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进化基因组学揭示了信号转导和调节微生物化学感受器的保守的结构的决定因素
作为一种重要的跨膜信号转导的模型，MCPs已经用遗传，生化检查，和结构技术来广泛研究。然而，信号传递的分子机制仍然不被很好的理解。成百上千的物种的基因组信息的可用性能够在蛋白质序列方面完成功能的鉴定，蛋白质序列在漫长的进化距离是保守的并且因此功能是非常重要的。我们进行了一个大规模的MCP信号和和调节领域家族和已查明的特点的基因比对分析，这似乎是对受体结构和功能的关键。基于域的长度和序列保守，我们确定了7个主要的MCP类别和在胞浆域内的3个不同的结构域：信号转导，甲基化，和灵活捆绑的子域。这个灵活捆绑子域不被认为在MCPs内，是一个似乎对信号传递重要的保守元素。引人注目的是，胞浆域的N和C末端螺旋臂在长度和注册方面对称尽管在整体域长度内有24-64的7-aa域名的戏剧性变化。对称性的丢失在一些MCPs内被观察，在感官模块内伴随着特定变化。每个主要的MCP类别有不同的模特来预测甲基化站点，这被实验数据很好的支持。我们的研究表明MCP胞浆域内的信号和调节功能是紧紧耦合的，并且它们的共同进化已经导致了在不同有机体内的趋化作用机制内的重要多样性。
在大肠杆菌内控制趋化性的信号转导系统是调查分子信息学过程的一个重要模型和最好研究的信号传递系统之一在生物中。这个系统的关键特征是高度敏感的，广泛的动态范围，信号集成，内存和适用（1-4）。这个系统的主成分包括化学感受器[甲基接受性趋化性蛋白（MCPs）]；一个组氨酸激酶，CheA；一个耦合受体蛋白，CheW；和受体修饰酶，CheR和CheB，所有都被安排在蛋白质符合体内（5,6）。MCPs监测了各种环境的和胞内信号和控制CheA的活动，这通过同源反应调节，CheY（6）来向鞭毛马达传递信号。
MCPs通常被嵌入在细胞质膜中（图.1）和构成了一个细胞外配体结合域和一个链接一个HAMP链接域的细胞质的信号和适应域（7,8）。这个细胞质域包括两个区域包括共价修饰的位点（甲基螺旋1和2）和信号子域，存在于CheA和CheW的绑定。大肠杆菌丝氨酸MCP的Trs（11）和海栖热袍菌的TM1143 (12)的胞浆域的x晶体结构，以及扫描诱变（13），揭示了一个二聚体的四个螺旋束组成了两个对称的反平行盘绕的线圈，没有明显的结构子域和已知的功能域相对应，在每一个已知的结构中。Tsr胞浆域的二聚体在晶体点阵（11,14）中被组成了三聚体，一个由遗传和生化研究（15,16）支持的体系结构和提出作为一个信号复合物的主要元素。和Tsr不一样，TM1143化学感受器的胞浆域的晶体包装揭示了一个二聚体的树立，打开了不同的MCPs可被插入在不同类型的装配体的可能性。MCPs，CheW,和CheA可能形成一个由一个复杂系列的交互作用维持的2D点阵。这些交互作用的确切性质和受体信号的分子机制并不被很好的理解，尽管实验研究同意了在MCPs间的信号放大的交互作用的重要性。此外，在信号机制方面有重要多样性和不同微生物物种间的趋化性调节。例如，在大肠杆菌中，像引诱剂的积极刺激增加抑制了CheA的活动，而在枯草芽孢杆菌，恰恰相反。在大肠杆菌里，MCP去甲基化增加仅回应了消极刺激，但在枯草杆菌中，它发生为了积极和消极刺激（20）。
最近获得的数以百计的微生物种类的基因信息学使得区域和位置在蛋白质序列方面得以鉴定，蛋白质序列在漫长的进化距离高度保守并且因此对蛋白质功能非常重要。MCPs在运动型细菌和古细菌中的许多基因甚至在基因数据的爆炸之前已被鉴定（8）。在此研究中，我们使用了一组大规模结合了结构数据分析的基因方法来鉴定MCP胞浆域的主要类别，在功能和结构方面独特的解决子域，并且确定了重要氨基酸残疾结构性和功能性。灵活捆绑子域，之前没有被认为是在MCPs里，似乎对信号转导是一个关键元素。我们的发现表明信号传递和调节功能在MCP胞浆域是紧密耦合的，并且它们的共同进化已经导致了在不同有机体趋化机制方面的重要多样性。
结果
种类分布和域类。运用方法很好被定义和严格的域边界和比对过程，就像在材料和方法里描述的，我们检测到2125个MCP胞浆域（MCPCD）序列在152个细菌和古生菌的基因组并且构造了多个比对[支持信息（SI）表1和SI数据集1]。MCPCD存在于大部分主要的细菌门和明显缺席在泉细菌门和真核生物（除了冈比亚按蚊，它的存在可能因为原核生物DNA的污染）。
MCPCD最显著的特征是成对插入或删除（插入缺失）构成了成倍数的域（图2A），几个连续氨基酸残基的区域（标为a-b-c-d-e-f-g），和双螺旋匝完全对应。基于（i）序列保护和（ii）对称插入缺失的存在，我们现在定义7个主要的MCP类别（图.2A）。七个类别中的三个已经被认可（21）；但是，它们中的一些插入缺失的安置是不正确的因为结构信息的缺失和数量有限的用来分析的可用序列。在所有的7个MCP类别中，每个7肽的第一和第四个（a和d）残基，成为旋钮，是高度保守的（图2B；SI图6）和往往是疏水的；这个七肽重复模式是卷曲螺旋蛋白质的特征（22）和被此领域可用的晶体结构支持。我们分配了1915个MCP序列（90%的所有检测到的MCPs）到这些7个主要的MCP类别（SI 表1）。其中，一小部分（80序列）有特定基因对称插入缺失点来形成5个小长度的子类（SI 表1 和SI 图7）。剩余的210个序列与任何专业类别的域模型不配对因为截断（大部分会导致基因装配问题）或者是低保守和不对称插入缺失的出现。引人注目的是，后者往往与表观特定基因域混合和缺失事件相伴随。例如，许多未必对序列代表了MCPCD到一个N末端复合跨膜区模块（41序列）或者一个独立的MCPCD（93序列）。
子域的识别。序列保守特点对允许我们在MCPCD表征和定义3个不同的子域边界的所有主要类别来说是共有的。与发夹弯一致的中心地区的比对是高度保守的（图2B）并且已被认为是一个高度保守的域（23）。我们现在定义它的准确边界是7肽的01-04在多序列比对里序列保守和gap置入的基础上。与两个甲基单元一致的介质保护的两个区域被识别但之前未被很好定义（21,24），在那共价修饰的点在7个许多蛋白质中从两个主要类别已被实验测定（图2A）。我们现在特别定义甲基化子域的边界作为 7肽 13-22 (图2)。信号转导和甲基化的子域被两个低保守区域分离（图2B），组成了七肽05-12，大部分的gaps在那儿（图2A）。这些区域之前并没有明确被认为是MCPs。我们称这些领域为灵活捆绑域在一个进一步详细审查下（见下文）。
信号子域。信号子域的高序列保守性在所有MCP类别中被发现（图3A）。子域里的残基分为两大类，内部-和内而具体相互作用位点，和七肽adeg和bcf里的残基分别一致。内部二聚体位点导致了二聚体稳定性通过在不同单体的相同残基间自我相互作用。在内部二聚体相互作用点，来自在一个二聚体表面的单体的同源残基在相反方向（图3B）。内二聚体相互作用位点可能导致MCPs和CheA和CheW的相互作用（23,25）。内二聚体相互作用位点在信号子域间比在外面更加保守（图2B），可能因为由保守的内二聚体和CheA/CheW的相互作用产生的严格的约束。在七肽N01和C01的三个甘氨酸严格保守因为他们维持了发夹弯的紧凑结构。因此，整体的二聚体组织和它在信号复合物间的相互作用在所有MCP类别似乎是保守的。在类别里但不在类别间保守的残基是特别令人感兴趣的。最显眼的像这样的位点是内二聚体相互作用在N03b位点（图3A）。像Tsr在36H-类别的受体，苯丙氨酸残疾稳定了二聚体的三级结构（图3B），对受体协同性非常重要（14,15）。在其他受体类别中，这个位置通常被一个带电残基占据，这将破坏受体间的相互作用无论它们是否在三聚体内（11）很好的组织（12）。
灵活捆绑子域。灵活捆绑子域构成呢个了七肽05-12（图2）。旋钮是在这个子域内唯一保守的残基，促使我们更紧密的检测他们的保守格局。在一个螺旋线圈，每一个旋钮适合成为一个在相邻螺旋形内由四个孔残基组成的口袋（图4A）。丙氨酸旋钮短的副链经常偏爱口袋的一侧，形成一个三孔残基组成的较小的三角形口袋（26）。图4B显示七肽寄存器在MCPCD4螺旋捆绑内的安排。在捆绑中心的旋钮残基被安排在广场a-d层。当大疏水性和小残基在旋钮层成对存在，它的形状从方形倾向菱形因为在大的残疾对的疏水相互作用很气那个（图4C）。当在相邻旋钮层倾斜的方向交替时，四股卷曲螺旋是平行的（27）。我们认为长段的旋钮层倾斜于一个方向是不稳定的（图4D）。我们确定了在灵活捆绑子域内的两个这样的延伸（SI 图8）。在28H MCP类别，这个子域已几乎完全删除。在其他六个类别，七肽10-12在N末端螺旋有一个小旋钮和在C末端螺旋有一个大的旋钮。相反，七肽05-09倾向在N末端螺旋有一个大旋钮和在C末端螺旋有一个小旋钮（SI图8）。因此，看来所有MCP二聚体有2块不稳定的旋钮层，在灵活捆绑子域的顶端倾斜于一个方向和在它的基地信号子域附近倾向于相反方向。这些基于序列的结果进一步被结构分析确认。图4E展示了大肠杆菌Tsr和海栖热袍菌TM1143结构区域，在那儿卷曲螺旋通过使用SOCKET算法来预测。在两个结构中，刚性的卷曲螺旋在甲基化和信号转导子域被预测；但是，强大的卷曲螺旋圈在灵活捆绑子域没有发现，部分因为这个算法不能引起被丙氨酸旋钮偏爱的三角形口袋。在这两个结构里的旋钮层的交叉对角线距离的计算也表明了灵活捆绑子域有倾向在一个方向的堆栈层，在甲基化和信号转导子域里，有成堆的交替斜层（SI 表2）。在TM1143结构的旋钮层，一个对角平均3.6 Å (34%)短于另一个。我们称这些螺旋有大旋钮的为“骨头”和有小旋钮的为“筋”。在Tsr和TM1143的捷径结构里，实验温度因素表明灵活捆绑子域比其他子域更灵活，并且它的“筋”螺旋比它的“骨头”螺旋更灵活（兔F和SI表3）。
甲基化子域。甲基化子域（七肽13-22）在所有但在一个主要类别中已被鉴定。引人注目的是，整个甲基化子域看起来从24H类别消失（图2A和SI数据集1）。MCPCD一个突出的特点是Glx对的保守性看起来像在大肠杆菌MCPs里发现的共识的甲基化序列[EQ]-[EQ]-x(2)-A-[ST]-（28）（SI图6）。在结构上，在母链中的Glx对和小残基存在于在一个甲基化螺旋的溶剂暴露边 上的相邻匝。Glx对的一个残基是CheR甲基化和脱酰胺和CheB和CheD去甲基化的目标，从大肠杆菌缺乏的一个受体修改脱酰胺酶但许多典型的趋化系统（29），而两侧的小残基被认为是通过适应酶对螺旋正确组装有重要作用的（30,31）。我们手机了来自每个信号类别包含甲基化子域的的序列，一个Glx对在bc七肽寄存器被确认，被预计在四螺旋束的溶剂暴露表面和决定了每个类别共识的甲基化序列。把特定类别的信息合并在一起，我们产生了一个共识的MCPCD家族的甲基化序列：-[ASTG]-[ASTG]-x(2)-[EQ]-[EQ]-x(2)-[ASTG]-[ASTG]-。这种保守格局强烈支持在螺旋转折上包括Glx对的上游和下游的小残基的重要性。在所有6个类别中配对母链的点可视为一个MCPCD比对和结构模型里的点情节（图5）。很明显，每个MCP类别有不同格局的甲基化点，并且这些点图在三维结构的域的不同位置上。
五肽系绳。所有的MCP序列被扫描到C末端五肽系绳的存在（见SI文章），CheB和CheR捆绑在大肠杆菌。联系此链机制的MCPs的“邻居协助”已被发现对大肠杆菌有精确调节（4）。大部分MCPs不含油C末端延伸；我们发现了217个MCPs在152里的67个基因包含共识的5肽母链-x-[HFWY]-x (2)-[HFWY]-。所有的这些MCPs是36H和34H类别，并且所有但是被发现变形菌的2个组织，暗示了五肽系绳是一个最近在MCPs和调节酶间的相互作用的进化模式。
讨论
灵活捆绑和信号转到。2个功能域之前被认为是在MCPCD：甲基化螺旋和信号转导子域，两者有定义不清晰接线（7,11,12,24）。在单个氨基酸位置的保守性的基础上，七肽格局，和插入缺失点，我们定义了区域的边界和确定了第三个之前没识别的一个，我们称之为灵活捆绑子域。我们提议在这个子域的旋钮残基的特征模型是MCP信号转导机制一个重要特点。刚性的“骨头”有可能稳定二聚体结构，而灵活的“筋”有可能传输感官信息到信号转导子域。扫描在大肠杆菌的Tar受体的甘氨酸残基的突变揭示了7肽09和10间的过渡点的重要性（32）。在七肽N10（G38A和G338C）上的d旋钮残基的突变创造了一个本构激酶活动的锁定表型。我们的分析表明这个残基形成了一个保守的N10d/C10a旋钮层，这在“骨头”和“筋”的螺旋两侧上下在所有主要MCP类别除了28H，这个子域的大部分已被删除（图5B和SI图8）。Coleman等人（32）命名这个区域为谷氨酸铰链和辩称它的功能是允许受体二聚体弯曲，不是促进二聚体的三聚体的重要装配过程就是部分信号转导机制。有一个中心谷氨酸铰链的灵活捆绑区域的保守性强烈支持了弯曲是信号转导机制的核心这个假说。
内部二聚体相互作用位点的强保守性表明了所有来自不同类别和组织的的MCPs形成了二聚体；但是，没有证据说明高价组织的一个优惠模式。有趣的是，在信号转导子域里最显眼的特定类别的残基是在36H类别的N03b位置上的苯丙氨酸（图3B）用大肠杆菌Tsr受体来举例说明。这是一个二聚体的三聚体的强烈芳香联系点（11,14）。另一方面，在其它MCP类别里的这个位置有一个强烈保守的带电残基和绿篱组织的二聚体的44H类别受体TM1143一致（12）。只有一个MCP二聚体和不是一个二聚体的三聚体可以被安置在CheA/CheW相互作用的模型内最近为海栖热袍菌提出（12）。在大肠杆菌晶体学显微镜进程中，3个MCP聚集在CheA和CheW的附近但没有形成一个三聚体（5），表明了这个来自海栖热袍菌的模型可能运用广泛。我们的分析和模型是一致的，表明了不同类别的MCP二聚体可能形成高价组织的不同模式。但是，我们偏爱这些结构结构数据代表了一个保守的动态受体阵的静态快照的这个假设。尽管它的高价组织的确切性质有待于确定，我们建议动态信号转导机制的一个关键元素可能是在直的和弯曲的构想间的每个MCP二聚体的震荡，其中一个可能偏爱高价聚类相对于另一个。这个“二聚体森林”模型提供了理论Ising模型的一个结构基础，探索了受体怎么可以协调在趋化信号上的高收益和宽动态范围（17）。不同长度的MCP类别和不同的内部二聚体联系的残基可能已经进化为一个调整配体弯曲的“传染性”的方式，这些模型的关键参数是在一个MCP二聚体内被配体弯曲影响的周边二聚体量化。我们承认现在的实验证据倾向于一个受体在大肠杆菌弯曲的替代的观点，特别是它允许了二聚体在信号转导状态间保持联系尽管重要的构想变化。这里的提出的分析可能帮助设计实验，将直接检测替代假说。
信号转导和调节的共同进化。我们已经表明插入缺失的对称对是进化变化的一个关键路径在MCP胞浆域但没有建立一个可能产生在序列方面有这样不寻常变化的机制。我们提议细胞质MCPs可能提高了一个减少的选择的压力的水库，在那儿远离发夹弯的域的末端对称的维持对于结构稳定是不那么重要的和其他的跨膜结合的同行比。在古细菌内的细胞质MCPs，例如，适合44H类别领域模型不如它们的跨膜结合的同行因为这一区域的差距并且可能代表了44H类别和40H类别的受体的一个进化桥。这个假说也可以解释未比对的来自细胞质MCPs的显然不对称的插入缺失位置的MCPCD序列的巨大数量。
受体激酶的感官投入在大肠杆菌和枯草杆菌里相反是有线的：在大肠杆菌里，积极刺激减少激酶活动，而在枯草杆菌里，积极刺激增肌激酶活动（20）。两个组织的调节机制也不一样。在大肠杆菌的类别36H受体，积极刺激在所有点增加甲基化和消极刺激在所有点减少甲基化。相比之下，枯草杆菌的类别44H McpB 受体由一个不同的甲基化机制：在MH2的一个残基（E630在比对配置C18c）甲基化响应积极刺激和脱甲基化响应消极刺激，而另一个（E637在C19c）相反（33）。激酶活动的弯曲模型符合这两个机制。从类别36H受体区分类别44H在MH2的插入缺失包括位置C18c（图2A和SI图6），所有有一个相关性在甲基位点格局的变化和调剂机制的变化。基于我们的数据联系了甲基化格局和在所有主要MCP类别的受体长度（图5），我们提议信号转导和调节与不是仅在大肠杆菌和枯草杆菌而是所有组织紧密关联，并且信号转导和调节机制在趋化性的自然历史中协同进化。
材料与方法
详细见SI Text
多序列比对。MCP蛋白质序列比对通过扫描312个原核生物基因组与Pfam MCP信号领域被确定（Pfam加入了no.PF00015）通过使用雾数据库（34）。共有2133个配对序列被发现于152个组织。Pfam模型没有正确扫描MCP胞浆域的全长；因此，我们首先定义序列标记，中心，和结尾位置在域里并且用它们决定正确的域的边界（见SI Text）。每个长度类的无间隙配对通过使用ClustalW1.83默认设置和手动编辑来产生（35）；然后HMM域模型通过使用HMMER2.3.2的默认参数从这些可见的比对中产生。一个序列被分配到最高分的域如果模型的Z-分至少50单元高于第二最佳得分模型。这个过程导致了一个长类的比对到2125MCPs里的1846；8个序列被弃用，因为所有它们的Z-分是消极的并且它们与高度保守域HMM低配对。剩余的279MCPs中，69个通过检测HMMER输出人为分类，剩余210个未比对的MCPs。12个单独比对的类别被合并进一个单独的多比对中由信息含量和氨基酸共识指导决定于每个类别，通过文件-文件比对，并且通过来自Tsr(11)和TM1134（12）晶体结构的结构信息。
卷曲盘绕分析。旋钮残基的明显的保守性（图2B）启用七肽注册器的鉴定通过MCPCD。旋钮和孔也在Tsr（11）和TM1143（12）晶体结构被识别使用SOCHET算法（22,37）到7.8-Å截止。
甲基化模式分析。甲基化的点通过用定位相邻位点方法在每个长度类别被识别在b和c七肽注册器，在那儿谷氨酸或谷氨酰胺的信息含量在多序列比对中在两个位点超过0.5位。为了将在不同的MCPCD长度类别的甲基化位点可视化，一个邻接树从无缝隙比对的序列通过使用MEGA3软件在氨基酸替换物的P点模型和gap残基的完全删除。这个树被分隔成最大子树包含了仅来自一个长度类别的受体。24H MCPs被分开分析因为它们缺乏甲基化子域。甲基化点配对于共识的母链-[ASTG]-[ASTG]-x (2)-[EQ]-[EQ]-x (2)-[ASTG]-[ASTG]-被识别和可视化通过使用Perl脚本。在图5A的序列被安排在树里但子树重新安排以几何同样类别的所有受体。
计算机图形学。结构图像在pymol里产生。在WebLogo里产生了序列标志（39）。所有基于序列的数字从与没有gaps的最高分领域模型配对的序列，在图5A的母链由所有分类序列中产生。