DNA和RNA提取方法及原理课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,和,RNA,提取方法及原理,第二部分：,DNA,提取常见问题分析及对策,DNA,提取专题,第一部分：,DNA,提取方法简介,前言,DNA,是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的,DNA,是非常重要的前提。,DNA,提取原则,保证,DNA,结构的完整性,纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质,排除有机溶剂和金属离子的污染,蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度,排除其他核酸分子的污染,DNA,提取的几种方法,染色体,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,其它,DNA,提取的几种方法,非染色体,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,煮沸法,线粒体、叶绿体,DNA,的提取,差速离心结合,SDS,裂解法,基因组,DNA,CTAB,法,CTAB,法原理,（植物,DNA,提取经典方法）,CTAB,（,hexadecyltrimethylammonium,bromide,，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（,0.7mol/L NaCl,）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：,CTAB,溶液在低于,15,时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的,植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于,15,。,CTAB,提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl,（,pH8.0,）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,-,巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组,DNA,CTAB,法,CTAB,提取缓冲液的改进配方,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB,法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,基因组,DNA,CTAB,法,SDS,法原理,基因组,DNA,SDS,法,SDS,是一种阴离子去垢剂，在高温（,55,65,）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐,(KAc,或,NH4Ac),浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；,上清液中的,DNA,用酚,/,氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的,DNA,。,SDS,法流程图,（以动物组织为例）,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,基因组,DNA,SDS,法,基因组,DNA,其它方法,物理方式,：玻璃珠法、,超声波法、研磨法、冻融法,化学方式,：异硫氰酸胍法、碱裂解法,生物方式,：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,基因组,DNA,其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,高盐低,pH,值结合核酸，低盐高,pH,值洗脱。,快捷高效。,低盐高,pH,值结合核酸，高盐低,pH,值洗脱。,适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,基因组,DNA,其它方法,浓盐法,：,有机溶剂抽提法,：,密度梯度离心法：,利用,RNP,和,DNP,在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒,DNA,碱裂解法,碱裂解法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒,DNA,碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒,DNA,溶液,质粒,DNA,煮沸法,煮沸法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当加热处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在冷却时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器,DNA,差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。,将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的,比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,第一部分：,DNA,提取方法简介,内容,第二部分：,DNA,提取及常见问题分析,DNA,提取的基本步骤,I.,材料准备,II.,破碎细胞或包膜内容物释放,III.,核酸分离、纯化,IV.,沉淀或吸附核酸，并去除杂质,V.,核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融,提取血液基因组,DNA,时，要选择有核细胞（白细胞）,组培细胞培养时间不能过长，否则会造成,DNA,降解,含病毒的液体材料,DNA,含量较少，提取前先富集,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）,培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致,DNA,量少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶,K,细菌溶菌酶破壁,酵母破壁酶或玻璃珠,高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,菌体量适当,培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮,变性的时间不要过长（,5,分钟），否则质粒易被打断,复性时间也不宜过长，否则会有基因组,DNA,的污染,G,菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离,DNA,时，应提供相应的缓冲体系,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：,酚,/,氯仿抽提,使用变性剂变性（,SDS,、异硫氰酸胍等）,高盐洗涤,蛋白酶处理,多糖的去除：,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入,1/2,体积的,5M NaCl,，高盐可溶解多糖。,用多糖水解酶将多糖降解。,在提取缓冲液中加一定量的氯苯,(1/2,体积,),，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,用,PEG,8000,代替乙醇沉淀,DNA,：在,500L DNA,液中加入,200l 20%PEG,8000,(,含,1.2 M NaCl),，冰浴,20min,。,核酸分离、纯化,多酚的去除：,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：,-,巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如,PVP,、,PEG(,聚乙二醇,),，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与,DNA,的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：,70,的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时加入,1/10,体积的,NaOAc,（,pH5.2,，,3M,），有利于充分沉淀,沉淀后应用,70,的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干,DNA,，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,基因组,DNA,的检测,提取的基因组,DNA,片段在,20kb,30kb,之间,高质量的基因组,DNA,带型 单一无拖尾现象,DNA,浓度及纯度的检测,A,260,=1,约,50,g/mL,双链,DNA,；,A,260,/,280,约为,1.8,DNA,提取常见问题,问题一：,DNA,样品不纯，抑制后续酶解和,PCR,反应。,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,有,RNA,的存留,原因,对,策,重新纯化,DNA,，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀,DNA,，让酒精充分挥发,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,加入,RNase,降解,RNA,DNA,提取常见问题,问题二：,DNA,降解。,材料不新鲜或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于剧烈，,DNA,被机械打断,外源核酸酶污染,反复冻融,原因,对,策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液,在提取内源核酸酶含量丰富的材料的,DNA,时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将,DNA,分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA,提取常见问题,问题三：,DNA,提取量少。,实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,吸附或沉淀不完全,洗涤时,DNA,丢失,原因,对,策,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）。,增加吸附的时间，或低温沉淀,小心操作,RNA,提取专题,第二部分：,RNA,提取及常见问题分析,第一部分：,RNA,提取方法简介,分离提纯,RNA,的目的,分析不同发育时期基因的表达状况,获得新基因,研究基因的拼接,分析相应的蛋白产物,RNA,的不稳定性,由于核糖残基的,2,和,3,位置带有羟基，,RNA,易于被,RNA,酶切割水解,RNA,酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,提取,RNA,的注意事项,经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能,有,RNase,，会导致,RNase,污染。,使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。,应使用不含,RNase,的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在,150,烘烤,4,小时，塑料器皿可在,0.5M NaOH,中浸泡,10,分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除,RNase,。,常用,RNA,酶抑制剂,焦磷酸二乙酯（,DEPC,）：,与,RNA,酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的,RNA,酶抑制剂。,异硫氰酸胍：目前是最有效的,RNA,酶抑制剂，裂解组织的同时也使,RNA,酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对,RNA,酶有强烈的变性作用。,氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和,RNA,酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制,RNA,酶的活性。,RNA,酶的蛋白抑制剂（,RNasin,）：,从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。,RNasin,是,RNA,酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种,RNA,酶结合，使其失活。,其它：,SDS,、尿素、硅藻土等对,RNA,酶也有一定抑制作用。,RNA,提取专题,第二部分：,RNA,提取及常见问题分析,第一部分：,RNA,提取方法简介,RNA,提取的步骤,材料的裂解,杂质的去除,RNA,的吸附或沉淀,异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，,N-,月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放,RNA,，有效抑制核酸酶。,苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使,DNA,及蛋白沉淀到有机相。,硅质材料的吸附,或用异丙醇沉淀浓缩,RNA,。,经,DEPC,处理的水溶解,RNA,材料准备及裂解,尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。,组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要匀浆处理。,对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的,RNA,样品储存液中保存。,液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。,RN,A,的提取,杂质的抽提,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和,DNA,分布到中间层和有机相中，,RNA,留在水相中,对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提,RNA,的提取,RNA,的沉淀和溶解,含,RNA,的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质,或使用异丙醇沉淀,RNA,应充分的混匀并放置,10min,左右离心收集沉淀，,70,乙醇洗涤，晾干,用经,DEPC,处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解,RNA,样品收集后或需长期保存时应置于,70,或加入,RNase,抑制剂，分装使用,RNA,的提取,RNA,的检测,电泳槽系统的处理,乙二醛化琼脂糖凝胶电泳,含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳,RNA,纯度及浓度的检测,（,A,260,=1,，约,40 g/mL,RNA,；,A,260,/A,280,约为,1.9-2.1,）,1,抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染,2 DNA,的污染,3,离子浓度较高,原因,对,策,1,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数,，用吸附柱纯化,2,减少处理样品的量；加入不含,RNase,的,DNase,处理；再次纯化,3,增加漂洗次数,RNA,提取常见问题,问题一：,RNA,样品不纯,1,样品含有杂质杂液,2,样品过量或样品裂解,和匀浆不彻底,3 RNA,未有效的吸附沉淀或洗脱,4,样品,RNA,含量少,原因,对,策,1,去除样品中的杂质，离心除净样品中的培养基或储存液,2,减少样品用量；充分研磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间,3,延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间；再次洗脱,4,重复吸附，加入肝糖等有助,RNA,沉淀的试剂,RNA,提取常见问题,问题二：,RNA,得率低,1,样品不新鲜或样品保存不当，,RNA,降解,2,污染了,RNase,3,样品储存不当,原因,对,策,1,尽量取新鲜的样品；取样后立即放入液氮保存；或放入专门的储存液内；研磨样品及时补充液氮,2,认真地处理相应的器具和试剂；严格地操作,3 -70,冻存，分装使用；加入,RNase,抑制剂,RNA,提取常见问题,问题三：,RNA,容易降解,