分子生物学实验技能.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学实验技能,邢晓为 副研究员,中南大学湘雅三医院医学实验中心,邢晓为,邢晓为,一、分子生物学基本概念,在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子,(,核酸、蛋白质,),的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程,如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。,二、分子生物学主要研究内容,核酸的分子生物学,蛋白质的分子生物学,细胞信号转导的分子生物学,1.,核酸的分子生物学,核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（,molecular genetics,）是其主要组成部分。由于,50,年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸,/,基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（,centraldogma,）是其理论体系的核心。,2.,蛋白质的分子生物学,蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。,3.,细胞信号转导的分子生物学,细胞信号转导的分子生物学研究,细胞内、细胞间信息传递的分子基础,。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。,信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。,信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。,中心法则,DNA,RNA,蛋白质,突变,转录调控,翻译修饰,三、分子生物学的临床应用,亲子鉴定,基因诊断,产前诊断,植入前诊断（,PGD,）等,亲自鉴定,基因诊断,产前诊断,图,1,应用,AC,，,AB,引物,PCR,扩增,地贫风险胎儿结果,1,、,2,为正常人,;3,患儿父亲,;4,患儿,;5,患儿母亲,;6,胎儿脐带血标本,;M Marker,地中海贫血基因诊断与遗传咨询,邢晓为 李麓芸 傅俊江 等,【,摘要,】,目的 研究就诊病人中地中海贫血患者的基因突变类型，为更好地开展地中海贫血的产前诊断和遗传咨询工作奠定基础。方法 应用,PCR,技术对,9,例,地中海贫血患者及,1,例风险胎儿进行缺失检测,;,应用等位基因扩增突变不应系统（,amplification refractory mutation system,，,ARMS,）技术对,25,个,地中海贫血家系（其中,22,例产前诊断）及,7,例散发病例的,珠蛋白基因,nt-28,（,AG,）、,CD17,（,AT,）、,CD41-42,（,-CTTT,）、,CD71-72,（,+A,）、,IVS-2nt654,（,CT,）进行检测。结果,地贫,10,例标本中,9,例检测到了大片段缺失。,地贫中，,nt-28,（,AG,）,2,例，,CD17,（,AT,）,11,例，,CD41-42,（,-CTTT,）,21,例，,CD71-72,（,+A,）,0,例，,IVS-2nt654,（,CT,）,23,例。结论 在就诊患者中，,地贫主要以点突变为主，其中有三个突变热点，分别为,CD41-42,（,-CTTT,）、,IVS-2nt654,、,CD17,（,AT,）。,地贫的基因改变主要是以大片段缺失为主。该研究将有助于开展地中海贫血病的遗传咨询工作，为进行产前诊断和遗传优生工作奠定基础。,关键词 地中海贫血 基因诊断 产前诊断 等位基因扩增突变不应系统 遗传咨询,胚胎移植前遗传学诊断（,PGD,）,从发育到,4-8,细胞的胚胎中，取出一个细胞进行细胞遗传学或分子遗传学检查，再将检查正常的胚胎放到子宫中，以达到优生优育的目的。,四、分子生物学基础知识,DNA,（,Deoxyribonucleic acid,）,:,脱氧核糖核酸,是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料,DNA,双螺旋结构,1953,年,沃森,和,克里克,提出了,DNA,的双螺旋结构,开创了分子生物学的新纪元。并在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动,gDNA,（基因组,DNA,）,plasmid DNA,（质粒,DNA,）,mtDNA,（线粒体,DNA,）,ssDNA,(,鲑鱼精,DNA),cDNA,(,互补,DNA),常见的,DNA,符号,RNA,RNA,(,RiboNucleic,Acid),：核糖核酸，是由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称,RNA,。,RNA,普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。,RNA,和蛋白质生物合成有密切的关系。在,RNA,病毒和噬菌体内，,RNA,是遗传信息的载体。,RNA,一般是单链线形分子,;,也有双链的如呼肠孤病毒,RNA,；环状单链的如类病毒,RNA,；,1983,年还发现了有支链的,RNA,分子。,RNA,由核糖,核苷酸,经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由,磷酸,，,核糖,和,碱基,构成。,RNA,的碱基主要有,4,种，即,A,腺嘌呤，,G,鸟嘌呤，,C,胞嘧啶，,U,尿嘧啶。其中，,U,（尿嘧啶）取代了,DNA,中的,T,胸腺嘧啶而成为,RNA,的特征碱基。,在细胞中，根据结构功能的不同，,RNA,主要分三类，即,tRNA,（转运,RNA,）,rRNA,（核糖体,RNA,）,mRNA,（信使,RNA,）。,mRNA,是合成,蛋白质,的,模板,，内容按照细胞核中的,DNA,所转录；,tRNA,是,mRNA,上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；,rRNA,是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。,常见的,RNA,符号,mRNA,信使,RNA,tRNA,转运,RNA,rRNA,核糖体,RNA,cRNA,(,互补,RNA,可用分子作杂交探针,),hnRNA,(,基因转录初产物,在细胞核内不稳定,),RNAi,shRNA,miRNA,(,真核生物内源性的小分子单链,RNA,，通常,18-25,nt,长，能够与靶,mRNA,特异性的碱基配对引起靶,mRNA,的降解,),基 因,基因：,是位于染色体上的遗传功能单位，是编码蛋白质（酶）或,RNA,的一段双链,DNA,片段。,基因座（,locus/loci,）：,每一对基因分别位于来自双亲的染色体的同一位置上，这个位置称为,。,等位基因：,一对同源染色体同一基因座上的一对基因称为一对等位基因（,allele,）。,复等位基因：,在一个群体中，每一个基因座位上可以有,2,个以上等位基因，这就是复等位基因（,multiple allele,）。,假基因（,pseudo gene,）：,与功能基因相似的序列，但由于突变等原因，不能转录或能转录但不能剪接形成成熟,mRNA,分子。这些序列称为,。,超基因（,super gene,）,:,是指作用于一种性状或作用于一系列相关性状的几个紧密连锁的基因。,基因外显子、内含子,基因一般结构,5,3,ATG,TAA,TGA,TAG,外显子：,出现在成熟,mRNA,分子中的基因序列。,内含子：,不出现在成熟,mRNA,分子中的基因序列,。,NCBI,中基因序列查找,常见物种名称,Homo sapiens (,人类,),Sus,scrofa,(,猪,),Rattus,norvegicus,(,大鼠,),Mus,musculus,(,小鼠,),Bos,taurus,(,牛,),Drosophila,melanogaster,(,果蝇,),Caenorhabditis,elegans,(,线虫,),Xenopus,tropicalis,(,青蛙,),Fugu,rubripes,(,真菌,),基因阅读框的识别,五、分子生物学基本技术,PCR,技术：,聚合酶链式反应（,Polymease,Chain Reaction,，,PCR),是体外酶促合成特异,DNA,片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的,DNA,得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。,技术原理：双链,DNA,在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在,DNA,聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。,PCR,METHOD,DENATURATION STAGE,High temperature separates the two strands.,PCR,METHOD,ANNEALING STAGE,Primer length is usually 20 nucleotides,.,PCR,METHOD,EXTENSION STAGE,Thermostable,polymerase adds,dNTPs,one at a time at this stage,.,PCR,METHOD-CYCLING,The average number of cycles=30 for efficiency reasons.,2,30,=1.07 X 10,9,copies,DNA,Cycle 1 2 3 4 5 6 ,Products 2 4 8 16 32,After the first two cycles,fragments with the correct length begin to be amplified.,(dictated by the placement of the primers),平台期与平台效应,指经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，,DNA,片段不再呈指数增长，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。,PCR,反应曲线,平台效应,与下列因素有关：,引物、,dNTP,浓度降低，掺入速度减慢,酶与模板的比例下降：酶量减少，模板增加,产物的再结合,PCR,扩增中的基本成份,H,2,O,：一般采用双蒸水；,PCR,反应缓冲液；,Mg,2+,Taq,酶或其他聚合酶；,底物（,dNTP,:,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,）,引物,模板,PCR,反应体系与反应条件,dH,2,O 6.1,L,10,PCR,反应缓冲液,1,L,25,mM,Mg,2+,0.8,L,Taq,酶或其他聚合酶,0.2,L,2.5,mM,dNTP,1,L,引物,0.2,L,模板,0.7,L,10,L,95,230,94,40,58-64,40,95,40,72,5,4,hold,35,cycles,PCR,反应体系的优化,1.,Taq,DNA,聚合酶的浓度：,1-5U/100,l,酶,浓度过高可引起非特异性扩增；浓度过低则合成产物量减少,2.,dNTP,的浓度：,20-200mol/L,注意,4,种,dNTP,的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低,PCR,产物的产量。,dNTP,能与,Mg,2+,结合，使游离,Mg,2+,浓度降低,3.Mg,2+,的浓度,：,0.5-2.5mmol/L,在一般的,PCR,反应中，各种,dNTP,浓度为,200umol/L,时，,Mg,2+,浓度为,1.5,2.0,mmol,/L,为宜。,Mg,2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低,Taq,DNA,聚合酶的活性，使反应产物减少。,4.,引物的浓度：,0.1-0.5mol/L,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,5.,模板的浓度及质量：,100-200ng/100l,模板核酸的量与纯化程度，是,PCR,成败 与否的关键环节之一。,PCR,反应体系的优化,1.,引物长度及碱基分布：,引物长度 一般为,15-30bp,，常用为,20bp,左右。,ATCG,最好随机分布，避免,5,个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。,2.G+C,含量：,以,40-60%,为宜，,G+C,太少扩增效果不佳，,G+C,过多易出现非特异条带。,3.,引物自身及引物之间：,避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是,3,端的互补，否则会形成引物二聚体，影响引物与模板的复性结合。,4.,严格要求配对,:,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败，引物,3,端尽量避免为,T,。,引物设计应遵循以下原则：,引物设计常用的软件,Primer 3,Primer 5,PCR design,此外，,DGGE,，甲基化,PCR,，,RNAi,引物需要在专业网站中用特殊的软件设计。,Primer3,pick primers from a DNA sequence,disclaimer,bugs?suggestions?,source code,cautions,Number To Return:,Max 3 Stability:,Max,Mispriming,:,Pair Max,Mispriming,:,Primer3,pick primers from a DNA sequence,Paste source sequence below(5-3,string of,ACGTNacgtn,-other letters treated as N-numbers and blanks ignored).FASTA format ok.Please N-out undesirable sequence(vector,ALUs,LINEs,etc.)or use a,Mispriming,Library(repeat library):,Pick left primer or use left primer below.,Pick hybridization probe(internal,oligo,)or use,oligo,below.,Pick right primer or use right primer below(5-3 on opposite strand).,PCR,产物的检测方法,琼脂糖凝胶电泳；,聚丙烯酰胺凝胶电泳法；,直接测序；,分子杂交；,限制性内切酶酶切分析；,琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶,0.1,60kb 1.82,时，说明,RNA,中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用,Tris,作为缓冲液检测吸光度时，,R,值可能会大于,2,（一般应该是,2.2,的）。当,R2.2,时，说明,RNA,已经水解成单核酸了。,RNA,的电泳检测,一般的，,RNA,的电泳都是用变性胶进行的。但如果仅仅是为了检测,RNA,的质量，没有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的在于检测,28S,和,18S,条带的完整性和他们的比值，或者是,mRNA smear,的完整性。一般的，如果,28S,和,18S,条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且,28S,的亮度在,18S,条带的两倍以上，我们认为,RNA,的质量是好。,RNA,的质量控制,RNA,的电泳检测图谱,保温试验：,确认,RNA,溶液中有没有残留的,RNA,酶的方法。按照样品浓度，从,RNA,溶液中吸取两份,1000,ng,的,RNA,加入至,0.5 ml,的离心管中，用,pH7.0,的,Tris,缓冲液补充到,10l,的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入,70,的恒温水浴中，保温,1 h,。另一份放置在,-20,冰箱中保存,1 h,。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法,2,中的条件），则说明,RNA,溶液中没有残留的,RNA,酶污染，,RNA,的质量很好。相反的，如果,70,保温的样本有明显的降解，则说明,RNA,溶液中有,RNA,酶污染。,RNA,的质量控制,RNA,酶活性的控制,为了获得高质量的真核细胞,mRNA,，必须使用,RNA,酶抑制剂或采用破碎细胞和灭活,RNA,酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的,RNA,酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量,RNA,酶也很重要。,破碎细胞和灭活,RNA,酶同步进行的方法：,用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。,RNA,酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含,RNA,酶的胰腺中，提取完整无损的,RNA,。,问题,可能原因,解决方法,产量太低,样本裂解或匀浆不充分,延长匀浆时间,RNA,沉淀溶解不充分,65,加热可促进溶解,A260/A2801.65,匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小,增加,RNA,抽提试剂用量,匀浆后，样本没有静置,室温静置,5,分钟，促进裂解反应,水相中可能有酚残留,吸取上清时应注意操作的正确性,RNA,沉淀溶解不充分,加热可促进溶解,测比值时，,RNA,溶解在,DEPC,水中，低的离子浓度和,PH,值增加了,280nm,的吸光值,比值时，采用,TE,溶液溶解,RNA,RNA,降解,取样操作不正确,取样后应立即抽提和冻存,样本保存不当,80,或液氮保存,液相中可能有,RNA,酶污染,采用,RNA,抑制剂,制胶时所用甲醛的,PH,值小于,3.5,试剂新鲜配制,DNA,污染,匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小,增加抽提液用量,蛋白、多糖污染,抽提时蛋白和多糖去除不彻底,RNA,沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀,RNA,原位杂交,(IN SITU HYBRIDIZATION),原位核酸分子杂交技术（,In situ nucleic acid molecular hybridization),简称原位杂交技术。是用标记的,DNA,或,RNA,为探针，在原位检测组织细胞内待定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为,DNA-DNA,杂交，,DNA-RNA,杂交和,RNA-RNA,杂交,。,探针的类型,1,.cDNA probe,：,杂交反应有较高的专一性。因其为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半数,DNA,链与特定的,mRNA,杂交，另一半,DNA,链则与,mRNA,竞争，并导致,DNA,链的自我“退火”（既重新形成双链）。,2,.mRNA probe,（互补的,RNA,）：为单链结构，杂交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。,3,.Oligonucleotide probe:,由,DNA,合成仪合成，制备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。,MAP-2-IR of cultured,hippocampal,neurons,400,NF-200-ir of cultured,hippocampal,neurons 400,研究思路,临床思维,：,疾病,表型,蛋白基因型基因突变,基础研究思路：,基因蛋白功能与疾病的关系基因诊断,/,基因治疗,课题思路,检测的目的：,突变、基因多态性、基因的表达、基因定位、基因表达调控、蛋白相互作用等,方法的选择,：,先了解目前检测都有哪些方法，根据实验目的、实验时间、经费选择合适的方法。,PCR,检测,DNA,RT-PCR,检测,mRNA,Northern blot,检测,mRNA,Southern blot,检测,DNA,Western blot,检测蛋白质,组织原位杂交 检测,mRNA,IP,检测蛋白质之间的相互作用,Pull-down,检测蛋白质之间的相互作用,酵母双杂交 检测蛋白质之间的相互作用,THANKS,