T∕CIFST 017-2023 葡萄球菌肠毒素测定 ELISA试剂盒法.pdf

前 言本文件按照G B/T1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国食品科学技术学会提出并归口。本文件起草单位:北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与健康所、澳优乳业(中国)有限公司、北京三元食品股份有限公司、拜发分析系统销售(北京)有限公司。本文件主要起草人:王迪、崔霞、张鹏航、陈倩、牛然、周钧、刘倩、陈历俊、刘继超、贺丽丽、葛丽花、廖冰君。T/C I F S T0 1 72 0 2 3葡萄球菌肠毒素测定 E L I S A试剂盒法1 范围本文件规定了食品及金黄色葡萄球菌培养液中葡萄球菌肠毒素测定的酶联免疫吸附E L I S A试剂盒方法。本文件适用于食品及金黄色葡萄球菌培养液中葡萄球菌肠毒素及其分型的定性测定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B4 7 8 9.1 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求3 方法原理样品中游离的葡萄球菌肠毒素(抗原)与微孔中包被的抗体特异性结合,形成抗原抗体复合物。将未与抗体结合的物质充分洗去,用酶标记物进行标记,在酶反应底物/发色剂的作用下,微孔中的液体由无色变为蓝色。反应结束后,加入终止液终止反应,这时微孔中的液体由蓝色变为黄色。使用酶标仪(4 5 0n m1 0n m)/(6 2 0n m1 0n m)测量微孔溶液的吸光度,样品中葡萄球菌肠毒素含量与吸光度成正比。4 设备和材料4.1 葡萄球菌肠毒素检测试剂盒R I D A S C R E E N S E TT o t a l(见附录A)。4.2 葡萄球菌肠毒素分型检测试剂盒R I D A S C R E E N S E TA、B、C、D、E(见附录B)。4.3 酶标仪:(4 5 0n m1 0n m)/(6 2 0n m1 0n m)。4.4 分析天平:感量0.0 1g。4.5 均质器/振荡器。4.6 培养箱:3 71。4.7 冷冻离心机:35 0 0r/m i n,1 0。4.8 离心管5 0m L:玻璃或聚丙烯材质。4.9 单道移液器:2 0L2 0 0L,1 0 0L10 0 0L。4.1 0 八道移液器:3 0L3 0 0L。4.1 1 冰箱:冷藏53,冷冻-1 8。4.1 2 p H计:2 5条件下精度为0.0 1。4.1 3 无菌滤膜:0.2 2m。1T/C I F S T0 1 72 0 2 34.1 4 无菌注射器:1 0m L。5 试剂和培养基5.1 实验用水:符合G B/T6 6 8 2规定的三级水要求。5.2 P B S缓冲液:8.7 0gN a C l、0.5 5gN a H2P O4H2O、2.8 5gN a2H P O42 H2O,用水定容至1L,调p H至7.4。5.3 1洗涤缓冲液:按照11 0比例稀释1 0洗涤缓冲液浓缩液。稀释后的1洗涤缓冲液可在28保存1周。若1 0洗涤缓冲液浓缩液稀释前有结晶,需在3 7水浴锅中加热至完全溶解后再配置。5.4 正庚烷:分析纯。5.5 脑心浸液培养基(B H I):1 0.0g胰蛋白胨、2.0g葡萄糖、5.0g牛心粉、5.0g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠(1 2 H2O),用水定容至1L,加热煮沸至完全溶解,分装试管,1 2 1高压灭菌1 5m i n备用。6 检测程序葡萄球菌肠毒素检测程序见图1。NFS799)8)F5*KU&-*4U99)85 299)85 24图1 葡萄球菌肠毒素检测程序7 操作步骤7.1 样品前处理7.1.1 食品样品7.1.1.1 液态样品(如生鲜乳、巴氏杀菌乳、调制乳、饮料等)充分混匀待检样品,吸取样品1 0m L2 5m L,35 0 0r/m i n1 0离心1 0m i n,完全去除脂肪层,取上清液进行检测,并将待检样品的p H控制在7.00.5范围内。7.1.1.2 粉状样品(如婴幼儿配方粉、乳粉、调制乳粉、食品原料等)2T/C I F S T0 1 72 0 2 3充分混匀待检样品,称取1 0g 2 5g进行均质之后称取1g加入1 0m L无菌蒸馏水,漩涡混匀,35 0 0r/m i n1 0离心1 0m i n,完全去除脂肪层,取上清液进行检测(结果以溶解后的液体计),并将待检样品的p H控制在7.00.5范围内。7.1.1.3 脂肪含量小于4 0%的样品(如米、面及其制品,豆制品等)充分混匀待检样品,称取1 0g 2 5g均质后按每克样品加入1.5m LP B S缓冲液的比例(例如1 0g样品+1 5m LP B S缓冲液),振荡混合1 5m i n,35 0 0r/m i n1 0离心1 0m i n,完全去除脂肪层,取上清液进行检测。7.1.1.4 脂肪含量大于等于4 0%的样品(如肉制品等)充分混匀待检样品,称取1 0g 2 5g均质后按每克样品加入1.5m LP B S缓冲液的比例(例如1 0g样品+1 5m LP B S缓冲液),振荡混合1 5m i n,35 0 0r/m i n1 0离心1 0m i n,取一定量上清液移至另一个离心管中,加入与所取上清液相同体积的正庚烷,充分混合5m i n,35 0 0r/m i n1 0离心1 0m i n,完全去除上层庚烷层,取下层清液进行检测。7.1.2 金黄色葡萄球菌培养液将纯培养的待测金黄色葡萄球菌接种于脑心浸液培养基(B H I)过夜培养。取1.5m L2m L培养液置于离心管中,35 0 0r/m i n1 0离心5m i n,将上清液用无菌注射器和无菌滤膜过滤除菌,取滤液进行检测。7.2 葡萄球菌肠毒素检测7.2.1 将预先包被有葡萄球菌肠毒素特异性抗体的微孔条(见附录A)插入微孔板架(见附录A),标记样品液、阴性质控液(见附录A)和阳性质控液(见附录A)的位置。7.2.2 在相应的微孔中分别加入1 0 0L处理好的样品液、阴性质控液及阳性质控液。盖上微孔板,3 53 7孵育1h。7.2.3 取出微孔板,倒去微孔中的液体,每个微孔加入3 0 0L 1洗涤缓冲液洗涤,混合静置后倒去洗涤液,拍干微孔板(力度适中)。重复上述步骤5次(可由自动洗板机完成)。7.2.4 洗板后,每个微孔加入1 0 0L酶标记物1溶液(见附录A),盖上微孔板,3 5 3 7 孵育1h。7.2.5 取出微孔板,进行第2次洗板(按照7.2.3操作)。7.2.6 洗板后,每个微孔加入1 0 0L酶标记物2溶液(见附录A),盖上微孔板,3 5 3 7 孵育3 0m i n。7.2.7 取出微孔板,进行第3次洗板(按照7.2.3操作)。7.2.8 洗板后,每个微孔加入1 0 0L底物/发色剂(见附录A),水平方向轻摇微孔板使微孔中的液体充分混合,盖上微孔板,3 53 7避光孵育1 5m i n。7.2.9 取出微孔板,每个微孔加入1 0 0L终止液,水平方向轻摇微孔板使微孔中的液体充分混合,3 0m i n之内读取(4 5 0n m1 0n m)/(6 2 0n m1 0n m)波长下吸光度(O D)。7.3 葡萄球菌肠毒素分型检测7.3.1 将预先包被有抗体的微孔板条(见附录B)按照AH的方向插入微孔板架(见附录B),每一件待测样品使用一条微孔板条。7.3.2 在微孔板条AG孔中各加入1 0 0L处理好的样品液,在H孔加入1 0 0L阳性质控液(见附录B),轻轻混匀后,盖上微孔板,3 53 7孵育1h。7.3.3 取出微孔板,倒去微孔中的液体,每个微孔加入3 0 0L1洗涤缓冲液洗涤,混合静置后倒去洗涤液,拍干微孔板(力度适中)。重复上述步骤5次(可由自动洗板机完成)。7.3.4 洗板后,每个微孔加入1 0 0L酶标记物1溶液(见附录B),盖上微孔板,3 53 7孵育1h。3T/C I F S T0 1 72 0 2 37.3.5 取出微孔板,进行第2次洗板(按照7.3.3操作)。7.3.6 洗板后,每个微孔加入1 0 0L酶标记物2溶液(见附录B),盖上微孔板,3 5 3 7 孵育3 0m i n。7.3.7 取出微孔板,进行第3次洗板(按照7.3.3操作)。7.3.8 洗板后,每个微孔加入1 0 0L底物/发色剂(见附录B),水平方向轻摇微孔板使微孔中的液体充分混合,盖上微孔板,3 53 7避光孵育1 5m i n。7.3.9 取出微孔板,每个微孔加入1 0 0L终止液,水平方向轻摇微孔板使微孔中的液体充分混合,3 0m i n之内读取(4 5 0n m1 0n m)/(6 2 0n m1 0n m)波长下吸光度(O D)。8 结果与报告8.1 检测有效性判定阳性质控孔的吸光度(O D)应1.0,阴性质控孔的吸光度(O D)应0.2,如果不能同时满足以上要求,检测结果无效。8.2 检出限8.2.1 食品样品:液态样品及溶解后的粉状样品0.2 5n g/m L,其他样品0.3 7 5n g/g(m L)。8.2.2 金黄色葡萄球菌培养液0.2 5n g/m L。8.3 临界值计算8.3.1 葡萄球菌肠毒素检测:临界值=阴性质控孔的吸光度(O D)+0.1 5。8.3.2 葡萄球菌肠毒素分型检测:临界值=F孔吸光度(O D)+G孔吸光度(O D)/2+0.1 5。8.4 结果判定及报告8.4.1 葡萄球菌肠毒素检测若结果显示样品吸光度(O D)临界值,报告未检出葡萄球菌肠毒素。若结果显示样品吸光度(O D)临界值,报告检出葡萄球菌肠毒素。8.4.2 葡萄球菌肠毒素分型检测若结果显示样品吸光度(O D)临界值,报告未检出某型葡萄球菌肠毒素。若结果显示样品吸光度(O D)临界值,报告检出某型葡萄球菌肠毒素。9 质量控制9.1 实验前应确认试剂盒有效期,如阳性质控孔的吸光度(O D)2.5时,需使用P B S缓冲液稀释检测样品,并重新进行检测,使其吸光度(O D)介于1.0到2.5之间。C.2 A/E孔或B/C孔吸光度(O D)均吸光度(O D)较高孔的吸光度(O D)的5 0%时,报告为样品中含有两种型别的葡萄球菌肠毒素。8T/C I F S T0 1 72 0 2 3