分子植物病理学教学教程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子植物病理学,Molecular Plant Pathology,绪论,1,、概念（,conception,）,分子植物病理学是在,分子水平,上研究并解释植物病理现象、讨论和解决植物病害防治理论及其途径的科学。,2,、研究内容,(,contents,),应用分子生物学理论和,DNA,重组技术，研究植物病害的发生机制，阐明病程中，寄主病原物,相互作用的分子基础,；寄主、病原物与病程相关的,基因及其结构、表达和调控机制,。,3,、主要研究方法（,main strategy,）,从“里”到“外”,：以研究寄主和病原物的基因为主要对象，阐明寄主病原物相互作用的有关基因的结构、表达、调控及其产物功能。,方,法导向：,先以分子克隆的方法鉴定与致病性有关的基因，然后根据该基因产物及其对生物表型的影响，确定该基因的类型和作用。,在,分子（,DNA,）水平,上通过互补分析和缺失研究，从个体到群体分析有关基因的作用和功能表现的调节。,4,、分子植物病理学的发展（,history,）,分子植物病理学是植物病理学中最年轻的分支，是在遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和生物物理学等现代学科发展和影响下逐渐形成的。然而，由于各种病原物的分类地位及其所从属的学科不同，因此，在各种植物病害的研究中，运用分子植物病理学观点和方法对其进行研究的水平是不平衡的。,植物病毒病害的分子生物学研究,1935,，,W.M.Stanley,成功分离出,TMV,结晶，并证明结晶的大部分组成是,protein.,1937,E.C.Borden N.w.Pirie,报道了,TMV,的化学组成，提出该病毒由,95,protein,和,5,RNA,组成,1955,1956,，,H.Frankel-Conrat,对,TMV,的蛋白质和核酸进行了重组研究，为证明核酸作为一种遗传物质的作用提出了令人信服的证据,可被,TMV,抗体纯化,不能被,HR,抗体纯化,侵染植物,RNA,供体病毒的特征,分离出的病毒颗粒能被,HR,抗体钝化,杂合病毒,TMV CP,HR RNA,1958,Gierer et al,用亚硝酸诱变获得,TMV,突变株,使坏死病斑从,0.2%,增加到,15%,进一步说明病毒,RNA,的突变与致病功能的关系,.,植物细菌病害的分子生物学研究,植物病原细菌中欧氏杆菌归属于肠杆菌科，这类病原菌的分子遗传研究在,20,世纪,70,年代初才开始，较肺炎双球菌的分子遗传学研究迟了近,40,年，较,DNA,双螺旋的发现晚了将近,20,年。,20,世纪,50,70,年代是植物病原细菌基因操作技术积累的时期。,1953,1956,，,D.T.Klein R.M.Klein,发现根癌土壤杆菌的基因转化与致病性有关的现象。,1957,，,R.R.CoreyM.P.Starr,发现了菜豆黄单胞的转化作用与其对链霉素抗性和菌落形态变化之间的关系。,1966,，日本学者完成了水稻白叶枯病菌的转化研究。,农杆菌（,Agrobacterium tumefaciens,）,1944,发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素的培养基上生长。,1970,，,G.Morel et al,.,发现农杆菌致病菌有两种类型，其区别在于对两种不常见,Arg,衍生物章鱼碱（,octopine,）和胭脂碱（,nopaline,）的代谢不同。,1973,J.A.Lippincoot,证明，无致病力菌株丧失对上述两种,Arg,衍生物的利用能力，因此，农杆菌有,3,种类型。,type toxic octopine nopaline octopine opaline,A +,+,B +,+,+,C,细菌利用 肿瘤组织合成,1974,1978,，农杆菌菌株的遗传转化研究。其中，,1977,，,M.D.Chilton,证明农杆菌的,Ti,质粒上只有一小段,DNA,与肿瘤诱发有关系，而且可以从细菌转移到植物细胞；,1978,，,J.Schell,首次以,Ti,为载体把带有抗生素抗性基因的转座子,Tn7,转移到植物细胞中去，开创了以,Ti,质粒为载体转移外源,DNA,进入植物的植物基因工程研究日益兴旺，同时对,Ti,质粒的精细分析和与寄主植物互作的研究成为分子植物病理学研究热点,.,欧氏杆菌,(,Erwinia,spp),欧氏杆菌与大肠杆菌相近,同时也是重要植物病原细菌,因此开始分子遗传学研究较早。,20,世纪,70,年代,M.P.Starr,实验室进行了欧氏杆菌,Hfr,菌株的结合遗传学研究，利用营养缺陷型标记转移法对其致病基因进行作图,结果表明,致病基因位于染色体上,his,和,thr,两个基因之间,.,自,1984,年,N.T.Keen,首次报道从菊欧氏杆菌,(,E.Chrysanthemi,),中克隆到果胶裂解酶基因后,发表了有关欧氏杆菌中,2,个种,pel,基因克隆的报道,其中涉及编码,5,个主要同工酶的,5,个,pel,基因,.,假单胞细菌,(,Pseudomonas,.spp,.),茄青枯假单胞,(,P.solanacearum,),丁香假单胞,(,P.syringae,),大豆斑点病菌,(,P.s.,pv,.glycinea,),大豆假单胞,(,P.glycinea,),植物真菌病害的分子生物学研究,传统植物病理学中许多重要的理论和学说都是以真菌病害为模式发展起来的,但在分子病理学方面的进展明显滞后,.,1979,年,M.E.Case,在粗糙脉孢霉,(,Neurospora crassa,),和,J.Tilburn,在巢曲霉,(,Aspergillus,),遗传转化系统试验相继取得成功后,丝状植物病原真菌的分子生物学研究发展迅速,.,5,、分子植物病理学研究进展（,Review,）,Gene for Gene Hypothesis,植物对某种病原菌的特异性抗性取决于它是否具有抗性基因，即寄主分别含有感病基因（,r,）和抗病基因（,R,），病原分别含有有毒基因（,vir,）和无毒基因（,avr,），只有当具有抗性基因的植物与具有无毒基因的病原相遇时，才能激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄主表现感病。,5.1,病原菌致病相关基因的研究进展,致病性基因,(,Pathogenicity genes,),是病原均与寄主植物互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌在寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物细胞正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植扩展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无毒基因,前者决定对植物表现亲和性,即调控病害的发生与发展,;,后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种表现专化性不亲和。,无毒基因,(Avirulent genes),广泛存在于寄主植物的病原中，,Staskawicz et al,（,1984,）通过把含无毒基因,avrA,的大豆丁香假单胞杆菌,(,Pseudomonas syringaepv.glycinea,)6,号小种的,Cosmid,克隆接合转移到不含,avrA,的小种中，以遗传互补实验，克隆了,avrA,，这是克隆的第一个无毒基因。随后，许多研究者通过类似的方法从不同的病原,(,包括细菌、真菌和病毒,),中克隆了,50,多个无毒基因，涉及,40,50,种病原物。,5.1.1,植物病毒无毒基因的研究,TMV,等近,10,种病毒的无毒基因已得到研究，现已明确的病毒无毒基因产物均为病毒致病相关功能蛋白，包括病毒外壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白。,1986,Beachy,et al.,将,TMV U1,株的外壳蛋白,cDNA,转入烟草细胞，获得了高抗性的烟草植物，此后，利用外壳蛋白基因获得抗病毒病植物的方法很快被应用到其他病毒和植物上。,病毒：,TMV,，,ALMV,，,CMV,，,TRV,，,PVX,，,PVY,，,SMV,，,BMV,，,RSV,寄主：烟草，番茄，马铃薯，大豆，水稻,5.1.2,植物病原细菌无毒基因的研究,自第一个植物病原细菌无毒基因,avrA,从丁香假单胞菌大豆致病变种,6,号生理小种中被克隆后，目前已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞菌等植物病原细菌中克隆了,40,多个无毒基因，远远超过从其它植物病原菌中克隆到的无毒基因。,细菌无毒基因产物在植物细胞内的定位及气与激发子,HR,的关系是近年来的研究热点之一。研究结果表明，无毒基因产物实现其激发子功能的场所不在胞外空间，而是依赖于功能性,hrp(Hypersensitive responses and pathogeni-city),基因产物直接将无毒基因产物从菌体内转移到寄主细胞质内，从而实现其激发子功能。,应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中。通过农杆菌或基因枪的介导转化植物,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株。,杨希才等,(2001),从病原细菌,Pseudomonas syringae,PV.,tomato,中获得的无毒基因,avrD(0.93kb),和从病原真菌,Phytophthoraparasitica,中获得的无毒基因,Elicitin(0.294kb),分别与非专一性病原物诱导启动子,Pill,和,BG,组成含,2,个嵌合基因,(,Pill-avrD,BG-Elicitin,),的植物表达载体,pYH144,和,pYHEt,。通过农杆菌,LBA4404,介导转化马铃薯,其中用,pYH144,载体转化,2,个品种,(,克新,1,号,2,号,),用,pYHEt,载体转化,3,个品种,(,Desiree,克新,2,号,4,号,),通过组织培养分别获得潮霉素,(,Hygromycin B,),标记的转基因马铃薯试管苗,对马铃薯晚疫病具有明显的抗性。,5.1.3,植物病原真菌无毒基因的研究,由于缺乏简便有效的克隆方法,真菌无毒基因的克隆已落后于细菌无毒基因以及相应植物抗病基因的克隆,这已成为进一步研究克隆抗病基因与真菌无毒基因产物互作及下游信号转导途径的制约因素之一。,番茄叶霉病菌,（,Cladosporium fulvum,）的无毒基因,现已从不同番茄品种中鉴定了许多抗性基因，这些基因的近等位基因系对已知的病原小种表现明显的不同反应被侵染叶片的非原生质体汁液中含有真菌结构蛋白和定植期间被诱导产生的蛋白。其中之一是无毒基因,avr9,的产物，与番茄抗病基因,cf9,的产物特异性互作。,目前，已对,avr9,基因产物进行了纯化和测序，明确了其分子结构，为一个,63,个,AA,的前体蛋白，,C,末端含有,28,个,AA,的成熟激发子，因此，可以从蛋白质到基因的克隆途径来鉴定基因。所分离的基因克隆表明，,avr9,的,ORF,中有一个,59bp,的短内含子。,能在,cf4,基因型的番茄上诱导过敏反应的小种专化型激发子及无毒基因,avr4,的产物也已被纯化和测序并以相同的方法克隆到无毒基因,avr4,。,稻瘟病菌,（,Magnaporthe grisea,）,的无毒基因,稻瘟病是世界性重要病害，现已作为模式病害，从经典遗传学、分子生物学核细胞生物学等不同的角度进行了全方位的分子病理学研究。,Rice Blast DiseaseZeigler,et al.1994,在已鉴定克隆的,8,个,pwi,基因（,pathogenicity of weeping lovegrass,对画眉草致病）。,pwi,1,基因是从马唐与画眉草菌株杂交后鉴定出来的，对画眉草的致病性发生了变化，因此，根据经典的无毒基因控制一种寄主植物品种转化性的概念预测,pwi,2,基因有阻止对画眉草侵染的作用。目前用染色体步查的方法已克隆了,pwi,2,基因，并进行了测序。研究发现，大多数水稻菌株含有,1,到数个,pwi,2,拷贝。通过研究具有不同寄主专化性的稻瘟病菌株,pwi,2,同源序列的分布，发现,pwi,是一个多基因家族。,亚麻栅锈病菌,（,Melampsora lini,）,无毒基因,亚麻锈病的寄主病原物关系是研究最充分的病例。目前已鉴定出,34,个抗病基因分别存在于,7,个群中。用射线进行缺失诱变克隆到,4,个无毒基因。但目前对亚麻锈病菌的转化系统还不十分成熟。,大麦云纹病菌,（,Rhynchosporium secalis,）,无毒基因,大麦近等位基因系,Atlas,对小种,US138.1,是感病的，,Atlas46,带有抗病基因,Rrs1,是对小种,US138.1,抗病的。,Atlas,Atlas46,第一代、第二代对小种,US138.1,抗性遗传分析表明，这种抗性是由单个共显性基因控制的。小种,US138.1,产生的,3,种能诱导细胞坏死的多肽,NIP1,、,NIP2,和,NIP3,在两个品种上诱导坏死的能力是相同的。,NIP1,、,NIP2,的存在与不亲和互作中坏死的发生有关，在亲和互作中不产生过敏反应。在小种,US138.1,的不亲和互作中病程相关蛋白,PRHv-1,的,mRNA,的积累水平比在亲和互作中高，而且只有,US138.1,产生的,NIP1,能特异地诱导带,Rrs1,抗病基因的品种产生,PRHv-1,的,mRNA,。因此，,NIP1,可能是一种无毒基因。该基因的克隆和转化研究正在进行。,5.2,植物抗病基因的研究,自,Johal,et al(1992),成功克隆出第一个玉米抗圆斑病,R,基因,Hm1,以来，迄今人们已经从,9,种不同植物中成功地克隆出了,22,种,R,基因。克隆植物,R,基因一般采用产物导向法,(product-orientated approaches),、鸟枪射击法,(shot-gun complementation),、扣除杂交法,(subtractive hybridization),、转座子标记法,(transposon tagging),和图位克隆法,(map-based cloning),等,7,种方法，但只有转座子标记法和定位克隆法取得了成功。上述,22,种,R,基因都是采用这两种方法克隆的。,已 克 隆 的 植 物 抗 病 基 因,随着分子生物学技术在分子植物病理学中的广泛应用，尤其是抗病基因的成功克隆与分析，对植物抗病基因的分子功能已有一定的实验依据。,B.Baker,和,K.E.Hammond-Kosack,等（,1997,）分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病基因结构特征阐述了植物抗病基因的功能即识别、信号传导和进化。,有待解决的问题,：,在抗病基因产物中那些结构决定病原物的特异性识别？,其下游信号物质是什么？这些物质又是如何起作用的？,被诱导的防卫反应对不同病原物为什么具有特异性抗性？,自然界中新的抗性基因是如何产生的？,第一章 病原物致病相关基因,第一节 病原物基因组的结构特征,植物病原真菌基因组,植物病原细菌基因组,植物病毒基因组,植物线虫基因组,第二节 病原物致病基因的类型,1,决定亲和性的基因,1.1,编码致病因子的基因：,胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因。,病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有发现。,1.2,克服寄主防卫反应的基因：,目前已报道的有植物病原真菌对植保素解毒酶基因（,pda,）。,2,决定不亲和性的基因,2.1,无毒基因（,avr,）,无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作用，如番茄叶霉病菌的无毒基因,avr9,编码,63,个,AA,的多肽。而有些是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因,avrD,的产物是,3.4104u,的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。,TMV,的外壳蛋白在含有,N,抗病基因的烟草中是过敏反应的激发子；其,avr,表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动蛋白基因也具有无毒基因的功能（,Padgett et al,，,1993,）。,2.2,决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）,目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激发子。韦忠民（,1993,）证明梨火疫病菌,hrpN,的编码蛋白（,harpin,）具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。,第二节 植物病毒的侵染过程 与致病相关基因,1,侵染过程（自学）,王金生,.,分子植物病理学,.,中国农业出版社，,1999.,肖火根,.,病毒在植物体内的运转,.,病毒学报,2001,17(3):282-287.,张振臣,.,植物病毒胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究,进展,.,农业生物技术学报，,2000,8(4):403-408.,曹雪松,.,植物病毒在胞内和胞间运动的研究,.,莱阳农学院学报，,2002,19(4):251-252.,2,植物病毒致病相关基因,2.1,外壳蛋白基因,（,coat protein gene,）,R.Beachy(1986),首次将,TMV,的,CP,基因转入烟草，培育出稳定遗传的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少,15,个病毒组中,30,种病毒的,CP,基因，并成功转化了,20,多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。,CP,基因的抗性机理,：（,1,）抑制病毒脱壳。（,2,）干扰病毒的复制。（,3,）限制病毒粒子的扩展与运转。（,1,）,CP,基因所表达的,mRNA,与侵入病毒,RNA,之间相互作用,（,RNA,介导的病毒抗性,）。,存在的问题,（,1,）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少。（,2,）具有潜在危险性。,2.2,复制酶基因,（,replicase gene,）,病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有,RNA,聚合酶中的,Gly-Asp-Asp,三肽基元序列（,GDD motif,）,对维持聚合酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（,NTP binding domain,），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。,Zaitlin et al(1990),将,TMV,的,54KD,蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。,复制酶介导抗性的特点：,（,1,）,对完整病毒粒子和裸露病毒,RNA,均具有高度抗性。,（,2,）,抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。,（,3,）,抗性持续时间长，并对高温（,31,）不敏感。,（,4,）,具有明显的株专化性。,抗性机理：,（,1,）,在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径。,（,2,）,在,RNA,水平上，转录出的,mRNA,与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是,mRNA,诱导了植物的自然抗性。,缺损型复制酶基因也可以介导抗性,。,T.M.Anderson et al(1992),将,TMV Fny,株系的,RNA,内部缺失,94,个核苷酸后导入烟草，结果，缺失造成,ORF,的移码，其翻译产物只有完整的,97KD,蛋白的,75,左右，但仍然表达对,CMV,的高度抗性。,2.3,运动蛋白基因,（,movement protein gene,）,病毒基因编码的基因产物,MP,能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，从而实现病毒在细胞间的运动。,研究证明，完整的,TMV,基因表达并不能介导抗性的产生。,M.Lapidot et al(1993),&,SI Malyshenko et al,（,1993,）将,TMV,的缺陷型,MP,（,dMP,）基因转入烟草后能获得抗,TMV,植株，进一步研究表明，转,dMP,基因的烟草不仅对,TMV,，还对其他病毒如,CMV,、,BMV,等具有不同程度的抗性。由此可见，各种病毒,MP,之间虽然缺乏同源性，但具有相同的功能。,抗性机制：由于缺陷型,MP,与野生型,MP,竞争胞间连丝上的结合位点而实现的。,2.4,卫星病毒,（,satellite RNA,）,某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段,RNA,，它们本身并没有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星,RNA,。携带卫星,RNA,的病毒称为辅助病毒。迄今已报道有,6,组共,26,种植物病毒带有卫星,RNA,。,卫星,RNA,对植物病毒的影响有,3,种表现：,加重症状；无调节作用；减轻症状。,1986,年，,Baulcombe,等首次将,CMV,的,sat RNA,克隆转入烟草，获得了抗,CMV,的基因工程植株。,抗性机制：,卫星,RNA,与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星,RNA,能更有效地占据,RNA,复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，随着复制循环的增加，,sat RNA,的复制量远远大于基因组,RNA,复制量，最终是病毒基因组的复制受阻。,虽然卫星,RNA,只需低水平表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅在侵染晚期发挥作用，而且转基因植物体内减轻症状的卫星,RNA,有可能突变成加重症状的卫星,RNA,，因此具有一定的潜在危险性。,2.5,核酶基因,（,ribozyme gene,）,核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它,RNA,分子的小分子,RNA,。广泛存在于一些类病毒和病毒卫星,RNA,序列中。,根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤头型核酶较为普遍。人们可根据核酶可切割任何生物的,RNA,，而且对底物作用位点的碱基序列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性,RNA,人工核酶。目前，人工核酶已成功应用于动物细胞，在体外实现了对,HIV,等有害基因转录物的特异性切割。在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒（,PSTV,）等的基因组,RNA,的核酶、能切割苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体内表达不如体外表达有效。,该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞,RNA,作为靶,RNA,切割而破坏细胞正常功能。,第三节 植物病原细菌的致病相关基因,1,基因克隆的策略和研究方法,1.1,基因克隆策略,1.2,突变诱变方法,1.2.1,物理诱变,1.2.2,化学诱变,1.2.3,转座子诱变,突变方法,1.,物理诱变 紫外线（,UV,）、,X,射线和,、,射线诱变；,离子束,诱变，,离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放射线；中子,2.,化学诱变,化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如,亚硝基胍,(NTG,）、丫定橙染料、烷化剂如甲基磺酸乙脂（,EMS,）等,3.,转座子插入突变,野生型细菌的基因组文库,物理和化学诱变获得的突变体,两亲交配或三亲交配进行功能互补,获得能恢复突变体表型的阳性克隆,克隆片段的亚克隆分析和进一步功能互补验证,基因的克隆、测序和序列分析,热激或电激转化转座子质粒,接合实验,转座子插入突变,转座子诱变,致病性测定，获得致病性发生变化的突变体,获得相应的突变体,以转座子的侧端序列为探针进行,Southern,杂交，确定转座子插入的拷贝数，明确突变表型是由于转座子的插入引起得,突变体的遗传稳定性分析,Fig.Symptoms expressed on citrus leaves 2weeks after inoculation with,X.campestris,pv.citri XW47(A),XT906(B),or XT906(pUW906XAp)(C).,Requirement for Phosphoglucose Isomerase of,Xanthomonas campestris,in Pathogenesis of Citrus Canker.,Appl.Envir.Microbiol.1999;65:5564-5573,Fig.Structural organization of the,pgi,(A)and,hrpX,(B)loci of,X.campestris,pv.citri and of plasmids derived therefrom.(A)Restriction map of the genomic region containing,pgi,showing the orientation of the gene(horizontal arrow)and the site of transposon insertion in the mutant XT906.(B)Restriction map of the genomic region containing,hrpX,showing the orientation of the gene(horizontal arrow)and the structure of the plasmid pUW10PGUS,which contains an,hrpX,:,gus,fusion gene.,Wei Qian et al.,Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of,phytopathogen,Xanthomonas campestris,pv.,Campestris,Genome Res.2005;15:757-767,A schematic illustration of the experimentally determined interaction between Xcc and host cell,1.3,基因文库的构建,构建基因文库常用的载体有质粒（,plasmid,）、黏粒（,cosmid,）和,噬菌体,(phase,),。适用于作基因克隆的质粒载体必须具备,3,个共同的组成部分，即复制因子、选择标记和克隆位点。,理想基因文库应具备的条件：,（,1,）,以一种稳定的形式含有基因组,DNA,的序列。,（,2,）,克隆总数不宜过大。,（,3,）,文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。,（,4,）,克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。,（,5,）,应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。,（,6,）,克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于,chromosome walking,。,（,7,）,克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何载体序列。,（,8,）,文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。,1.4,基因克隆,1.4.1,转座子表签法,1.4.2,鸟枪法,在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行，用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到,E.coli,中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。,1.4.3,基因功能互补法,常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。,1.5,克隆片段的亚克隆分析,2,与病理过程有关的基因,植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定植和侵入。,已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因,chvE,与其细菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的,picA,基因还影响细菌的聚集而与毒性有关。,A.Kelman,等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研究，该基因为,phcA.,2.1,与病原菌侵染有关的基因,2.2,决定显症的基因,植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用；毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。,黄单胞菌中一个,800bp,的,opsX,基因参与,LPS,的生物合成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的,pthA,基因是引起增生性溃疡症状所必需的。,D.W.Gabriel,et al(1995),2.3,决定寄主范围的基因,2.3.1,正向调控寄主范围的基因,根癌土壤杆菌（,Agrobacterium tumefaciens,）,青枯假单胞菌（,Pseudomonas solanacearum,）,黄单胞菌水稻白叶枯枝病致病变种（,X.Oxyzae pv.oxyzae,）,2.3.2,负向调控寄主范围的基因,植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表现小种品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相应的无毒基因则表现小种品种互作的亲和反应，所以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范围的负向调控基因。,此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不同致病变种的致病能力上。,植物病原细菌无毒基因的克隆,B.J.Staskawica,（,1984,）首先通过基因互补法从大豆丁香假单胞,6,号小种中筛选到一个具有无毒基因功能的克隆，,Napoli,（,1987,）将此基因命名为,avrA,。此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到,40,多个无毒基因。,无毒基因的表达和调控,以,P.syringae pv.glycinea,中,avrB,为代表，其不能在富加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水平依赖于碳源。在侵染期间，,avrB,在感病或抗病寄主上都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不受特异性植物因子调控。,以,X.campestris pv.Vesicatoria avrBs3,为代表，能在富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表达不依赖于,hrp,基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的,hrp,基因，可能是需要,hrp,基因编码的无毒蛋白通道。,无毒基因的生理功能,研究表明,许多植物病原细菌中存在着无毒基因的隐性同源序列,但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应的功能外，还有其自身的生理功能。,无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物致病性或适应性的功能。,无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒基因作用而在另一种病原物中起致病作用。,无毒基因与,hrp,基因互作,无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的,hrp,基因介导的机制分泌。,近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产物是通过,hrp,基因簇所编码的,型通道分泌系统运送至细菌细胞外与寄主发生相互作用的。,2.4,决定病原菌致病性或毒性的基因,2.4.1,胞壁降解酶基因,果胶酶基因,果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（,P.solanacearum,）中也起作用，现已在至少,5,种病原细菌中克隆到果胶酶基因。,除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出,4,种胞外酶基因。,纤维素酶基因,蛋白酶基因,编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。,在荧光假单胞（,P.flouorescens,）胞外酶对马铃薯块组织的浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王金生等（,1984,）研究表明，,3,中软腐病菌产生的蛋白酶在离体条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。,2.4.2,毒素基因,植物病原细菌的毒素一般是低分子量的非寄主专化性毒素。这一特征有利于对毒素进行遗传分析，又由于生物测定是可以敏感微生物代替寄主植物进行生物测试，因此筛选程序简单、快速。目前已对,4,种丁香假单胞致病变种的毒素进行了遗传分析。,致病变种毒素,TOX,菌株类型 毒性表现,pv.tomato/coronatine,Tn5,突变体,仅产生小病斑，菌群增长不大,pv.phaseolicola/phaseolotoxin,UV,突变体,菌群发育正常，但无症状出现,pv.syringae/syringomycin,Tn5,突变体,在樱桃上降低毒性或完全丧失毒性,pv.tabaci/tabtoxin,自然突变体,接种,3d,细菌生长曲线与野生型不同,2.4.3,胞外多糖基因,研究证明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米细菌性枯萎病菌和甘蓝黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖与其致病性有关。,2.4.4,植物激素基因,致病细菌诱导植物组织过度生长是由于细菌产生植物激素的作用。这些激素的遗传决定因子在油橄榄癌肿病假单胞菌和根癌土壤杆菌中已有详细研究。,2.4.5,hrp,基因,Hrp,基因的鉴定,P.B.Lindgren(1986),用转座子,Tn5,对菜豆晕斑病菌（,P.syringae pv.phaseolicola,）进行随机插入诱变，筛选出,6,个突变体，它们既失去在感病菜豆品种上的致病性，同时也不再引起非寄主植物如番茄、大豆、烟草和豇豆的过敏性坏死反应。,Southern,杂交和标记交换分析证明，这些突变体表型改变是由于单个,Tn5,插入的结果。从野生型基因文库中筛选到一个黏粒,pPL6,，可以恢复所有,6,个突变体的,hrp,突变表型，说明该黏粒上带有,hrp,基因，且,hrp,基因是由多个基因组成的基因簇。,Hrp,基因的结构和功能保守性,以,P.s.pv.syringae,的,hrp,基因为探针与该病原的其他,8,个致病变种的基因组,DNA,进行杂交，结果都表现出同源性，但不同致病变种间的杂交信号强度有差别。,研究证明，不同病原细菌的,hrp,之间也存在同源性，,E.amylovora,的,hrp,至少与,8,种植物病原细菌基因组,DNA,有同源性，其中包括在植物中不引起,HR,的,E.stewartii,和,E.chrysanthemi,。此外，还发现非病原细菌,E.coli,也含有一些能互补,E.amylovora,hrp,突变体的基因。,根据,hrp,基因的,DNA,杂交和异源互补研究结果，植物病原细菌可以归类为两组,（,1,）包括青枯假单胞和甘蔗黑腐黄单胞的致病变种，其,hrp,基因簇是共线性的，以相对较高的严谨度相互杂交，且同源性涉及到,hrp,基因的大部分；（,2,）包括丁香假单胞的致病变种和梨火疫病菌，其,hrp,基因在同一组菌之间具有同源性，但两组菌之间的,hrp,基因不存在同源性。,植物病原菌中的,hrp,基因的广泛存在及保守性说明了许多不同植物病害具有共同的机制，并且可能编码与病害表达有关的具有致病功能的因子，但其随病原细菌的不同而有差异，,hrp,基因的,DNA,序列在不同类型生物体之间的相似性也说明了它们在系统发育中的高度保守性。,Hrp,基因的表达和调控,环境诱导和抑制信号,植物成分的诱导,调节基因,Hrp,基因产物及其功能,Hrp,基因是一类基因产物未知的基因，已报道的产物多是根据,Hrp,基因的,DNA,序列分析推测出来的。,1992,年韦忠民等首先从,E.amylovora,中分离出一个激发过敏反应的蛋白，定名为,Harpin,Ea,由,Hrp,基因编码。该蛋白为细菌外膜相关蛋白，富含,Gly,，热稳定，对蛋白酶敏感，不具泌出蛋白特性。,功能,：,（,1,）调节蛋白的功能；（,2,）跨膜蛋白泌出功能；（,3,）编码无毒基因功能；（,4,）调节无毒基因表达功能；（,5,）信号识别功能。,2.4.6 dsp,基因,只影响寄主植物的侵染能力，而不影响在非寄主植物上诱导过敏反应能力的基因称为,dsp,基因。它们与病菌的侵袭力和代谢能力有关。一般认为，,dsp,基因在其基因组中是分散排列的，而在质粒上是成簇排列的。,2.4.7,