蛋白质的提取纯化和分析.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质的提取纯化和分析,材料选择和预处理,细胞破碎,蛋白质的粗提,目 录,题目分析,蛋白质的纯化,分析检测,1,题目解析,已知某蛋白的分子量约为,17 kDa,，等电点,3.94.1,，它能耐一定的高温，在,90,C,加热,34 min,后仍然能够保持,80%,的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，,与,Ca,2+,结合后可以暴露它的疏水基团,。,该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂,。,在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为,钙调蛋白。,材料的选择,TEXT,材料的预处理,成年健康雄性大鼠脑组织,20,克（比雌鼠体积大，成本较低物种易获得）,将切取的组织用,4,预 冷,0.01mol/l,的,PBS,漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的,PBS,（磷酸盐缓冲液）,预处理过的组织,细胞破碎（,高速珠磨法,）,制备,组织细胞悬液,（,剪碎法,）,蛋白质被释放出来,3,3,1,1,2,2,破碎,剪碎法,1.,将组织块放入平皿后，加入少量,PBS,；,2.,用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入,10 ml PBS,；,3.,用吸管吸取组织匀浆，用,200,目尼龙网过滤到试管内；,返回,高速珠磨法,破碎机理：,高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图（,1,）。微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞膜破裂，释出内含物。,在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。,钙调蛋白的粗提取,抽提,蛋白质破碎后，使用适当的溶剂，将蛋白质提取溶解到溶剂当中，常用稀酸、稀碱、有机溶剂,等电点3.94.1,酸性蛋白质,稀碱性溶液抽提,溶液碱性的程度，碱性过大则难以复性,pH,调至等电点偏碱的一侧（,4.1,）,粗提取物,离心操作,除去固体杂质的上清液,热变性初步纯化,天然结构,%,钙调蛋白,一般蛋白,100,热稳定性不同,其他方法,盐析法,等电点法,有机溶剂法,3,蛋白质的精纯和分析鉴定,亲和色谱,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,交联试剂,载体,配体,载体与配体交联体,杂质,杂质,游离配体,洗脱,结合,耦联,作用机理,金属螯合亲和层析,钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca,2+,结构域,每个结构域可以结合一Ca,2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca,2+,钙调蛋白与Ca,2+,结合后的构型相当稳定,。,金属螯合色谱,原理：利用固定相载体上偶联的,亚胺基乙二酸为配基,与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相,上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱,氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合,作用而进行分离,NH,2,NH,2,Ni,His,His,His,His,protein,步骤,1.,制作金属螯合亲和,色谱柱,：用浓度为,0.2 mol/L,的,CaCl,2,溶液上柱。,将上清液,PH,调制,6-8,，加入蛋白质解离抑制剂。,慢上样,3.,再用配体,CaCl,2,溶液洗脱，,下方流出为目的蛋白液,，用大使管或者烧杯盛装之。,2.,上柱后依次用,50ml bufferB,、,200ml,含,0.5mol/L NaCl,的,bufferB,洗脱,。下方用大试管或烧杯收集杂质液。,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,步骤,目的：,除去蛋白液中配体离子,方法一：,半透膜,进行透析,方法二：,将上次获得目的蛋白液经,凝胶过滤色谱柱,下方,首次,接受的溶液即为高纯度的,钙调蛋白溶液,；第二次接,受到的即为配体离子的溶,液。,凝胶过滤色谱的洗脱,定性分析,分析鉴定,定量分析,定性分析,分子量,凝胶电泳,质谱,(,可同时鉴定分子量和纯度,),活性,根据蛋白质的功能选用不同的活性检测方法,如：磷酸二酯酶,(PDE),法,常用方法,SDS-PAGE,测定蛋白质的分子量和纯度,MALDI-TOF-MS,测定蛋白质的分子量和纯度,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）测定,蛋白质分子量,用,SDS-PAGE,检测不同纯化,阶段所获得的提取液样品中,CaM,的纯度与相对分子质量。,电泳采用质量分数为,15%,的,分离胶和质量分数为,5%,的浓,缩胶，,120V,电压条件下进行,电泳，直至溴酚蓝达到凝胶,底部，考马斯亮蓝染色，凝,胶成像仪成像。,当分子量在,15KD,到,200KD,之间,时，,蛋白质的移率和分子量的对,数呈线性关系,，符合下式：,logMW=K-bX,若将已知分子量,的标准蛋白质的迁移率对分子,量对数作图，可获得一条标准,曲线,，未知蛋白质在相同条件,下进行电泳，在相同条件下进,行电泳，根据,它的电泳迁移率,即可在标准曲线上求得分子量,。,定量分析,紫外检测法,简单快速,不破坏样品,准确度低,考马斯亮蓝染色法,简单迅速,干扰少,灵敏度高,(1g),Folin-,酚,试剂法,灵敏度高,常用,goals,Folin-,酚试剂法,在碱性条件下蛋白质和铜作用生成蛋白质,-,铜络合物,此络合物将,Folin,试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。,step1,step2,Thank you!,