专题5--课题1--DNA的粗提取与鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5.1 DNA的粗提取与鉴定,一、基础知识,（一）提取DNA的方法,1.提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2.提取DNA的基本思路,提取,DNA,，去除其他成分,利用,DNA,与,RNA,、,蛋白质,和,脂质,等,在物理和化学性质方面的差异,DNA,在,NaCl溶液中,的溶解性,DNA和蛋白质等成分,在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，,选择适当的盐浓度,就能使DNA充分溶解，,而使杂质沉淀；,或者让其他成分溶解，,DNA析出,3.DNA等大分子的理化性质,DNA不溶于酒精溶液,DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,试剂：,（二）DNA的鉴定,条件：,二苯胺,沸水浴条件下，DNA遇,二苯胺,被染成,蓝色,沸水浴,现象：,还可以用什么试剂？,甲基绿 +DNA-绿色,（一）,实验材料的选取,（二）,破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）,除去滤液中的杂质(纯化),（四）,DNA的析出与鉴定,二、实验设计,（一）实验材料的选取,从下列材料中选取23种,原则：,菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；,鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；,在液体培养基中培养的大肠杆菌,凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,选用DNA含量相对较高,且易破碎,的组织,。,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,2、植物细胞,容易破碎,鸡血细胞溶液：,加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液,想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，,水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；,加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA,。,经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,为了纯化提取的,DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？,答：可能含有,核,蛋白、多糖和RNA等杂质,。,想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二：利用蛋白酶分解杂质,中的,蛋白,质,，使提取,的DNA与蛋白质分开；,方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与DNA分离,。,（四）,DNA的析出与鉴定,向滤液中加入,与滤液,体积相等,的,冷却,的,酒精溶液,(体积分数95)，静置23min，溶液中会出现,白色,丝状物,，,粗提取DNA,用玻璃棒,沿一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,。,1、DNA的析出,2.DNA的鉴定,向两支试管中分别加入,2mol/L NaCl,溶液5ml,；,向,其中一支试管中加入,提取到的白色,丝状物,，,并搅拌；,向两支试管,各加入,二苯胺,试剂4ml,；,混匀后，置于沸水浴中加热5min,；,待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化,。,观察现象：,溶解丝状物的溶液,逐渐,变为,蓝色,（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的,柠檬酸,钠,溶液（抗凝剂）,100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，,静,置一天，使血细胞自行沉淀。,或,将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。,用吸管除去上部的澄清液,（血浆）,，就可以得到鸡血细胞液。,过程,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,，血浆中不含DNA.,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中,加入蒸馏水,20 mL，同时用玻璃棒,沿一个方向,充分搅拌5 min，,使血细胞加速破裂。,然后，用放有,纱布的漏斗,将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,溶解细胞核内的DNA,将物质的量浓度为,2 mol,/L,的,氯化钠,溶,液,40mL加入到滤液中，并用,玻璃棒沿一个方向搅拌,1min，使其混合均匀，这时,DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓,加入蒸馏水,，同时用玻璃棒,沿一个方向,不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。,当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水,（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）,。,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,。,注意事项：,滤取含DNA的粘稠物,用放有,多层纱布,的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，,含 DNA的粘稠物被留在纱布上,。,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内,注入,的物质的量浓度为,2 molL的,氯化钠,溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃,棒,沿一个方向,不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,。,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有,两层纱布,的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,.,提取含杂质较少的DNA,在上述滤液中，加入,等体积,冷却的、体积分数为 95,的,酒精,溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用,玻璃棒,沿一个方向轻轻,搅拌，,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,。,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,向两支试管中分别加入,2mol/L NaCl,溶液5ml,；,向,其中一支试管中加入,提取到的白色,丝状物,，,并搅拌；,向两支试管,各加入,二苯胺,试剂4ml,；,混匀后，置于沸水浴中加热5min,；,待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化,。,观察现象：,溶解丝状物的溶液,逐渐,变为,蓝色,DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,。,（3）DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答：DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,。,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次,：,第一步,使,细胞吸水胀破,，释放DNA.,第二次,：,第三步,降低NaCl溶液浓度，,使,DNA黏稠物析出,.,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，,第二次,要滤,取,黏稠物，所以要使用,多层纱布,，,第一次和第三次,过滤,均要滤液，使用的纱布为,12层,三次过滤,第一次,：,第一步,DNA存在于滤液里,第二次,：,第四步,DNA被留在纱布上,第三次,：,第六步,DNA存在于滤液里,两次析出,第一次,：用0.14 molL 的NaCI,溶液,.,第三步,第二次,：用冷却的95的酒精,.,第七步,六次搅拌：,第一、二、三、五、七,、八,步,其中除第八步外，其余均要,朝一个方向,搅拌,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,幻灯片 18,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 m1,L,的,NaCI,溶液,40,mL,幻灯片 18,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,5,.,滤取含,DNA,的黏稠物,6,.,将,DNA,的黏稠物再溶解,2 mol,L,的,NaCl,溶液,20 mL,7,.,过滤含,DNA,的,NaC,l,溶液,8,.,提取含有杂质较少的,DNA,冷却的,95,的酒精,50 mL,幻灯片 18,A,:,(,1),向试管中加入,2,mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(,2),加入,DNA,(,3)4,mL,二苯胺试剂,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,2,mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(,2)4 m,L,二苯胺试剂,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,使,血细胞,吸水,破裂,，释放DNA,溶解,DNA,稀释,NaCl溶液,至0.14mol/L,使DNA最大限度地,析,出,使含,DNA的黏稠物留在纱布上,使含,DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含,DNA的滤液中的杂质,析出,DNA,A出现蓝色,B,无,蓝色,（二）案例二：以菜花为实验材料,进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇,(酒精),溶液放入冰箱,冷冻室,24 h,。,2、提取DNA的具体步骤,取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎,。,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min,。,研磨液的配制方法如下,：将10.1 g,Tris,加入到50 mL,蒸馏水,中，使其溶解，然后，用2 moL/L的,HCl,溶液调节pH至8.0，再加入8.76 g,NaCl,、37.2 g,EDTA,、20 g,SDS,。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL,。,Tris/HCl,:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈,稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）,。,EDTA,（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制,剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA,。,SDS,（十二烷基,硫酸,钠）：可以使蛋白质变性，,与DNA分离,。,过滤：,在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心25 min，取上清液放入烧杯中)。在4 冰箱中放置几分钟后，再,取上清液,。,沉淀：,将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的,预冷,酒精,溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒,缓缓,旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,。,三、操作提示,1、以血液为实验材料时，每100ml血液,中需要加入3g,柠檬酸钠，防止血液凝固,。,2、加入洗涤剂后，动作要,轻缓、柔和,，,否则容易产生大量的泡沫,，不利于后,续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒,搅拌时，动作要,轻缓,，,以免加剧DNA分,子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状,沉淀,。,3、,二苯胺,试剂要,现配现用,，否则会影,响鉴定的效果。,四、课题成果评价,（一）是否提取出了DNA,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,。,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,。,（二）分析DNA中的杂质,练习,1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。,答：提取DNA的,第一步是材料的选取,，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；,第二步是DNA的释放和溶解,，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；,第三步是DNA的纯化,，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；,最后一步是对DNA进行鉴定,，这是对整个实验的结果的检测。,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？,答：,提取蛋白质比提取DNA的难度大,。这是因为，与DNA相比，,蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活,；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取,没有一种统一的方法,，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。,A.稀释血液、冲洗样品,B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出,C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量,D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答：B,答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成(),A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液,中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答：D,