微生物检验流程与质量控制.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/1/3,#,微生物检验流程与质量控制,卢先雷,主要内容,常见标本的检验流程,血培养（无菌体液培养）,痰培养（以及其他呼吸系统标本）,尿培养,粪便培养,质量控制,人员能力,试剂与仪器（包括仪器校准、各项鉴定试验、药敏试验室内质控）,环节控制（全程质控）,首代分离培养基质量控制,常见标本的检验流程,血培养标准化操作流程,样本接收,推片法,制片,染色镜检,血培养仪增菌,阳性培养液涂片,一级报告,首代培养,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,痰培养标准化操作流程,样本接收,痰液洗涤,压片法制片,染色镜检,肉眼筛选,分类,镜下筛选,痰液消化,痰液接种,首代培养,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,尿培养标准化操作流程,样本接收,沉渣涂片,离心,镜下筛选,染色镜检,首代培养,（菌落计数）,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,粪便培养标准化操作流程,样本接收,镜下筛选,（粪便常规）,压片法,制片,染色镜检,选择性,增菌培养,首代培养,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,其他标本标准化操作流程,实用临床微生物检验与图谱,卫生部规范化操作流程图,质量控制,概念,狭义质量控制：对试剂和仪器的控制,广义质量控制：对所有影响试验结果可靠性的因素进行的全面质量控制,试验人员技术能力的控制,操作的标准化与试验结果判读的标准化,试剂的保存与正确使用,仪器的正确使用、定期维护与校准,鉴定试剂阴阳性结果的典型性与试剂的稳定性考察,药敏试验（纸片、,MIC,板卡、,E-test,试条、,MH,培养基等）的室内质控,严格但合理的首代分离培养基质控措施,流程中不同环节试验之间的相互印证,质量控制中的重点,人员能力的培训、考核与权限的授予,流程中不同环节试验之间的相互印证,首代分离培养基质控措施,药敏试验室内质量控制,人员能力的,培训、考核与权限的授予,在所有影响因素中，人的因素居于首位,临床微生物检验是一个智力因素占首要地位的行业，是真正意义上的诊断学。在欧美从属于临床病理的范畴,基础知识的扎实程度、临场实践能力的高低、自主学习能力的强弱直接影响工作质量的好坏,个人能力在报告质量中有直接而明显的体现,人员能力的,培训、考核与权限的授予,在微生物室对后进人员的培训考核是一项长期任务，对于人才梯队的形成和特殊能力的传承有着重要意义,根据每个人员能力的层次分别授予对应等级的权限对于控制微生物室整体质量，防范错误的发生，提高报告质量有确定的意义,流程中不同环节试验,之间的相互印证,建立全程质控的观点对于提高微生物检验质量意义重大,通过不同环节试验结果之间的推衍和反证可及时发现一些错误的存在，并及时进行纠正可防止错误报告的发出,不同环节之间的推衍与反证可让我们发现平时质控中难以发现的失控现象，便于我们制订相应的规则堵住漏洞，对于工作的持续改进有着重要的意义,首代分离培养基质控措施,目前国内有超过,10,家商品成品培养基制造商，由于生产工艺简单，技术壁垒较低，有无研发实力的公司都来趟这趟浑水，导致成品培养基市场非常混乱，质量良莠不齐,首代分离培养基是制约微生物检验阳性率的门户，分离到细菌是一切成功检验的前提条件。其质量的好坏直接影响微生物检验的整体质量。在“检验中”阶段，所有影响因素中，该因素所占的比重最大,药敏试验质控,过程控制,结果控制,药敏试验过程控制,扩散法,试验方法与条件,CLSI,推荐培养基：,普通营养要求细菌使用水解酪蛋白琼脂（,MHA,）平板,肺链使用含,5%,绵羊血的含血,MHA,嗜血杆菌使用,HTM,培养基,淋球菌使用含,1%,生长因子（不含,L-,半胱氨酸）补充剂的,GC,培养基,平皿大小：最小,90mm,，通常使用,150mm,平板,琼脂厚度,41mm,菌液浓度,0.5 McF,（约,1.510,8,CFU/ml,）,涂布方法：无菌棉签浸透菌液后稍微挤干，棉签与平板呈,30,左右的倾角密集左右来回涂布，完成一遍后旋转,120,后再涂，如此三次，最后绕边缘一次,纸片之间最佳间距,30mm,，不得低于,25mm,培养温度；,35,；重叠时不超过,3,个碟子,气体环境：普通细菌大气环境；嗜血杆菌、淋球菌、肺链置,CO,2,环境,培养时间：,18,小时,测量方法,透射光,葡萄球菌,利奈唑胺,苯唑西林,万古霉素,肠球菌,万古霉素,反射光,测量其他细菌与药物时,变形杆菌,忽略环内的迁徙生长,测量肉眼可见的明显抑菌区,忽略环边缘的微弱生长,环内生长现象,大肠药敏，被肠球菌污染,铜绿假单胞菌,耐药亚群,特殊处理方法,当受测抑菌环与旁边的融合时，选择完整部分测量,当受测抑菌环部分变形时，选择正常部分测量,扩散法药敏影响因素,培养基,pH,值,7.2-7.4,营养程度（肠球菌能生长）,厚度,抗生素拮抗剂含量（用,29212,监控）,钙镁离子含量、锌离子含量（用,27853,氨基糖苷类和亚胺配能结果监控）,菌悬液,浓度高抑菌环缩小,浓度低则扩大,细菌纯度,气体环境,普通细菌放,CO2,时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药,苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感,培养时间,粘液性铜绿需,48,小时,测量方法,稀释法,试验方法与条件,CLSI,推荐培养基：,普通营养要求细菌使用补充阳离子,MH,肉汤,肺链使用含,2%,冻融马血的,MH,肉汤,嗜血杆菌使用,HTM,肉汤,厌氧菌和微需氧菌使用布氏肉汤,淋病奈瑟菌推荐强化,GC,作琼脂稀释法,菌液浓度（,510,4,CFU/ml,）：,初始菌液,0.5 McF,（约,1.510,8,CFU/ml,）盐水稀释,200,倍，加入,0.1ml,菌液到含有,0.1ml,双倍浓缩的,MH,肉汤的微孔板中（或预先用标准浓度的,MH,肉汤稀释后再加到微孔中）,接种后应充分混匀，但不能有气泡产生,静置培养,培养温度；,35,气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置,CO,2,培养时间：,18,小时,结果读取：,见后面的幻灯：,常量稀释法,药敏试验的参考方法：,将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的,MH,肉汤管中,.,过夜培养,.MIC,即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值,.,10,4,cfu/ml,4,2,1,0.5,0.25,0.12,0,m,g/ml,微量肉汤稀释法,微量肉汤稀释法,结果读取技巧,磺胺类药物容易出现弱生长，只要满足,70%,以上抑菌率即可视为未生长,真菌药敏三唑类药物容易出现拖尾现象（即低浓度孔易出现弱生长），判读时以对照孔为参照，,80%,的抑菌率即可视为未生长,大于三孔不同梯度浓度的抗生素测试中，出现的高浓度生长，而低浓度不生长现象叫跳孔。造成跳孔的主要原因，菌悬液乳化不充分，细菌分散不足，以及药敏卡某些孔被污染,跳孔的解决方法：根据其他药理学特征类似的抗生素的敏感性以及分析其他同类不同种抗生素的敏感性进行推断性修正,修正低浓度,耐药,修正高浓度,敏感,肉汤稀释法注意事项,生长缓慢微生物（形成肉眼可见生长,1,周）不适合用,MIC,法,在肉汤中发育不良的微生物不适合用,MIC,粘液性铜绿假单胞菌,只能用扩散法，,48,小时观察结果,淋病奈瑟菌,CLSI,无肉汤稀释法药敏指南,注意微弱生长导致的假敏感（结果需要修正）,例如铜绿对磺胺、四环素、头孢噻肟,/,曲松,鲍曼不动杆菌对氨曲南,肺克、阴沟、变形杆菌对呋喃妥因,稀释法药敏影响因素,培养基,pH,值,7.2-7.4,营养程度,抗生素拮抗剂含量,钙镁离子含量（钙,10-25,；镁,10-12.5g/ml,）,菌悬液,（,510,4,CFU/ml,）,接种效应,浓度高,MIC,抬高,浓度低,MIC,压低,细菌纯度,气体环境,所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放,CO2,，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药,培养时间,真菌需,48,小时,奴卡菌需,5,天,E-test,法,MIC,值标注于试条的光面,Etest,试条,毛面贴于,MHA,上,Etest,操作程序,按照扩散法标准操作涂布接种,贴上试条并培养,15-18,小时,读取抑菌浓度并按标准解释,肺炎链球菌,青霉素,MIC,=3,g/ml,结果读取,药敏试验结果控制,药敏试验结果解释标准,CLSI,标准；,全球性,每年更新,非强制性学术机构,FDA,标准（全球标准）,建立在,CLSI,基础上,68,年更新一次,官方机构，标准带有强制性,法国,CASFM,标准；,梅里埃产品习惯采用的,CLSI,以外的标准,英国,BSAC,标准；,欧洲应用比较广泛的标准,欧洲,EUCAST,标准,.,CLSI,药敏解释标准,CLSI,(Clinical Laboratory standard institution),药敏指南,CLSI,CLSI,药敏文件,M100-S22,常见菌,(2012,)*,M11-A7,厌氧菌,(2007),M39-A3,积累抗菌谱,(2009),M24-A,分枝杆菌,奴卡菌,以及其他需氧放线菌,M27-A2,酵母样真菌,MIC,法,(2002),M44-A,真菌纸片扩散法,(2004),M45-A,低频分离菌与苛养菌,(2006),*M100 updated yearly,CLSI M100-S22,解释标准,覆盖的细菌类别,肠杆菌科,铜绿假单胞菌,不动杆菌属,洋葱伯克霍尔德菌,嗜麦芽窄食单胞菌,其他非肠道杆菌,葡萄球菌属,肠球菌属,流感嗜血杆菌与副流感杆菌,淋病奈瑟菌,肺炎链球菌,-,溶血链球菌,草绿色链球菌,脑膜炎奈瑟菌,厌氧菌,不同细菌适用的药敏方法,部分细菌同时具有扩散法标准和,MIC,标准，但具有扩散法标准的药物相对较少,部分细菌（某些药物）只有,MIC,标准,其他非肠道细菌所有药物,葡萄球菌万古霉素、托达霉素,肠球菌托达霉素,肺链除苯唑西林以外的其他,内酰胺类,溶血链球菌除青霉素、氨苄青霉素、头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他,内酰胺类,草绿色链球菌除头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他,内酰胺类,厌氧菌所有药物,淋菌只有扩散法和琼脂稀释法，无肉汤稀释法标准,少见菌和苛养菌的特殊药敏,参考方法：,M45-A,乏养菌与颗粒链菌,稀释法,嗜水气单胞菌复合群,稀释法与扩散法,弧菌属细菌（霍乱除外）,稀释法与扩散法,芽孢杆菌属（炭疽除外）,稀释法,空肠,/,大肠弯曲菌,稀释法与扩散法,棒状杆菌,稀释法（可用的药物标准比,BSAC,标准提供的多）,Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria,；,Approved guideline,猪红斑丹毒似菌,稀释法,HACEK,组苛养性,G-,杆菌,稀释法,卡他莫拉菌,稀释法,产单核细胞李斯特菌,稀释法,巴斯德菌,稀释法,其他，如乳杆菌、片球菌、无色藻菌,稀释法,分枝杆菌,奴卡菌,以及,其他需氧放线菌药敏,参考方法：,M24-A,结核分枝杆菌复合群,比例法,缓慢生长非结核分枝杆菌,稀释法,快速生长分枝杆菌,稀释法,奴卡菌等需氧放线菌,稀释法,Susceptibility Testing of Mycobacteria,Nocardiae,and Other Aerobic Actinomycetes;Approved Standard,真菌药敏,M27-A2,用于酵母样真菌的稀释法药敏,只有氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶有解释标准，其他药物的测试结果报告,MIC,M44-A,用于酵母样真菌的扩散法药敏,只有氟康唑有解释标准,M38-P,用于丝状真菌的稀释法药敏,只有操作方法，报告,MIC,值，但无解释标准,药敏试验质量控制要点,意义：保障药敏结果的可靠性,准确性和精密度,控制环节要点（重要的五大环节）：,*质控,1,：人员操作能力,质控,2,：菌液浓度（比浊）,质控,3,：培养基质量,质控,4,：药敏试剂（纸片或,MIC,试卡,/,板）、读取药敏结果的仪器设备,*质控,5,：异常结果的发现与修正,参照指南：,CLSI,文件,*质控,1,：人员,标准,操作,指南：扩散法参照,CLSI-M2,文件；,MIC,法参照,M7,文件,考核内容：,基本操作步骤的熟练程度,结果的正确读取,人员：操作步骤的熟练程度,按照标准程序操作，能在,15,分钟内完成单个分离菌的药敏试验操作,操作过程：,菌落的挑取手法,菌液的配制操作与菌液混匀操作,扩散法中菌液涂布操作,MIC,法中菌液的稀释操作,仪器法中仪器的标准操作手法,菌悬液纯度和浊度的验证性操作；,人员：结果的正确读取,抑菌环的正确测量,忽略边缘的微弱生长,环内生长的检测,污染菌的发现或耐药亚群的分离确认,MIC,值的正确读取,包括跳孔现象的发现与纠正,微弱生长孔的发现与结果修正（磺胺、四环、氯霉素、氨曲南,）,拖尾现象的正确忽略（磺胺、真菌）,生长不良的确认与补救措施（重做、延长）,质控,2,：菌液浊度控制,目测法控制,内容：主要是,0.5McF,浊度的感知能力,参照物：,0.5 McF,硫酸钡比浊管，对应,1.510,8,CFU/ml,参考方法：菌液稀释后菌落计数法,允许误差：,1.510,7,1.510,9,CFU/ml,仪器法控制,内容：同上,校准品：,0.54 McF,硫酸钡比浊管,参考方法：同上,允许误差：同上,质控,3,：,MH,培养基质量控制,pH,值,7.2-7.4,营养程度：不加血的情况下就能支持,ATCC 29212,的生长,抗生素拮抗剂含量：使用,ATCC 29212,监测，扩散法有抑菌环出现，并且环内只允许微量小菌落出现；,MIC,法抑菌率,80%,钙镁离子含量：钙,10-25,、镁,10-12.5,g/ml,锌离子含量：,ATCC27853,亚胺配能结果在允许范围内,质控,4,：药敏试剂质控,CLSI,提供扩散法和稀释法的质控标准,扩散法标准适合于纸片扩散法,稀释法标准适合于微量肉汤稀释法、琼脂稀释法，以及,E-test,法,内容,标准菌株,质控频率,各种药物的控制范围,扩散法质控,菌株,非苛养菌：肠杆菌科,ATCC 25922,大肠；非发酵菌,27853,铜绿；葡萄球菌,25923,金葡；,加酶抑制剂抗生素质控,35218,产,ESBL,大肠,苛养菌：嗜血杆菌,49247,流感，,49766,流感用于补充，弥补,49247,某些不能检测的药物；淋菌用,49226,；肺链用,49619,扩散法控制范围,点击放大,稀释法质控,菌株,非苛养菌：肠杆菌科,25922,；葡萄球菌,29213,；肠球菌,29212,；非发酵菌,27853,；,加酶抑制剂抗生素质控,35218,苛养菌：嗜血杆菌,49247,，,49766,流感用于补充；淋菌用,49226,；肺链、其他链球菌，以及脑膜炎球菌药敏质控用,49619,；,49226,用于淋菌琼脂稀释法质控,其他低频分离菌：根据相应的文件规定。一般都是选用上述质控菌株中的某些,稀释法控制范围,点击放大,自动化药敏仪器的质控,主要是光学部件读取数据时的准确性与稳定性,由仪器内置自检部件按规定时间间隔自动进行，如果自检不能通过，仪器会报警通知人工处理，人工校正仍然过不了的应及时停用，并通知厂家工程师维修,其次是仪器软件的定期升级。由于,CLSI,与,FDA,标准每年或每隔几年就会进行更新一次，仪器药敏判读软件也应作相应更新升级。,有的更新需要同时更新鉴定板,/,卡上的抗生素浓度设置，需要注意的是更新后软件应与相应试剂配套，否则会导致错误结果的产生。,自动化药敏仪器的质控,需要注意的是在仪器光学部件维修后和软件更新后都必须进行连续,5,天的质控，只有,5,天内均合格仪器才能进入正常使用程序,质控频率,需要连续质控的天数,试验方法改变,1,5,20,或,30,备注,药敏纸片,更换新产品或新批号,X,使用新厂家产品,X,培养基,(,制备琼脂平板,),更换新产品或新批号,X,使用新厂家产品,X,接种物制备,改变接种物制备方法,/,使用具有自己质控规则的设备进行标准化操作,X,例如使用自动化比浊设备代替肉眼进行浊度判断,改变接种制备方法,/,采用依赖于操作者经验的方法进行标准化操作,X,例如使用其他非自动化比浊手段代替原来的肉眼进行浊度判断,抑菌环测量,改变抑菌环测量手段,X,例如采用自动化抑菌环测量器代替人工测量，,或者执行内部评价时,设备,/,软件,(,例如使用自动抑菌环测量器,),影响药敏结果的软件更新,X,监控所有药物，并不限于那些涉及软件更改后才会影响结果的药物,影响药敏结果的设备维修,X,取决于维修范围,(,例如，,像光电比色部件等重要的结构维修,),，加强测试是适当的,(,例如，,连续,5,天,),谢谢大家！,