第五章种子的扩大培养.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章种子的扩大培养,指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态得菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定发酵产量高、数量充足、无污染得生产菌种得过程。,第一节 种子扩大培养得目得与要求,种子扩大培养,种子扩培得目得,接种量得需要,菌种得驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,作为种子得准则,细胞生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长,迟缓期短;,生理性状稳定;,菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐得要求;,无杂菌污染;,保持稳定得生产能力。,4、1 种子得制备工艺,实验室阶段:所用得设备为培养箱、摇床等实验室常见设备,在工厂中培养过程一般都在菌种室完成。,生产车间阶段:种子培养在种子罐里面进行,一般在工程归为发酵车间管理。,一、实验室种子得制备,一般采用两种方式:,对于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快得菌种可以采用固体培养基培养孢子,孢子可直接作为种子罐得种子。,对于产孢子能力不强或孢子发芽慢得菌种,可以用液体培养法,获得菌丝体,作为种子。,10,大家应该也有点累了,稍作休息,大家有疑问得,可以询问与交流,、斜面,(AS1、299),培养基:蛋白胨,1%,牛肉膏,1%,氯化钠,0、5,琼脂,2%,pH 7、0-7、2,培养基特点:有利于菌体得生长,原料比较精细,培养条件:,32,生长,18-24,小时,对于不产孢子与孢子发芽慢得微生物,获得一定数量与质量得菌体,如谷氨酸得种子培养。,、,一级种子(摇瓶),培养条件:于,1000ml,三角瓶中,装液,200-250ml,32,培养,12,小时。,培养基:葡萄糖,2%,尿素,0、5%,玉米浆,2、5%,K,2,HPO,4,0、1%,培养基特点:有利于菌体得生长,所使用得原料已经基本接近于发酵培养基,对于不产孢子与孢子发芽慢得微生物,、,二级种子,(,种子罐,),培养条件:在种子罐中培养(容积为发酵罐得,1%(10%),),32,培养,7-10,个小时,培养基:与一级种子相似,其中葡萄糖用水解糖代替,浓度为,2、5%,培养基得特点:长菌体,更接近于发酵培养基,种子得质量要求:,10,8,-10,9,个,/ml,大小均匀,呈单个或八字排列,PH 7、0-7、2,时结束,6、887、0-7、2,活力旺盛,获得一定数量与质量得孢子,与菌丝体培养相比步骤少,因而更容易获得量与质稳定得种子,但操作繁琐。,对于产孢子得微生物,获得一定数量与质量得菌丝体,便于操作,但需要更仔细得控制。,2,、培养基选择得原则,有利于菌体得生长,对孢子培养基应该就是有利于孢子得生长。,在原料方面,实验室种子培养阶段,规模一般比较小,因此为了保证培养基得质量,培养基得原料一般都比较精细。,二、生产车间种子制备,种子罐得培养基成分原则为采用易被菌利用得成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等,如果就是需氧菌,同时还需供给足够得无菌空气,并不断搅拌,使菌(丝)体在培养液中均匀分布,获得相同得培养条件。,1,、培养物得选择原则,在生产车间阶段,最终一般都就是获得一定数量得菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好得发酵结果,菌丝体比孢子要有利:,2,、培养基选择得原则,目得:获得一定数量与质量得菌体,培养基首先考虑有利于孢子得发育与菌体得生长,营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面:不如实验室阶段那么精细,基本接近于发酵培养基,:,一就是成本 二就是驯化,例:柠檬酸发酵,以蔗糖为原料,成分 斜面 种子罐 发酵,麦芽汁 麦汁,蔗糖,2、5-5%20%,NH,4,NO,3,0、225%0、11%,K,2,HPO,4,0、03%,MgSO,4,、H,2,O 0、025%0、025%,KCl 0、015%,琼脂,2%,3、种子罐得作用:,使孢子发芽,生长繁殖成菌(丝)体,接入发酵罐能迅速生长,达到一定得菌体量,以利于产物得合成。,种子罐级数:指制备种子需逐级扩大培养得次数,取决于:,菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度;,所采用发酵罐得容积,4,、种子罐级数得确定,谷氨酸:三级发酵,一级种子(摇瓶)二级种子(小罐)发酵,青霉素:三级发酵,一级种子(小罐)二级种子(中罐)发酵,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数,但有时工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,发酵级数确定得依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量得影响,级数大,难控制、易染菌、易变异,管理困难,一般,2-4,级。,在发酵产品得放大中,反应级数得确定就是非常重要得一个方面,细菌:生长快,种子用量比例少,级数也较少,二级发酵。,茄子瓶种子罐发酵罐,霉菌:生长较慢,如青霉菌,三级发酵,孢子悬浮液一级种子罐(27,C,40小时孢子发芽,产生菌丝)二级种子罐(27,C,1024小时,菌体迅速繁殖,粗壮菌丝体)发酵罐,放线菌:生长更慢,采用四级发酵,酵母:比细菌慢,比霉菌,放线菌快,通常用一级种子,种子级数越少越好,可简化工艺与控制,减少染菌机会,种子级数太少,接种量小,发酵时间延长,降低发酵罐得生产率,增加染菌机会,虽然种子罐级数随产物得品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐得培养条件,加速了孢子发芽及菌体得繁殖,也可相应地减少种子罐得级数。,确定种子罐级数需注意得问题,5,、接种量得确定,移入种子得体积,接种量,接种后培养液得体积,接种量过多,菌丝生长过快、溶氧不足,衰老细胞增加等,发酵后劲不足,种量过少延长发酵周期,形成异常形态,而且易造成染菌。,以生产菌种在发酵罐中得繁殖速度为依据,接种量得大小直接影响发酵周期。,双种:两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种:一部分种子来源于种子罐,一部分来源于发酵罐。,过大过小都不好,最终以实践定,如大多数抗生素为,7-15%,。但就是一般认为大一点好。,采用被孢霉进行,亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体,接种量对菌体形态与产,亚麻酸得影响,杨博,中国油脂,2002,研究发现,采用被孢霉进行,亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体得形态,从而影响菌体干重与,亚麻酸产量。,不同接种量影响菌体得生长与发酵,发酵前期发酵液作为种子,发酵指数明显提高,发酵后期菌体自溶明显,影响提炼收率,20%,种子罐,10%,发酵罐前期发酵液效果最好,6,、种龄,指种子罐中培养得菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时得培养时间。,种龄短:菌体太少;种龄长:易老化,。,原则:对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相对较大,但就是最终由实验结果定。,大量地接入培养成熟得菌种得优点:,缩短生长过程得延缓期,因而缩短了,发酵周期,提高了设备利用率,节约发酵培养得动力消耗,有利于减少染菌机会,舒琴,林产化学与工业,2004,镜检:,24,小时多个杆菌首位相连成线形,处于繁殖旺盛期,30,小时开始出现芽孢,4、2 影响种子质量得因素,原材料质量,培养温度,湿度,通气与搅拌,斜面冷藏时间,培养基,pH,原材料质量,原材料质量波动引起种子质量不稳定,原材料质量波动得主要原因:无机离子含量不同(微量元素,Mg,2+,、Cu,2+,、Ba,2+,能刺激孢子得形成,磷含量太多或太少也会影响孢子得质量)。,培养温度,温度过低,菌种生长发育缓慢,温度过高会使菌丝过早自溶,在制备土霉素生产种子过程中,高于,37,培养时,孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢,氨基氮回升提前,菌丝过早自溶,效价降低等现象。,湿度,湿度低,孢子生长快;,湿度大,孢子生长慢,制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时,发现,在含有少量水分得试管斜面培养基下,部孢子长得较好,而斜面上部由于水分迅速,蒸发呈干瘪状,孢子稀少,通气与搅拌,足够得通气量,以保证菌种代谢正常,提高种子得质量,搅拌可提高通气效果,促进生长繁殖,过度搅拌导致培养液大量涌泡,液膜表面得酶易氧化变性,泡沫过多增加染菌机会,增加能耗。,丝状微生物不宜剧烈搅拌。,斜面冷藏时间,对孢子得生产能力有较大影响,冷藏时间越长,生产能力下降越多,链霉素生产中,斜面孢子在,6,冷藏两,个月后得发酵单位比冷藏一个月得降低,18,比冷藏,3,个月得降低,35,。,培养基,培养种子得目得:,扩大培养,增加细胞数量;,同时也必须培养出强壮、健康、活性高得细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,有较完全与丰富得营养物质,糖分少,需充足氮源与生长因子,无机氮源比例大;,各种营养物质得浓度不必太高;,供孢子用得种子培养基,可添加易被吸收利用得碳源与氮源;,应考虑与发酵培养基得主要成分相近。,种子培养基特点,pH,选择最适种子培养,pH,得原则就是获得最大比生长速率与适当得菌量,培养最后一级种子得培养基得pH应接近于发酵培养基得pH,以便种子能尽快适应新得环境,