花药培养-(1).ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,植物组织培养,项目六 草莓花药培养,江苏农林职业技术学院,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),主讲(zhjing)：蔡建秀,职称：教授,邮箱：jxcqz57163,第一页，共六十七页。,工程(xingm)六,草莓,(comi),花药培养,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第二页，共六十七页。,教学,(jio xu),目标,工作,(gngzu),任务,实践,(shjin),操作,问题探究,知识拓展,作 业,教学内容,泉 州 师 范 学 院生物,第三页，共六十七页。,教学,(jio xu),终极目标,会草莓花药培养和脱毒苗快速,(kui s),繁殖,会采集(cij)适宜的草莓花蕾做为外植体消毒灭菌,能剥取花药诱导愈伤组织并分化小苗、继代增殖,能对花药培养试管苗染色体观察,会进行试管苗驯化、移栽,促 成 目 标,教学目标,泉 州 师 范 学 院生物,第四页，共六十七页。,草莓Fragari aananassa Duch是蔷薇科草莓属多年生草本植物(cobnzhw)，果实鲜艳美丽、芳香浓郁、柔软多汁。且富含糖、蛋白质、磷、钙、铁及大量维生素和有机酸。除鲜食外，还可以加工成果浆、果汁、果酒及各种冷饮和速冻食品，深受广阔消费者欢送。,工程(xingm)介绍,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六页，共六十七页。,花蕾表面消毒、花药培养,任务,3,对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离,任务,1,诱导试管苗、鉴定并增殖培养,任务,4,试管苗移栽和管理,任务,5,配制草莓花药培养的培养基,任务,2,工作,(gngzu),任务,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第七页，共六十七页。,任务,1,采集草莓花蕾、检查,(jinch),花粉的发育时期,一、检查花粉的发育时期(shq)材料选择,单核靠边期的花药。,方法：从田间采集花蕾数个，从每花蕾12枚花药于载玻片上，加醋酸洋红12滴，用玻棒或镊子将花药压碎，剔除碎片，加盖盖玻片镜检压片染色法。,观察几个视野，假设多数花粉只有一个核并被挤向一侧，即为单核靠边期，说明(biomng)此时花药适合作外植体。,泉 州 师 范 学 院生物,第八页，共六十七页。,通常花粉单核靠边期的草莓,花蕾形态,是：未开放，花萼略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色,(bis),或淡绿色且不松动，花药微黄而充实。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第九页，共六十七页。,二材料预处理,将从田间(tin jin)采集的花蕾，用湿纱布包好放塑料袋中，扎好袋口，置4左右冷藏箱中放置2448小时。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十页，共六十七页。,配制,(pizh),草莓花药培养的培养基。,任务,(rn wu),2,愈伤组织,(zzh),诱导：丰香、明宝,B5,或,MS+BA2.0+KT2.0+IAA4.0,分化培养：,MS+BA2.0+ZT2.0+NAA0.2,诱导生根：,1/2MS+NAA0.1,泉 州 师 范 学 院生物,第十一页，共六十七页。,花蕾(huli)外表消毒、花药培养,任务,(rn wu),3,材料(cilio)消毒：将接种材料(cilio)用自来水洗干净20min，用无菌纸轻轻擦干。然后将材料放入已消毒过的广口瓶内，参加70%酒精浸润30s，倒去酒精，再倒入0.1%升汞消毒8min，倒去消毒液后用无菌水冲洗4次。,接种：用消过毒的镊子或接种环将花药接种于愈伤诱导培养基上。,接种密度宜高。,泉 州 师 范 学 院生物,第十二页，共六十七页。,接种后将材料(cilio)放置培养室内进行培养，温度为25，光强10003000 lx，每日光照12小时。培养1520d后，花药开始产生愈伤组织，待愈伤组织长至24mm时，转入芽分化培养基MS+6BA0.5mg/L+KT0.5mg/L。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十三页，共六十七页。,诱导试管苗、鉴定并进行,(jnxng),增殖培养,任务,(rn wu),4,草莓花药培养自然加倍频率很高，尤其是继代培养的材料，因而可不进行人工,(rngng),加倍处理。,泉 州 师 范 学 院生物,第十四页，共六十七页。,将高23cm，根系兴旺的小植株移入温室(wnsh)，翻开瓶盖炼苗3d。然后洗去培养基，即可移栽。,试管苗驯化和移栽,任务,5,疏松通气、适宜(shy)的保水性、清洁卫生是组培苗对基质的根本要求。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十五页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十六页，共六十七页。,试管苗移栽及环境调控,任务,6,幼苗出瓶操作过程要小心仔细，可在容器中加适量水后，用玻璃棒轻轻搅动后倒出，再用镊子夹取，取出的幼苗用水将根部的琼脂等冲洗干净,(gnjng),，移栽至苗床,。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十七页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十八页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第十九页，共六十七页。,外植体选准备,(zhnbi),诱导花粉,(hufn),脱分化、分裂,花粉,(hufn),植株鉴定,花药培养技术,驯化和移栽,分化、壮苗培养,完整植株形成,实践操作,泉 州 师 范 学 院生物,第二十页，共六十七页。,目的：,诱导,(yudo),产生单倍体植株。,什么是花药,(huyo),花粉培养？,花粉和花药的培养,(pollen and anther culture),是指将花粉发育至一定阶段的花药接种在人工培养基上，改变其正常发育和机能，以形成花粉胚或愈伤组织，不经受精,(shu jng),而发生细胞分裂，进而由单个花粉粒分化成完整单倍体植株的技术。,问题探究,泉 州 师 范 学 院生物,第二十一页，共六十七页。,花粉粒也称小孢子是由花粉母细胞经减数分裂形成(xngchng)。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。,雄蕊结构：花的雄性器官。包括花丝、花药两局部(b fen)。其中花药局部(b fen)由药隔2n和花粉粒(1n)组成。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第二十二页，共六十七页。,Anther,花粉囊,style,花柱,Pollen,花粉,Filament,花丝,egg cell,卵细胞,Embryo sac,胚囊,petal,花瓣,ovary,子房,(zfng),stigma,柱头,secundary-Receptacle,花托,sepal,萼片,Embryo sac nucleus,胚囊核,staminode,退化雄蕊,Germinating pollen,发芽的花粉,ovule,胚珠,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第二十三页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第二十四页，共六十七页。,7,天,14,天,21,30,40,后,曼陀罗的花药培养,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第二十五页，共六十七页。,什么,(shn me),是单倍体植株？,什么,(shn me),是单倍体植株？,单倍体细胞,植物进行有丝分裂时，要进行一种特殊的细胞分裂，即减数分裂。减数分裂后形成,(xngchng),的雌、雄配子，其染色体数目为体细胞的一半。将这种具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞。,单倍体植物,(haplobiont),单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物体。这种具有单套染色体的植物称为单倍体植物。,泉 州 师 范 学 院生物,第二十六页，共六十七页。,花粉是植物的生殖器官，花粉细胞是通过减数分裂而来，因此，花粉细胞内只含有,(hn yu),正常植株染色体组数的一半。,几个染色体组就是几倍体，如：,八倍体,单倍体,四倍体,六倍体,单倍体,三倍体,四倍体,单倍体,二倍体,二倍体,单倍体,一倍体,1,、单倍体内含有的染色体组数同配子体一样。,2,、单倍体是一个,(y),相对的概念，是相对正常植株而言的。,3,、单倍体不一定就是一倍体，它可以是二倍体、三倍体或更高 倍体。,.,单倍体概念,(ginin),的理解,单倍体,泉 州 师 范 学 院生物,第二十七页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第二十八页，共六十七页。,为什么多数植物,(zhw),采用单核期花粉培养容易成功？,一花粉发育时期：,1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(wnq)(单核靠边期),选择适宜的花粉发育时期是提高花粉植株诱导成功率的重要因素，并非任何时期的花粉都能诱导出花粉植株，只有花粉发育到一定的时期，才对离体培养敏感(mngn)，对大多数植物而言，适宜的花粉时期是单核期，尤其是单核中、晚期。,泉 州 师 范 学 院生物,第二十九页，共六十七页。,雄配子体的发育,营养细胞,生殖细胞,精子,小孢子的发育时期,(shq),单核期：单核早期，单核晚期；,双核期：双核早期，双核晚期；,三核期：三核型花粉植物。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第三十页，共六十七页。,小孢子不同发育时期,(shq),对胚状体和愈伤组织诱导率的影响,愈伤组织诱导,(yudo),率：,葡萄为例，四分体期为,15,，单核期为,1,，双核期为,0,。,梨四分孢子期为,26.3,，单核双核期为,40,。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第三十一页，共六十七页。,不同植物种类，诱导愈伤组织和胚状体发生，均有适宜的小孢子发育,(fy),时期,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第三十二页，共六十七页。,1小孢子发育的第三期小孢子经二次有丝分裂形成成熟花粉的初期是胚胎形成的临界期。离体培养时，假设小孢子的发育期超越这一时期胚状体就不能形成。Niesch(1968)提出，小孢子的双核期，淀粉逐渐积累(jli)形成，小孢子就不能再生成植物体。,2小孢子发育的过程中，花药内源激素的平衡不断(bdun)改变，随着花粉的成熟，激素平衡变得不适合小孢子的脱分化；或者随着花粉成熟，花粉花粉脱分化必备的物质消耗殆尽，因此，小孢子就不能再生成植物体。,原因,(yunyn),泉 州 师 范 学 院生物,第三十三页，共六十七页。,培养,(piyng),花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进 行细胞学花粉发育时期的镜检。,花粉,(hufn),发育时期的检测,1压片染色法,A、醋酸洋红：100ml，45%醋酸水溶液参加250ml烧杯，酒精灯上加热到沸后，慢慢参加2g洋红粉末，再加热10分钟，冷却后参加数滴2的铁明矾溶液(rngy)2g硫酸铁钾或硫酸铁铵加水至100ml，暗红色即可，滤纸过滤入棕色瓶中，置冰箱保存。,B、碘碘化钾：1g碘、2g碘化钾加水稀释至100ml。,（,2,）压片染色法与花器官形态特征结合法,花粉单核晚期的烟草花蕾花萼与花冠等长,Different flower stages as used in anther culture.Stage 2 is the optimum stage of development for use in tobacco anther culture,泉 州 师 范 学 院生物,第三十四页，共六十七页。,花粉植株的形态,(xngti),发生方式？,1、器官发生(fshng)型,花粉-多细胞花粉粒-细胞团愈伤组织-继代培养-单倍体植株。,2、胚状体发生型,花粉-多细胞花粉粒-进一步培养-胚壮体-释放-植物体。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第三十五页，共六十七页。,花粉培养,(piyng),过程,花粉培养,从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分,化启动发育为单倍体植株的技术。,特点(tdin):它可以防止花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤,组织的干扰，可以获得大量的花粉植株。,花粉的别离与纯化：,别离法：自然(zrn)散落法、挤压法、机械游离法磁力搅拌,纯 化：用不同孔径的无菌筛子除杂。,茄子用270目screen,泉 州 师 范 学 院生物,第三十六页，共六十七页。,微室培养,(piyng),平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形,成花粉胚状体，最终分化为植株。,液体培养:悬浮培养，通气性差。,双层培养：上-液体+下-固体,看护(knh)培养：花粉-滤纸-固体培养基,微室培养：,条件培养：在花药培养基中参加失活的花药提取物。,花粉,(hufn),培养的方式：,泉 州 师 范 学 院生物,第三十七页，共六十七页。,根本(jbn)培养基,植物,(zhw),种类不同对培养基的要求不同。如：,值得一提的是培养基中高浓度的,NH,4,+,显著抑制花粉愈伤组织形成,(xngchng),。铁对花粉胚发育很重要。,培养基,泉 州 师 范 学 院生物,第三十八页，共六十七页。,植物,(zhw),激素的种类和浓度,必须结合植物种类和器官发生方式,(fngsh),来考虑,细胞分裂素和,CM,促进花粉分化成胚状体，生长素类尤其是,2,4-D,促进愈伤组织形成,(xngchng),，但,2,4-D,抑制愈伤组织分化成胚状体。,泉 州 师 范 学 院生物,第三十九页，共六十七页。,分化培养：根据培养目的,(md),，调节植物激素,分化培养：降,auxin,提,cytokinin-,有利于芽的形成,壮苗培养：同时,(tngsh),下降，有利于胚状体的正常生长。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十页，共六十七页。,花药离体培养中维持培养基渗透压主要依赖于糖，启动小孢子细胞脱分化,(fnhu),对糖的要求，单子叶植物比双子叶植物高。,石刁柏花药培养中，对多细胞花粉粒的诱导,(yudo),效果,3w,8w,蔗糖种类,(zhngli),和浓度的筛选,泉 州 师 范 学 院生物,第四十一页，共六十七页。,添加物,CM,、,LH,、,CH,玉米汁、马铃薯汁、酵母提取液、氨基酸等对提高花粉愈伤组织,(zzh),和胚状体诱导率、促进其生长有良好效果。,活性炭能促进胚状体发育，提高花粉植株产量。主要是吸附培养基中抑制,(yzh),生长的有害物质。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十二页，共六十七页。,1)花药(huyo)培养形成单倍体植株。但花药(huyo)中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。,2经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。,3激素对倍性变化有很大影响。,花粉,(hufn),植株的倍性,诱导,(yudo),单倍体植株的倍性,通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。,泉 州 师 范 学 院生物,第四十三页，共六十七页。,单倍体的鉴定,(jindng),方法,鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法,(fngf),有：,形态鉴定,结实性鉴定,染色体数目鉴定,遗传标记鉴定。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十四页，共六十七页。,单倍体植株,(zhzh),的染色体加倍,单倍体植株染色体的加倍方法：,1.,自然加倍,2.,人工加倍,3.,从愈伤组织,(zzh),再生,草莓,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十五页，共六十七页。,1人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等。,秋水仙素是由地中海生长的一种百合科植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质(wzh)。能溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。,1小苗浸泡加倍,2顶芽或腋芽处理加倍,3培养基加倍,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十六页，共六十七页。,单倍体在植物育种中的应用,1,、单倍体育种的概念,(ginin),指将具有单套染色体的单倍体植物，加倍,-,纯合二,倍体,-,选出具有优良性状的个体,-,繁育成新品,种；或选出具有单一优良性状的个体,-,育种的原始,材料，称之为,-,单倍体育种,相关,(xinggun),阅读,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十七页，共六十七页。,2、单倍体育种的优越性,控制杂种别离，短育种年限。加速F1代杂合体的纯化。,提高常规育种的效率(xio l),有利于隐性性状的选择,快速获得自交系的超雄株,其他：如提纯复壮,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十八页，共六十七页。,控制杂种别离，短育种年限，加速(ji s)F1代杂合体的纯化,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第四十九页，共六十七页。,提高,(t go),常规育种的效率,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十页，共六十七页。,提高常规,(chnggu),育种的效率,2,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十一页，共六十七页。,有利于隐性性状,(xngzhung),的选择,A,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十二页，共六十七页。,快速,(kui s),获得自交系的超雄株,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十三页，共六十七页。,单倍体育种,(y zhng),的研究进展,1964,年，印度,Guha,和,Maheshwari,对毛叶曼陀罗的花药进行培养并获得了单倍体植株,(zhzh),，从此以后，这项技术被迅速推广。,毛叶曼陀罗,【,功 效,】,：定喘，风湿,(fn sh),痹痛，脚气，疮疡疼痛。并作外科手术麻醉剂。,【,性味归经,】,：辛，温，有毒。,【,处方名,】,：洋金花、曼陀罗花,【,拉丁名,】,：毛曼陀罗,Datura innoxia Mill.,泉 州 师 范 学 院生物,第五十四页，共六十七页。,1、水稻 我国的水稻花培新品种主要有中国科学院李梅芳培育的“中花系列(xli)丰产优质的粳稻新品种，还有各省、地农业院校和科研院所培育出的不同物点的粳稻和糯稻新品种，如晚熟粳稻“朝花矮、“晚粳11号广西韩光禧，中晚熟抗病粳稻“浙农大40号、“45号，早熟籼稻“赣早籼11号江西农科院等。,2、小麦 中科院遗传所育成的“花培1号，北京农林科学院的胡道芬等,用复合杂交F1代的花粉育成了第一个冬小麦品种“京花1号，接着又育,成了京花3号、5号等品种，以后，全国各地的农科院所也取得了丰硕(fn shu)的成果。,中国,(zhn u),主要农作物,第五十五页，共六十七页。,3、玉米 广西玉米研究所杭玲等育成了玉米的花培品种“桂三1号。,此外，在其他(qt)作物上也取得了一系列的成果，如在烟草上育成了“单育1号，甜椒上育成了“海花3号等这些成果都是通过单倍体育种获得的。,甜椒,烟草,玉米(ym),泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十六页，共六十七页。,花粉,(hufn),孢子体概念的建立,植物有性生殖时，精细胞和卵细胞融合形成二倍体的合子(hz)，合子反复有丝分裂形成胚，“胚是一株幼小植物，称孢子体。那么“合子 是孢子体世代的一个原始细胞，合子的第一次有丝分裂，也就是第一次孢子体有丝分裂。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十七页，共六十七页。,离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始(yunsh)细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，尽管它是单倍性的。,根据上述概念，我们把花粉形成植株的途径，称为“花粉孢子体发育途径，这是相对于配子体发育途径而言的。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十八页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第五十九页，共六十七页。,五、花粉,(hufn),孢子体的发育途径,1,、,A,途径,(tjng),2,、,B,途径,3,、,C,途径,在花粉粒发生有丝分裂,(yu s fn li),前称为,小孢子,，以后就称为,花粉粒,。,泉 州 师 范 学 院生物,第六十页，共六十七页。,A,途径：花粉孢子体第一次有丝分裂，起源于花粉的营养细胞,(,营养核,),、即发生在已经经过第一次配子体有丝分裂的花粉中，分裂是非,(shfi),均等的。花粉孢子体第一次有丝分裂后的衍生细胞，再经过几次有丝分裂，形成多细胞花粉粒，进一步发育成多细胞团，撑破花粉壁，形成胚状体。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六十一页，共六十七页。,B,途径：花粉孢子体第一次有丝分裂，发生在单核小孢子中，即发生在雄配于体第一次有丝分裂之前，分裂是均等的并接着发生细胞壁将小孢子分隔成两个大致相等的营养型细胞。这两个细胞再经过,(jnggu),几次分裂后，形成多细胞花粉，撑破花粉壁以胚状体或愈伤组织形式释放出来。花粉孢子体第一次分裂后的细胞分裂又有三种情况。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六十二页，共六十七页。,C,途径：花粉孢子体第一次分裂，发生在已经,(y jing),进行过第一次配子体有丝分裂的花粉中,(,具有营养核和生殖核,),。营养核和生殖核先发生核融合，然后再进行花粉孢子体的第一次有丝分裂，发育成花粉植株。,C,途径的特点是生殖核和营养核共同参与花粉孢子体的形成，生殖核是有功能的。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六十三页，共六十七页。,胚,状,体,发,生,型,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六十四页，共六十七页。,谢 谢！,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六十五页，共六十七页。,泉 州 师 范 学 院生物,(shngw),第六十六页，共六十七页。,内容,(nirng),总结,泉 州 师 范 学 院生物。接种：用消过毒的镊子或接种环将花药接种于愈伤诱导培养基上。双核期：双核早期，双核晚期。梨四分孢子期为26.3，单核双核期为40。花粉-多细胞花粉粒-进一步培养-胚壮体-释放-植物体。从花药中游离,(yul),出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分。植物种类不同对培养基的要求不同。倍体-选出具有优良性状的个体-繁育成新品。型,第六十七页，共六十七页。,