员有男性成员乳腺癌患者,7,、一个或多个家族成员携带,BRCA,基因突变，即遗传检测阳性,乳腺癌的分子生物学检测,1,、,c-erb,B-2/HER2,基因的检测,是乳腺癌中较常见，易激活的原癌基因,c-erb,B-2/HER2,基因高表达往往生存率低，恶性程度高,2,、雌激素受体和孕激素受体的检测,ER,和,PR,阳性的乳腺癌可以进行内分泌治疗,肿瘤生物学行为决定乳癌治疗选择,Negative,Positive,ER,/,PgR,HER-2,Negative,Positive,化疗,Avastin,内分泌治疗,抗,Her-2,治疗,白血病,1,、白血病相关基因突变,（,1,）,C-KIT,基因突变,（,2,）,FLT3,基因突变,(3)NPM,基因突变,（,4,）,N-ras,基因突变,（,5,）,NOTCH1,基因突变,2,、白血病相关基因异常表达,（,1,）,WT1,基因异常表达，为抑癌基因的一种，是急性白血病独立的预后因子,（,2,）,HOX11,基因异常表达，此类患者预后较好，化疗效果佳。,3,、白血病融合基因,染色体易位使位于,9q34,的,c-abl,基因转移到第,22,对染色体上，重排形成,bcr-abl,融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由,p145,变成,p210,，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病