SN∕T 5642.4-2023 出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字PCR计数法 第4部分：植物乳杆菌.pdf

I C S6 7.0 5 0C C S X0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 6 4 2.42 0 2 3 出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字P C R计数法第4部分:植物乳杆菌D e t e c t i o n o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a i n d a i r y p r o d u c t s f o r e x p o r tE n u m e r a t i o n m e t h o d o f d i g i t a l P C R P a r t 4:L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m2 0 2 3-1 1-0 1发布2 0 2 4-0 5-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件 为S N/T 5 6 4 2 出 口 乳 制 品 中 乳 酸 菌 检 测 方 法 数 字P C R计 数 法 的 第4部 分。S N/T 5 6 4 2已经发布了以下部分:第1部分:青春双歧杆菌;第2部分:两双歧杆菌;第3部分:动物双歧杆菌;第4部分:植物乳杆菌;第5部分:鼠李糖乳杆菌;第6部分:嗜酸乳杆菌;第7部分:副干酪乳杆菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国上海海关、上海市质量监督检验技术研究院。本文件主要起草人:魏咏新、李丹、马丹、魏海燕、杨捷琳、汪琦、张西萌、赵晓娟、杨娟、曾静、张奕南、刘洋。S N/T5 6 4 2.42 0 2 3引 言 乳酸菌是一群通过发酵糖类产生大量乳酸的细菌总称,目前市场上添加乳酸菌的乳制品种类繁多,良莠不齐,由此,对该类产品质量的监管,特别是对其所含乳酸菌种类和数量的鉴定就显得尤为重要。S N/T 5 6 4 2 出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字P C R 计数法 作为出口乳制品检验技术的推荐性行业标准,为出口乳制品中的乳酸菌提供快速定量检验方法。S N/T 5 6 4 2拟由7个部分构成。第1部分:青春双歧杆菌。目的在于提供出口乳制品中青春双歧杆菌的微滴式数字P C R计数方法。第2部分:两双歧杆菌。目的在于提供出口乳制品中两双歧杆菌的微滴式数字P C R计数方法。第3部分:动物双歧杆菌。目的在于提供出口乳制品中动物双歧杆菌的微滴式数字P C R计数方法。第4部分:植物乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中植物乳杆菌的微滴式数字P C R计数方法。第5部分:鼠李糖乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中鼠李糖乳杆菌的微滴式数字P C R计数方法。第6部分:嗜酸乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中嗜酸乳杆菌的微滴式数字P C R计数方法。第7部分:副干酪乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中副干酪乳杆菌的微滴式数字P C R计数方法。S N/T5 6 4 2.42 0 2 3出口乳制品中乳酸菌检测方法数字P C R计数法 第4部分:植物乳杆菌1 范围本文件规定了出口乳制品中植物乳杆菌的微滴式数字P C R计数方法。本文件适用于乳制品中植物乳杆菌的微滴式数字P C R快速定量检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.3 5 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1定量限 l i m i t o f q u a n t i f i c a t i o n;L O Q在相对标准偏差不超过2 5%的条件下,方法所能定量检测的目标菌最低含量。3.2微反应体系 t i n y r e a c t i o n s y s t e m 将含有模板、引物/探针、T a q酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴中所形成的小体积荧光P C R反应体系。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u l e i c a c i d)d d P C R:微滴式数字P C R(d r o p l e t d i g i t a l p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)PMA:叠氮溴化丙锭(p r o p i d i u m m o n o a z i d e)p l n F:植物乳杆菌素基因(p l a n t a r i c i n F g e n e)5 方法原理PMA是一种具有D NA高亲和力的光反应染料,在强可见光下可与待测样本中死菌或游离双链1S N/T5 6 4 2.42 0 2 3D NA形成共价连接,从而阻止死菌或游离D NA的后续P C R扩增,确保数字P C R检测到的结果来源于样本中的活菌细胞。针对植物乳杆菌单拷贝基因p l n F保守序列设计引物/探针。将含有引物/探针、样品D NA及反应预混液的数字P C R反应体系分布到大量微反应体系中,然后进行P C R扩增。p l n F基因探针5 端标记F AM荧光基团,通过对每个微反应体系的荧光信号进行采集分析,判断每个微反应体系的扩增结果,根据微反应体系阳性率和泊松分布公式计算出数字P C R反应体系中p l n F基因拷贝数,并根据样品稀释倍数、提取D NA溶解体积以及数字P C R反应体系中加入的模板D NA量等参数来计算样品中植物乳杆菌的含量。6 主要设备及耗材6.1 天平:感量0.1 g。6.2 均质器。6.3 恒温培养箱:3 6 1。6.4 高速台式离心机:离心力1 2 0 0 0 g。6.5 涡旋振荡仪。6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7 卤钨灯:5 0 0 W6.8 d d P C R系统:微滴发生器或其他具有同样功能的仪器、微滴荧光检测仪或其他具有同样功能的仪器。6.9 P C R扩增仪。6.1 0 不同量程移液器:1 0 0 L1 0 0 0 L、2 0 L2 0 0 L、1 0 L1 0 0 L、0.5 L1 0 L。6.1 1 离心管:2 mL、1.5 mL和0.2 mL。6.1 2 d d P C R微滴生产连排管及覆膜。7 材料与试剂7.1 仅使用分析纯试剂和符合G B/T 6 6 8 2规定的一级水。7.2 革兰氏阳性细菌基因组提取试剂盒。7.3 d d P C R反应配套试剂。7.4 无菌磷酸盐缓冲液:0.0 1 m o l/L,p H 7.2。7.5 PMA溶液:将1 m g PMA染料溶于1 mL 2 0%二甲基亚砜中制成1 m g/mL的PMA储存液,置于-2 0 避光可保存1年。将PMA储存液用无菌水稀释1 0倍后作为工作液,临用前现配。7.6 阳性对照:植物乳杆菌标准菌株D NA,或含目的片段的D NA。7.7 阴性对照:其他乳酸菌标准菌株D NA。7.8 引物和探针:根据表1的序列合成引物和探针,加入超纯水配成1 0 m o l/L浓度,扩增序列见附录A。表1 植物乳杆菌引物和探针序列靶基因名称引物/探针名称序列(5-3)扩增长度p l n Fp l n F-FG C G T GA C C G T GAA T TAAA T G Cp l n F-RG G C C C AA C AG C A C T T T TA TAA T T Gp l n F-PF AM-T T T T C C A T G C C TA TAG C G C G C G T G-TAMR A9 3 b p2S N/T5 6 4 2.42 0 2 38 操作步骤8.1 样品制备按照G B 4 7 8 9.3 5中方法进行样品制备。8.2 D N A提取吸取适宜稀释度的样品匀液1 mL,1 2 0 0 0 g离心5 m i n,尽量吸弃上清;利用1 mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀,加入2 0 L PMA工作液,使PMA终浓度为2.0 g/mL,黑暗环境中孵育1 0 m i n;将离心管(管口朝上,置于冰上)于5 0 0 W卤钨灯下2 0 c m处照射1 0 m i n,期间每隔5 m i n进行颠倒混匀;取出PMA处理后的样品匀液1 2 0 0 0 g离心1 m i n,尽量吸弃上清。得到的菌体沉淀利用革兰氏阳性菌基因组取试剂盒提取D NA,操作方法按试剂盒说明书进行。8.3 D N A浓度和纯度测定取适量D NA原液加双蒸水稀释一定倍数后,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定2 6 0 n m和2 8 0 n m处的吸收值,按照公式(1)计算D NA的浓度。=A2 6 0N5 0(1)式中:D NA浓度,单位为微克每毫升(g/mL);A2 6 0 2 6 0 n m处的吸光值;N 核酸稀释倍数。当D NA浓度为0.1 g/mL1 0 0 g/mL,A2 6 0/A2 8 0在1.82.0之间时,适宜于d d P C R检测。8.4 d d P C R检测8.4.1 对照和平行检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以植物乳杆菌标准菌株D NA或含目的片段的D NA作阳性对照,其他乳酸菌标准菌株D NA作为阴性对照,用等体积的双蒸水代替D NA模板作为空白对照。每个待检样品提取的D NA溶液进行3个平行d d P C R检测。8.4.2 反应体系按照表2配制反应体系。表2 d d P C R反应体系试剂名称储备液浓度终浓度体积数字P C R反应预混液211 0 Lp l n F-F1 0 m o l/L0.7 5 m o l/L1.5 Lp l n F-R1 0 m o l/L0.7 5 m o l/L1.5 Lp l n F-P1 0 m o l/L0.2 5 m o l/L0.5 LD NA模板5 L水1.5 L体系总体积2 0 L3S N/T5 6 4 2.42 0 2 38.4.3 微滴生成将配制好的d d P C R反应混合液,加入微滴生成装置加样孔中,按仪器操作说明生成微滴。8.4.4 d d P C R扩增将生成的微滴缓慢转移至9 6孔板中,封膜后置于P C R仪上,按以下参数进行P C R扩增:9 5 1 0 m i n(升降温速度:1/s);9 4 3 0 s(升降温速度:1/s),6 0 1 m i n(升降温速度:1/s),4 5个循环;9 8 1 0 m i n(升降温速度:1/s),4 保存反应产物。注:P C R反应参数根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。8.4.5 荧光信号读取扩增反应结束后,将9 6孔板放入d d P C R检测仪中对每个微滴进行荧光检测,采用F AM通道读取荧光信号。9 结果分析与表述9.1 阈值的设定根据空白对照的终点荧光值设定阈值限,阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。9.2 质量控制9.2.1 体系分隔产生的有效微滴的总数量满足所用d d P C R仪器型号要求。9.2.2 阴性对照和空白对照无荧光信号检出。9.2.3 阳性对照有荧光信号检出且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开。9.2.4 以上质控条件有一项不符合者,实验结果视为无效,查找原因后再次进行d d P C R检测。9.3 结果计算每份样品的3个平行重复检测结果的相对标准偏差不超过 2 5%时,根据公式(2)计算:C=Nm e a nV1V2V3dM(2)式中:C 样品中植物乳杆菌含量(拷贝/g或拷贝/mL);Nm e a n 2 0 L d d P C R反应体系中测得核酸拷贝数的3个平行重复平均值(拷贝);V1 提取D NA的最终定容体积,单位为微升(L);V2 d d P C R反应体系中加入的D NA模板体积,单位为微升(L);V3 提取D NA时吸取的样品匀液体积,单位为毫升(mL);d 用于提取D NA的样品匀液稀释因子,如11 0的样品匀液,d为1 0-1;M 模板的稀释倍数。9.4 结果表述待检样品有荧光信号高于阈值限的阳性微滴,且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开,根据公式(2)计算样品中植物乳杆菌含量,按“四舍五入”原则修约后,结果保留两位有效数字,检测结果表述为“拷贝/g(mL)”。注:一个单拷贝目标基因对应一个菌体细胞,因此“1拷贝/g(m L)”对应“1 C F U/g(m L)”。数字P C R定量结果参4S N/T5 6 4 2.42 0 2 3考以C F U/g(m L)为标识单位的限量值进行结果判定。1 0 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8中附录D的规定执行。1 1 定量限出口乳制品中植物乳杆菌微滴式数字P C R计数方法的定量限为1 05 C F U/g(mL)。S N/T5 6 4 2.42 0 2 3S N/T5 6 4 2.42 0 2 3附 录 A(资料性)植物乳杆菌特异性基因序列片段 植物乳杆菌p l n F基因序列(部分)及引物设计示意图(G e n B a n k n o.A P 0 1 8 4 0 5.1)注:阴影部分分别为上下游引物序列,下划线部分为探针序列。320242465 T/NS