毕业实习报告--山东半岛沿海地区腐生真菌种类和分布研究.doc

毕业实习报告

实验题目：山东半岛沿海地区腐生真菌种类和分布研究
实验原理：
腐生真菌不仅在自然生态循环过程中有着重要作用，而且作为真菌中的重要一种，在真菌中也占有相当重要的地位。腐生真菌在自然界中广泛存在，具有繁殖快、适应能力强以及形态多样等特点，同时，由于腐生真菌素具有出色的分解能力，在当今这个越来越要求环保处理废弃物的时代，腐生真菌的快速、无残留、无污染的分解机能越来越受到重视。另外，腐生真菌的代谢产物和次级代谢产物中存在具有潜在应用价值的种类，因此，腐生真菌越来越受到人们的高度重视，成为国内外研究的热点之一。
作为一门基础学科，真菌分类学在真菌学乃至整个生物学的研究中占有重要地位，与其他相关学科具有密切的联系。真正意义上的植物病原真菌分类大约有300多年的历史,其分类方法随着其它技术在真菌分类学上的应用而发展,常用的方法主要有常规形态分类法、电镜技术分类法、数值分类法、化学分类法和分子生物学分类法。虽然分类技术越来越多样化，而且在当代真菌的分类已经使用DNA和PCR等分子方面的高科技的技术，力争在分子方面给予精确的鉴定，但是根据形态特征进行分类仍然是真菌分类的基础，目前其他的分类技术只是作为补充，所以做好基础的形态鉴别工作是必不了少的。
由于地理和气候原因，山东半岛沿海岸地区的微生物的种类相对较多，为真菌的研究提供了各种珍贵的自然资源。这一地带的标本资源丰富，诸多标本具有代表性。由此也能看出这里独特的自然资源和宝贵的真菌的原料。但根据资料检索，山东半岛沿海岸地区的腐生真菌的报道很少，这与其应有的丰富的真菌资源尤其是腐生真菌资源的实际情况极不相衬。本研究旨在通过标本采集和腐生真菌的种类鉴定，初步鉴定其常见腐生真菌的种类与分布，为今后更好的挖掘利用该地区丰富的腐生真菌资源贡献微薄之力。
腐生真菌的存在，为真菌的研究开辟了一个新领域，极大地丰富了生物多样性的内容，使我们对生物多样性有了很深的了解和认识，也为新时代的废弃物无污染处理提供了新思路。深入了解腐生真菌的分类和进行腐生真菌的多样性研究，无论是出于理论基础还是未来生物应用新思路，都具有极其重要的意义。
植物病原真菌的分类是随着其它学科的发展而发展的,从最早的形态分类到现在越来越多被应用的分子生物学方法,其分类的结果也越来越精确,更符合生物系统发育的结果。虽然现今真菌分类技术十分先进，但笔者认为，先进的真菌分类技术在某种意义上无法替代传统真菌分类方法。即：由分子生物学所带来的现代真菌鉴定技术，无法完全替代以真菌形态学为基础的传统真菌分类方法。现代真菌分类学的基础还是真菌形态学,在应用分子生物学技术时首先必须对真菌进行准确的鉴定,如果形态鉴定本身不准确,那么用分子生物学技术进行的分类就成了无本之源。同样,用分子生物学性状可以验证形态学特征的可靠性和增加我们对形态学性状进化的了解,二者是辨证统一的关系。现代真菌分类学正向全形态(holomorphy)过渡,对分类方法的要求是: ①分型性高; ②分辨力强; ③重复性好; ④简单易行; ⑤成本低。同时,还必须结合形态特征、结构、解剖、代谢、生态学、分子生物学性状等综合考虑才能达到要求。因此,在具体分类工作中,应该根据物种的“全形态”概念找出物种间彼此的相关性关系,充分挖掘物种形态学性状、分子性状、生化性状和生理性状等信息,综合分析和考虑,这样才能建立自然的生物进化系统关系。
实验材料：2010年7、8月在威海、青岛、烟台等沿海城市周边地区，采集的枯朽木生腐生真菌标本。
实验器材：OLYMPUS-SZ-II体视镜、尼康ALPHAPHOT-2 YS2显微镜、三星VLUU L730数码照相机 、挑针 、无菌操作台、玻片等。
实验方法：
1.真菌的采集方法
直接采集林中和水源附近的植物残体，包括枝条、茎杆、木块等装入压口无菌塑料袋，并用标签注明采集时间以及采集地点等事项，带回实验室。将采集回的标本放在实验室密封性好的无菌的塑料盒子中，盒子底部平铺几层湿润的滤纸，密封后在室温下保存3-7天，期间随时检查和观察真菌。
2.真菌的检查方法
（1）直接检查法：将标本放于实验台上，在连续变倍体视镜下检查，对检查到的真菌的标本部位直接分离做玻片，观察、描述、测量孢子大小并照相，在材料上标出子实体的位置。放入标本袋中，记录采集地、采集时间记录，贴好标签。
（2）湿室诱培法：对孢子未形成或未发现有子实体，子囊发育不全的材料，放入消毒的保湿缸中，底部铺上灭菌的湿滤纸，室温下培养。3-7天后即可以开始定期检查，持续一个月。定期检查保湿情况，以防止环境干燥。
3. 真菌的制片方法
（1）临时玻片的制作：体视镜下观察基质，用挑针挑取子实体，放于以无菌水做浮载剂的玻片中。有时需对附属丝或胶质鞘观察，必要时用染色液（如棉兰，蓝墨水，0.1%甲苯胺蓝，苏木精，亚甲蓝等）。玻片做好后于显微镜下观察，测量，描述孢子形态，照相。在显微镜下检查时玻片制片由于无菌水浮载剂很容易干燥，因此须对玻片及时补充水分，以防玻片干燥。
（2）永久玻片的制作：对于已经观察、描述、测量及照相后的玻片，需制成永久玻片，进行保存。方法：滴一滴乳油（0.05ml）在盖玻片的边缘，乳油会慢慢渗入到盖玻片下代替淡水做浮载剂，然后将载玻片放入50~55℃烘箱中进行烘片，等到多余的乳油挥发后，取出，使用用中性胶封片，封片剂完全干后，在右侧贴好标签，注明名称及制作日期，制作人，放入玻片盒中保存[9]。
4.真菌的鉴定方法
本论文的真菌分类地位及种的记录数均参照《Index Fungorum》与《真菌志》，结合其他相关文献进行鉴定。对子实体已经成熟的，挑取，在显微镜下观察其形态，颜色；测量子囊和子囊孢子的大小。有时仅从孢子形态并不能鉴定出结果，还需要做切片，观察子实体内部结构，以区分近似种。所有真菌均在OLYMPUS-SZ-II体视镜下检查挑取制片，所有标本均在显微镜下观察、测量、照相及鉴定，所有照片都是用三星VLUU L730数码照相机显微照相。
实验结果：
共观察了30多份标本，初步鉴定出3个属的5个种，包括Diaporthe syngenesia、Diatrypella favacea、Diatrypella quercina、Pleospora calvespora、Pleospora epilobii，该研究结果对于山东半岛沿海地区的腐生真菌资源的保护和利用具有重要意义。
2.1间座壳菌属Diaporthe
Diaporthe Nitschke, (1870)
特征：子座发达，黑腐皮壳型或真腐皮壳型，常几乎不存在，在皮层内形成，铺展形，由基物变质而成，不呈鲜色仅存黑色边缘，寄生于枝幹，少数生于针；子囊壳以长颈伸出于座；子囊果壁亚革质，内部灰色，有长喙；子囊梭形，有或无侧丝；子囊孢子双细胞很小相等，含油球2-4个，长圆形至梭形，无色。无性世代常为拟茎点菌，产生椭圆形或卵形的分生孢子和线形的柄生孢子。
模式种：Diaporthe angelicae (Berk.) Wehm. Nitschke, (1870)
分类地位：子囊菌门Ascomycota；粪壳菌纲Sordariomycetes；间座壳菌目Diaporthales；间座壳菌科Diaporthaceae；间座壳菌属Diaporthe.
2.1.1 Diaporthe syngenesia
Diaporthe syngenesia (Fr.) Nitschke ex Fuckel, (1870) 图1
特征：子囊壳直径1mm，埋生在子座内，7-15个聚集丛生，具长颈竖直露出，壁亚革质，内部灰色，有长喙；子囊45-56 X 8-12μm，梭形，柄短，多孢子的，无侧丝；子囊孢子12-12 X 2-3.5μm，双细胞很小相等，末端稍尖，成熟后1个隔膜，含油球2个，梭形，无色透明。
标本信息：采集地：青岛城阳棉花社区；采集时间：2010.07.18；采集人：路炳声
2.2 假蕉孢壳属Diatrypella
Diatrypella (Ces.&De Not.) De Not., Sfer. Ital.:29 (1863)
特征：子座大多发达，穿皮壳形，多少与蕉孢壳相似，逐渐外露；子囊果为子囊壳密集，埋生在发达的真子座或假子座，常具长颈，孔口具沟槽，囊间组织由柱形的侧丝构成；子囊具长柄，顶端近平截，长棍棒状，无色，单层壁，有柄，侧丝呈丝状且有隔膜；子囊孢子腊肠形；无性世代为盘明针孢，无性型为腔孢菌，为枝干上的腐生菌或寄生菌，分布广泛。
模式种:Diatrypella verruciformis (Ehrh.) Nitschke,Pyrenomycetes Germanici 1:76 (1867)
分类地位: 粪壳菌纲Sordariomycete；炭角菌亚纲Xylariomycetidae； 炭角菌目Xyariales；蕉孢壳科Diatrypaceae；假蕉孢壳属Diatrypella.
2.2.1 桦小蕉孢壳 Diatrypella favacea
Diatrypella favacea (Fr.) Ces. & De Not., Schema di Classif. Sferiacei (1863)图2
特征：子囊壳直径约0.8mm，近球形，单生或群生，埋生或半埋生在基质上，孔口的颈部竖直露出，一直延伸到基质的外面。子囊123-157X 11-14μm(平均125X16μm, n=20 )，长棍棒状，无色，单层壁，有柄，内多孢子，侧丝呈丝状且有隔膜。子囊孢子7-8 X 1-2μm (平均7X2μm,n=20)，孢子无数，不规则的堆积，淡黄色，单细胞，腊肠状。
标本信息：采集地：烟台昆嵛山；采集时间：2010.08.19；采集人：于辉霞
2.2.2 栎小蕉孢壳 Diatrypella quercina
Diatrypella quercina (Pers.) Cooke, (1866)图3
特征：子囊座直径约2mm，垫状，黑褐色至黑色；子囊壳直径约0.6-0.7mm，埋生在发达的子座内，具长颈竖直露出，孔口具沟槽。子囊108-140 X 11-15μm，长棍棒状，多孢子，无色，单层壁，有柄，侧丝呈丝状且有隔膜。子囊孢子8-12 X 2-3μm，淡黄色，单细胞，稍弯曲腊肠状，孢子无数呈不规则的堆积。
标本信息：采集地：威海乳山岠嵎山；采集时间：2010.08.07；采集人：于辉霞
2.3 格孢腔菌属Pleospora
Pleospora Rabenh. ex Ces. & De Not., (1863)
特征：子囊座球形，黑色，顶部光滑而无刚毛；子囊圆筒形，内含孢子8个；子囊孢子卵形，壁砖状分隔，无色或黄褐色；有拟侧丝；（孢子无附属丝）。
模式种：Pleospora herbarum (Pers.) Rabenh. ex Ces. & De Not., (1863)
分类地位：座囊菌纲Dothideomycetes；格孢腔菌目 Pleosporales；格孢腔菌科Pleosporaceae；格孢腔菌属 Pleospora.
2.3.1 Pleospora calvescens
Pleospora calvescens (Fr. ex Desm.) Tul. & C. Tul., (1863)图4
特征：子囊壳直径约0.2mm，着生在子座的黑色部，顶部光滑无毛，边缘和底部生有硬的深褐色的菌丝；子囊100-128 X 10-14μm，圆筒形，内含孢子8个；子囊孢子15-21 X 6-8μm，卵形，壁砖状分隔，有3个横向隔膜和1-2个纵向隔膜，淡黄色。
标本信息：采集地：青岛城阳棉花社区；采集时间：2010.07.18；采集人：路炳声
2.3.2 Pleospora epilobii
Pleospora epilobii E. Müll. 1951, Sydowia 5(3-6): 290 图5
特征：假子囊壳直径约0.15mm，埋生于发达的子座内，外表层着生长的褐色菌毛；子囊82-124 X 11-14μm，圆筒形，内含孢子8个；子囊孢子18-23 X 7-9μm，卵形，砖格状分隔，黄色
标本信息：采集地：青岛城阳棉花社区；采集时间：2010.07.18；采集人：路炳声
实验问题：
1. 体视镜的使用方法不到位。有不少标本上的真菌样本体积较小，且由于样本多为腐木，木屑与真菌样本混合，急需体视镜进行出不选择样本，但由于笔者的体视镜使用方法不到位，导致选取的不少样本中所含真菌并不适合鉴定。
2. 制作切片技术有待加强。有些样本在做切片时要求较好的技术，由于笔者技术不到位，有很多较好的样本切片过厚，导致显微镜下观察不清，影响鉴定。
3.显微境的使用方法掌握的不到位，焦距调整不清楚导致有时无法找到玻片中的真菌样本，显微照相时，操作方法不对导致相机镜头与目镜无法较好衔接，照出的相片带有大量阴影，清晰度也不是很理想。
4.采用直接挑取法分离真菌时，有时检查不仔细，导致漏掉一些小的子囊果，而且有时操作方法不对，挑取不到子囊果。
5.对未发现有子实体或孢子未形成或子囊发育不全的材料，由于保存的方法不恰当或是保存的环境不适合其生长，导致真菌生长不起来，而是导致其他细菌的生长，没有得到想要的菌种。
6.对于制作玻片的技术掌握不到位，以至于制作的片子在显微镜下观察不清楚，不能很好的把真菌的形态特征表现出来，在鉴定的过程中对真菌的形态把握不准，难于初步鉴定。
7.由于玻片制作技术有限，再加上由形态学鉴定真菌具有一定难度，所以大多数真菌没能鉴定出。
8.由于我们平时的积累较少，在实验室和图书馆里的真菌鉴定书籍有限，给我们的鉴定带来很大的困难。我们只能借助网络版，http://www.indexfungorum.org/来初步鉴定真菌，这里必定存在一些问题。
实验心得：
经过一个多月的实习，不仅锻炼了自己的动手能力，熟悉并掌握了基本的实验技能，为以后的工作学习积累了经验，加深了对腐生真菌的认识，也了解到了一个具有潜力的领域，这段时间的学习实践为自己提供了宝贵的经验。
实验过程虽然难度较大，但是在 博士及师兄师姐以及同学们的帮助下还是顺利完成了实验。检查到腐生真菌5种，也了解到其他类真菌（如水生真菌）的各种知识。