T∕NAIA 0279-2024 土壤中蛋白酶活性的测定.pdf

ICS 65.050.01CCS A 05ICS 65.050.01CCS A 05 团 体 标 准团 体 标 准 T/N A I A 0 2 6 2 0 2 1T/NAIA 02792024土壤中蛋白酶活性的测定土壤中蛋白酶活性的测定Determination of the proteases activity in soil2024-01-25 发布2024-01-31 实施 宁夏化学分析测试协会 宁夏化学分析测试协会 发 布发 布发布T/NAIA T/NAIA 027920241前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区农业勘查设计院、宁夏中科精科检测技术有限公司、宁夏环境科学研究院（有限责任公司）。本文件主要起草人：陈惠娟、马晶、吴秀玲、杨宁权、孙媛、冯婷婷、刘娜娜、崔安良、崔鹏、陈青、雷剑、冯海东、张青、张汀媛、杨波、王蓉、周婷、丁成秀。本文件为首次发布。T/NAIA 027920241 1土壤中蛋白酶活性的测定土壤中蛋白酶活性的测定 1范围 本文件规定了土壤中蛋白酶活性的测定方法。本文件适用于土壤中蛋白酶活性的测定。2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 土壤蛋白酶活性 the proteases activity in soil 以酪素为基质，土壤蛋白酶酶促蛋白物质水解成肽，肽水解成氨基酸。氨基酸与茚三酮生成蓝紫色络合物，依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以表示土壤蛋白酶活性。4原理 采用酪素为基质，利用土壤蛋白酶的酶促作用把蛋白物质水解成肽，肽进一步水解为氨基酸。氨基酸与茚三酮共热反应，生成蓝紫色络合物（特征颜色反应），其颜色深浅程度与氨基酸的含量成正比，用分光光度计测定氨基酸量。并以氨基氮的含量来表示土壤蛋白酶的活性。5试剂 5.1 本试验方法所用试剂和水，除特殊注明外，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 中规定的二级水，所述溶液如未指明溶剂，均系水溶液。试验中所需制剂及制品，除特殊注明外，均按GB/T 603 的规定制备。5.2 磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O）。5.3 磷酸二氢钠溶液c=0.2 mol/L:准确称取 27.80 g 磷酸二氢钠（5.2），溶于水，定容至1000mL，混匀。5.4 磷酸氢二钠（Na2HPO47H2O）。T/NAIA 027920241 25.5 磷酸氢二钠溶液c=0.2 mol/L:准确称取 53.65 g 磷酸氢二钠（5.4），溶于水，定容至1000mL，混匀。5.6 0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液（pH7.4）：量取 19 mL（5.3）溶液和 81 mL（5.5）溶液，混匀，备用。5.7 酪素。5.8 1%酪素溶液：称取 10 g 酪素（5.7），溶于 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）（5.6）中，并用该缓冲溶液定容至 1000 mL，混匀备用。5.9 茚三酮。5.10 丙酮，色谱纯。5.11 2%茚三酮溶液：称取 2 g 茚三酮（5.9），溶于丙酮，稀释至 100 mL。5.12 甲苯。5.13 甘氨酸，优级纯。5.14 0.0200 mg/mL 氨基氮标准溶液：准确称取 0.1000 g 甘氨酸（5.13），溶于水，定容至1000 mL，则得 1ml 含 0.0200mg 氨基氮的标准溶液。即为 0.0200 mg/mL 氨基氮标准溶液。5.15 无水乙醇。6仪器与设备 6.1电子天平(感量 0.01g)。6.2 电子天平(感量 0.0001g)。6.3 恒温培养箱。6.4 高速离心机。6.5 水浴锅。6.7 可见分光光度计。7分析步骤 7.1试液制备 称取过 2 mm 孔径筛的风干土 4g（精确至 0.01 g），于 50 mL 塑料离心管中，加入 1%酪素溶液（5.8）20 mL、甲苯（5.12）1 mL，旋紧瓶盖，摇匀，于 30的恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，取出，冷却。并按 7.1.1 或 7.1.2 方法制备试液。7.1.1 过滤法 将培养液直接过滤，吸取 10 mL 滤液于另一支 50mL 塑料离心管中，加入 20 mL 无水乙醇（5.15），摇匀，常温 10000 r/min 离心 5 min。离心液备用。7.1.2 离心法 将培养液于 10000 r/min 离心 5min，吸取 5 mL 上清液，加入 20 mL 无水乙醇（5.15），T/NAIA 027920241 3摇匀，常温 10000 r/min 离心 5 min。离心液备用。7.2标准溶液的测定 分别准确吸取 0.0200 mg/mL 氨基氮标准溶液（5.14）0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00 mL 于 7 支 50 mL 具塞比色管中，即为 0.00mg、0.0100mg、0.0200mg、0.0400mg、0.0600mg、0.0800mg、0.100 mg 氨基氮，加入 1 mL 2%茚三酮溶液（5.11），用水补足至 5 mL，沸水浴 10 min，将比色管取出后，冷却至室温，用水稀释至刻度。摇匀后，于可见分光光度计 570 nm 处比色，以吸光度为纵坐标，氨基氮的质量为横坐标，绘制校准曲线。7.3试液测定 准确吸取 7.1 制备的试液 2.0 mL 于 50 mL 具塞比色管中，以下操作同标准溶液的测定（7.2）。7.4对照试验 每个土壤样品均做无基质对照，以除掉土壤原来含有的氨基氮而引起的误差。同时做无土壤对照，分析步骤同试样。7.5结果计算 土壤蛋白酶活性（即为氨基氮的含量），以培养24 h 后1 g 土壤中氨基氮的毫克数，用 mg/g 表示。按下列公式计算：（1）式中：土壤蛋白酶活性（即为氨基氮的含量），单位为毫克每克（mg/g）；试液中氨基氮的质量，单位为毫克（mg）；分取倍数；土壤称样量，单位为克（g）。重复试验结果以算数平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度 在重复性条件下，获得两次独立测定结果的相对偏差不得超过20%。mDAXXADm