HJ 1344-2023 抗虫转基因植物对生物多样性影响评价技术导则（试行）.pdf

中华人民共和国国家生态环境标准HJ13442023抗虫转基因植物对生物多样性影响评价技术导则（试行）Technical guideline for biodiversity impact assessment of insect-resistanttransgenic plants(on trial)本电子版为正式标准文本，由生态环境部环境标准研究所审校排版。2023-12-29 发布2024-04-01 实施生态环境部发 布HJ 13442023i目次前言.1适用范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14评价原则.25评价程序.26背景资料.37评价内容.48调查方案.59评价结论判定.610风险管理策略和方案.611评价报告.6附录 A（资料性附录）不同生物种群或生物群落的调查方法.7附录 B（资料性附录）抗虫转基因植物对生物群落影响评价中部分生物多样性指标的计算公式.19HJ 13442023ii前言为贯彻中华人民共和国环境保护法中华人民共和国生物安全法中华人民共和国种子法，履行卡塔赫纳生物安全议定书，评价抗虫转基因植物可能对生物多样性产生的影响，制定本标准。本标准规定了抗虫转基因植物对生物多样性影响评价的原则、程序、内容和方法。本标准的附录 A 和附录 B 为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部自然生态保护司、法规与标准司组织制订。本标准主要起草单位：生态环境部南京环境科学研究所、中国环境科学研究院。本标准生态环境部 2023 年 12 月 29 日批准。本标准自 2024 年 4 月 1 日起实施。本标准由生态环境部解释。HJ 134420231抗虫转基因植物对生物多样性影响评价技术导则（试行）1适用范围本标准规定了抗虫转基因植物对生物多样性影响评价的原则、程序、内容和方法。本标准适用于在开放环境条件下进行生产性试验和生产应用的抗虫转基因植物对生物多样性影响的评价。2规范性引用文件本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 30989高通量基因测序技术规程GB/T 32722土壤质量土壤样品长期和短期保存指南GB/T 32725实验室测定微生物过程、生物量与多样性用土壤的好氧采集、处理及贮存指南HJ 710.1生物多样性观测技术导则陆生维管植物HJ 710.3生物多样性观测技术导则陆生哺乳动物HJ 710.4生物多样性观测技术导则鸟类HJ 710.6生物多样性观测技术导则两栖动物HJ 710.7生物多样性观测技术导则内陆水域鱼类HJ 710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物HJ 710.9生物多样性观测技术导则蝴蝶HJ 710.10生物多样性观测技术导则大中型土壤动物HJ 710.13生物多样性观测技术导则蜜蜂类农业部 953 号公告8.42007转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫水稻 第 4 部分：生物多样性影响农业部 953 号公告10.42007转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第 4 部分：生物多样性影响农业部 953 号公告12.42007转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫棉花 第 4 部分：生物多样性影响3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1抗虫转基因植物insect-resistant transgenic plants通过基因工程技术引入或修饰基因，改变受体植物基因组构成而培育出的具有抗虫性状的植物。HJ 1344202323.2靶标生物target organisms转基因抗虫性状所针对的生物。3.3非靶标生物non-target organisms抗虫转基因植物中转基因性状所针对的靶标生物以外的其他生物。3.4生物多样性biodiversity生物（动物、植物、微生物）与环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和，包括生态系统、物种和基因三个层次。本标准主要指调查区域内可能受到抗虫转基因植物影响的物种多样性。4评价原则4.1预先防范原则对于可能会对生物多样性产生不利影响的抗虫转基因植物，即使目前缺乏充分的试验证据，也应对该抗虫转基因植物的生物多样性影响进行评价，并采取适当措施预防可能出现的不利影响。评价区域存在重点保护物种等敏感对象（如农作物的野生近缘种）的，需要采取专门措施将抗虫转基因植物局限在最小影响范围内或者禁止转基因植物在该区域种植。4.2科学性原则必须基于严谨的科学态度、采用科学的方法和技术评价抗虫转基因植物对生物多样性的影响，对调查到的试验数据进行科学的统计分析，得出可验证的评价结果，并对评价结果进行科学的解释。4.3个案分析原则针对外源基因特征、受体植物类型、释放环境及用途、待调查生物的特性等，采用适当流程和方法，开展抗虫转基因植物对生物群落或特定生物种群的影响评价。4.4比较分析原则抗虫转基因植物对生物多样性影响评价需要以非转基因植物为对照，在条件一致的环境中进行比较和分析。5评价程序抗虫转基因植物对生物多样性的影响评价程序见图 1，一般包括如下 5 个步骤：a）收集和整理抗虫转基因植物的相关生物学背景资料、种植状况和管理措施等信息；b）确定生物多样性调查的对象、区域、时间和方法；c）根据评价目的开展群落或者种群水平生物多样性调查，包括对自然保护地等环境中可能受到抗虫转基因植物影响的重点保护物种、极小种群动植物进行调查；d）判断抗虫转基因植物对生物群落或特定生物种群是否具有显著影响。如果评价结果显示抗虫转基因植物对生物群落或特定生物种群无显著影响，则进入确定评价结论环节；如果评价结果显示抗虫转基因植物对生物群落或特定生物种群具有显著影响，则进一步判断该影响的范围、持续性、程度、原因等是否明确，如未明确则继续开展资料收集和调查，直至明确影响的范围、HJ 134420233持续性、程度、原因等才可以进入确定评价结论环节；e）确定评价结论，编制评价报告。图 1抗虫转基因植物对生物多样性影响评价程序6背景资料6.1受体植物受体植物的背景资料主要包括：a）学名、分类学地位、生物学特性和进化史；b）原产地及引进时间，用途和在国内的应用情况；c）对人体健康和生态环境的安全性记录；d）生活史和在自然界中生存繁殖的能力；e）在国内的地理分布和自然生境，生长发育、繁殖所要求的生态环境条件；f）遗传变异和遗传稳定性，监测方法和监控的可能性；g）在无法获得受体植物时，可参考上述要求调查非转基因对照植物的有关背景资料。6.2基因操作基因操作方面的背景资料主要包括：a）引入或修饰基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列及其功能和安全性；b）引入或修饰基因序列在植物细胞中的定位及其确定方法；c）引入或修饰基因表达的器官和组织，如根、茎、叶、花、果、种子等；否否是步骤 1：收集和整理抗虫转基因植物的相关生物学背景资料及种植状况等信息步骤 2：确定生物多样性调查的对象、区域、时间和方法步骤 3：群落或种群水平生物多样性调查步骤 5：确定抗虫转基因植物对生物多样性影响的评价结论，编制评价报告步骤 4：对生物群落或特定生物种群是否具有显著影响判断显著影响的持续性、程度、原因等是否明确是HJ 134420234d）引入或修饰基因表达的稳定性；e）其他类型的基因操作。6.3抗虫转基因植物抗虫转基因植物的背景资料主要包括：a）抗虫性；b）杂草性和入侵性；c）基因漂移及其环境影响；d）种植情况；e）耕作栽培措施的变化。6.4种植区域生物多样性本底种植区域生物多样性本底的背景资料主要包括：a）生境特征（如土壤性质、气象特点、生态类型）；b）植物物种多样性；c）动物物种多样性；d）土壤微生物多样性；e）其他可能涉及的生物物种多样性。7评价内容7.1对主要靶标生物的影响评价抗虫转基因植物对主要靶标生物生长发育、繁殖、种群动态的影响。7.2对物种多样性的影响对物种多样性的影响评价应包括以下内容：a）优势种种群动态；b）指示种种群动态；c）具有重要经济价值、生态价值、文化价值、观赏价值等物种种群动态；d）国家重点保护物种、极小种群动植物、特有种等种群动态；e）其他可能涉及的物种多样性动态。7.3对生物群落多样性的影响对生物群落多样性的影响评价应包括以下内容：a）草本、木本等植物群落多样性；b）植食性、捕食性、寄生性、腐生性等动物群落多样性；c）细菌、真菌等微生物群落多样性；d）其他可能涉及的生物群落多样性。HJ 1344202358调查方案8.1一般要求评价抗虫转基因植物对生物多样性影响的调查方案一般包括调查对象、调查区域和采样点、调查时间和频次、调查内容、调查方法等。8.2调查对象直接或者间接暴露于抗虫转基因植物的生物，主要包括取食抗虫转基因植物的动物、生存于抗虫转基因植物内部和表面的微生物。8.3调查区域和采样点调查区域主要为抗虫转基因植物生长地及周边的农田、林地、水体。采样点应具有所评价环境中生物多样性的代表性；采样点面积应根据抗虫转基因植物的生物学特性、对生物多样性影响的方式和特点、调查对象的生长繁殖特性等确定；采样点数量应满足统计学的基本要求。8.4调查时间和频次根据抗虫转基因植物的生活周期确定调查时间和频次。短期影响应进行 3 次以上的调查，调查时间应包括抗虫转基因植物的旺盛生长期和抗虫基因表达高峰期。中长期影响应进行不少于 5 年的调查，可根据抗虫转基因植物的生活周期，每年在其重要生长阶段（如苗期、花期、结实期、收获期）进行调查。8.5调查内容及方法8.5.1调查内容8.5.1.1靶标生物多样性在抗虫转基因植物及其对照植物的主要生育期，调查主要靶标生物的种类及其落卵量、幼虫龄期和数量、为害率等。8.5.1.2非靶标生物物种多样性8.5.1.2.1优势种在抗虫转基因植物及其对照植物的主要生育期，调查优势种的种类、数量、密度和分布等。8.5.1.2.2指示种在抗虫转基因植物及其对照植物的主要生育期，调查指示种的种类、数量、密度和分布等。8.5.1.2.3具有重要经济价值、生态价值、文化价值、观赏价值的物种在抗虫转基因植物及其对照植物的主要生育期，调查具有重要经济价值、生态价值、文化价值、观赏价值等物种的种类、数量、密度和分布等。HJ 1344202368.5.1.2.4国家重点保护物种、极小种群动植物、特有种在抗虫转基因植物及其对照植物的主要生育期，调查国家重点保护物种、极小种群动植物、特有种的种类、数量、密度和分布等。8.5.1.3非靶标生物群落多样性8.5.1.3.1草本、木本等植物群落多样性调查主要草本、木本等植物的种类、数量、高度、盖度、生长状态、群落结构等。8.5.1.3.2植食性、捕食性、寄生性、腐生性等动物群落多样性调查主要植食性、捕食性、寄生性、腐生性等动物的种类、数量、密度、群落结构和分布等。8.5.1.3.3土壤细菌、真菌等微生物群落多样性调查土壤细菌、真菌等微生物的种类及其数量。8.5.2调查方法应根据评价时间、调查内容和调查对象生物学特性的不同，确定具体的调查方法。不同生物种群或生物群落的调查方法可参考附录 A。抗虫转基因植物对生物群落影响评价中主要生物多样性指标的计算公式见附录 B。9评价结论判定采用方差分析等统计学方法对根据本标准“7 评价内容”和“8 调查方案”获得的调查数据进行统计分析，得到抗虫转基因植物生长区域与受体植物（或非转基因对照植物）生长区域的生物多样性指标之间差异显著性检验结果，再结合本标准“6 背景资料”的信息对评价结果进行分析，综合给出抗虫转基因植物对生物多样性影响的评价结论，以及评价的置信度、不确定性因素、其它支持评价结果的证据、评价结果的解释等。10风险管理策略和方案根据评价结论制订风险管理策略，并提出预防和控制抗虫转基因植物对生物多样性可能产生不利影响的风险管理内容和方案等。11评价报告抗虫转基因植物对生物多样性影响的评价报告应包括但不限于以下内容：a）抗虫转基因植物的背景资料；b）评价单位的能力与经验的陈述或相关证明，实施评价的人员情况；c）评价的时间、地点及环境状况等；d）调查方案（包括调查内容、调查方法等）；e）抗虫转基因植物对生物多样性影响评价的主要过程及其结论；f）建议采用的风险管理策略、内容和方案等。HJ 134420237附录A（资料性附录）不同生物种群或生物群落的调查方法A.1植物按照 HJ 710.1、农业部 953 号公告8.42007、农业部 953 号公告10.42007 等标准中规定的方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内及周围自然环境中的植物。A.1.1调查样方的设置在抗虫转基因植物和受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内，以及生长区域周边（距离生长区 100 m300 m 范围内）生境中同时设置样方。对于森林植物群落，在选定建立调查样地的位置时，用森林罗盘仪确定样地的方向（一般是正南北方向）和基线，然后用经纬仪（全站仪）将样地划分为 20 m20 m 样方；记录测量点之间的水平距、斜距和高差；对每个样方的顶点编号并永久标记；最后，用卷尺、测绳或便携式激光测距仪将每个 20 m20 m 样方划分为 5 m5 m 小样方，样方顶点用临时 PVC 管标记，边界用塑料绳或其他材料临时标记，这些 5 m5 m 样方作为基本调查单元；调查任务完成后将这些临时标记全部移除，并作无害化处理。一般调查样地面积（垂直投影面积）50 hm2的设 3 个样方，50 hm2500 hm2的设 5个样方；若面积500 hm2，每增加 100 hm2增设 1 个样方，但总样方数量一般控制在 10 个以内。对于农田植物群落，在选定的调查区域用卷尺或定制的模具设置 1 m1 m 或 2 m2 m 的样方，对样方的顶点编号并永久标记，边界用塑料绳或其他材料临时标记。调查的样方数量一般应不少于 5个 1 m1 m 或 2 m2 m 的样方。A.1.2森林植物调查在设置的样方中采用目测估计法进行乔木、灌木、草本等植物种类调查。所有个体应鉴定到种水平，对调查现场不能鉴定或有疑问的种，须采集标本、拍照、记录植物个体编号，请分类专家鉴定。对于抗虫转基因植物及其对照植物的主要伴生种，应该调查该种的胸径或基径、冠幅、生长状态、盖度等。A.1.3农田植物调查在设置的样方中采用目测估计法进行植物种类调查。所有个体应鉴定到种水平，对调查现场不能鉴定或有疑问的种，须采集标本、拍照、记录植物个体编号，请分类专家鉴定。对于抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）的主要伴生种，应该调查该种的多度、平均高度和冠幅、生活力、盖度等。HJ 134420238A.2土壤微生物按照 GB/T 30989、GB/T 32722、GB/T 32725 等技术标准中规定的土壤样品采集和保存、微生物测定方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内的土壤微生物。A.2.1样品采集在抗虫转基因植物及其对照植物生长区域采集根际土和根围土，采集深度主要取决于植物种类：一般农作物为 020 cm，果林类作物为 060 cm。为了保证样品的代表性，采取采集混合样的方案。每个采样区可以是自然分割的一个田块，也可以由多个田块所构成，范围不小于 400 m2（20 m20 m），采样区采用对角线、梅花点、棋盘式或蛇形取样法调查 5 个样点，每点 12 株植物。采样前应去除地表植被、苔藓及凋落物，采样时还需去除土壤中植物的根系、碎片、落叶及土壤动物等肉眼可见的生物材料。A.2.2样品贮存土壤样品应避光通气贮存，用于磷脂脂肪酸（PLFA）分析以及高通量测序的样品应在-20条件下保存。A.2.3微生物多样性分析A.2.3.1磷脂脂肪酸法土壤微生物中脂类的提取采用 Bligh&Dyer 提取法，受试土壤经土壤提取液振荡分离去除水相，有机相和悬浮液经干燥后形成脂类提取物。磷脂脂肪酸的提取方法：将脂类提取物通过硅胶柱分离后，经中度碱水解，使磷脂转化为脂肪酸甲酯。利用固相萃取柱（包括强阳离子交换柱和氨丙基柱）将脂肪酸甲酯分离为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、非酯链未取代脂肪酸和非酯链羟基取代脂肪酸，将不同的脂肪酸经衍生化后用于气相测定。磷脂醚酯的提取方法：将脂类提取物通过硅胶柱分离后，经酸水解断裂磷脂的极性基团以获得醚酯，经氢碘酸断裂醚键来释放醚酯中的醚键烃类（如碘代烷烃），最后通过锌粉还原脱卤后转化为磷脂醚酯用于气相测定。将不同的磷脂脂肪酸/磷脂醚酯采用气相色谱/质谱进行分析测定，利用色谱分析软件对各组分进行定性与定量分析。总微生物量可通过土壤总磷脂脂肪酸含量进行估算。不同的脂肪酸甲酯含量可用摩尔百分比表示。不同土壤类型或不同处理土壤之间的磷脂脂肪酸含量变化可采用主成分分析法进一步分析相关性。A.2.3.2高通量测序法将提取的土壤微生物 DNA 进行高通量测序。扩增引物基于细菌 16SrRNA 和真菌 18SrRNA 的保守区域片段（引物序列见表 A.1），通过测序获得样本的细菌 16SrRNA 和真菌 18SrRNA 的保守区域片段的序列信息，利用 Mothur、QIIME 或 R 软件与数据库中来源明确、鉴定可靠的细菌和真菌基因序列相比对，以确定不同土壤微生物种类。HJ 134420239表 A.1扩增细菌 16SrRNA 和真菌 18SrRNA 保守区域片段的引物序列分类引物类型引物名称引物序列片段大小细菌16S V1-V38F5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3520 bp533R5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-316S V3-V5357F5-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3560 bp926R5-AAACTYAAAKGAATTGACGG-316S V4520F5-AYTGGGYDTAAAGNG-3280 bp802R5-TACHVGGGTWTCTAATCC-316S V4-V5515F5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3420 bp907R5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-316S V3-V4338F5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3480 bp806R5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3真菌ITS1ITS5F5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3350 bpITS1R5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3ITS2ITS3F5-GCATCGATGAAGAACGCGC-3400 bpITS4R5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3A.3地上节肢动物参照 HJ 710.9、HJ 710.13、农业部 953 号公告8.42007、农业部 953 号公告10.42007、农业部 953 号公告12.42007 等技术标准中规定的方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内的昆虫等地上节肢动物。A.3.1直接观察法在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小调查区域，调查区域应不小于 150 m2或覆盖植株数不少于 100 株，每小区采用对角线或棋盘式取样法调查 5 个样点，每点调查至少 5 株植物。采用目测法调查整个植株或单个枝叶及植株附近地面各种节肢动物的数量、种类和发育阶段。对田间不易识别的种类进行采样标记，放入 75%乙醇溶液保存，供进一步鉴定。A.3.2吸虫器调查法在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小调查区域，调查区域应不小于 150 m2或覆盖植株数不少于 100 株，每小区采用对角线或棋盘式取样法调查 5 个样点。每点用吸虫器吸取至少 5 株植物或枝叶（全株）及其地面 1 m2范围内的所有节肢动物种类。将抽取的样品带回室内清理和初步分类后，放入 75%乙醇溶液保存，供进一步鉴定。A.3.3陷阱法在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小调查区域，调查区域应不小于 150 m2或覆盖植株数不少于 100 株，每小区采用对角线或棋盘式取样法调查 5 个样点，每点设置一个陷阱。陷阱结构是：使用 3 个塑料杯（15 cm10 cm），间隔 0.5 m，埋入土壤中作为陷阱，杯口与地面相平，每个陷阱上都有用铁丝支撑的塑料碗做棚。杯中放有浓度为 5%的洗涤剂水，不超过杯容积的 1/3。HJ 1344202310在埋杯第 2 d 调查杯中的节肢动物种类和数量，不易识别的种类编号后放入 75%乙醇溶液保存，供进一步鉴定。A.3.4诱捕法在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小调查区域，调查区域应不小于 150 m2或覆盖植株数不少于 100 株，每小区采用对角线或棋盘式取样法调查样点，每 150 m2设置 2 至 3 个专用诱捕器，各诱捕器间距离 20 m 左右，在每个诱捕器内放置一定量的性诱剂或食物。甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等大型昆虫在距离植物顶部 20 cm 左右放置专用诱捕器；小菜蛾等体型相对较小的昆虫于靠近植物顶部处放置专用诱捕器。诱捕器使用转换接口外接容器（如可乐瓶）作为贮虫设备。诱虫点每月更换一次以保证诱虫效果，通过统计单瓶诱虫量，监测昆虫种类和数量动态变化。A.3.5振落法在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小调查区域。调查区域应不小于 150 m2或覆盖植株数不少于 100 株，每小区采用对角线或棋盘式取样法调查 5 个样点，每点至少调查 5 株植物；对于高大树木上的昆虫，可用振落的方法进行捕捉。其方法是：先在树下铺上白布，然后摇动或敲打树枝树叶，利用昆虫的假死习性，将其振落到白布上进行收集。用这种方法可以采集到鞘翅目（Coleoptera）、脉翅目（Neuroptera）和半翅目（Hemiptera）的许多种类昆虫。有些没有假死习性的昆虫，可在振动后的飞行过程中用网捕捉。A.3.6网捕法A.3.6.1空网法、扫网法和刮网法根据用处不同制作空网、扫网和刮网。网口直径通常为 1/3 m，网长 2/3 m，手柄 1 至数 m。空网：用透气、坚韧、浅色的珠罗纱、尼龙纱等制成，专门用来采集蝴蝶、蜂类、蜻蜓等飞翔迅速的昆虫。扫网：用来扫捕树丛、杂草中隐蔽的昆虫，采用较结实的白布或亚麻布制作网袋，网框和网柄都要选择坚固的材料，以承受扫网时较大的阻力。刮网：在树皮上采集昆虫时，可用粗铝丝作架，前面连接上一段有弹性的钢条，缝上白布的网袋，底端可捆上个小瓶，以便接虫。在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小的调查区域，但应不小于 150 m2或覆盖植株数不少于 100 株，每小区采用对角线或棋盘式取样法调查 5 个样点，使用合适的捕虫网对至少 5 株植物上的节肢动物进行采集，每次收集的标本均按号放入 75%乙醇溶液保存，供进一步鉴定。A.3.6.2马来氏网法在转基因植物生长旺盛期，根据不同调查对象，设置不同大小调查区域，但应不小于 400 m2（20 m20 m）或覆盖植株数不少于 100 株。马来氏网选用国际通用的马来氏网型和型。马来氏网型前部高 180 cm，后部高 110 cm，长165 cm，宽 116 cm；马来氏网型前部高 180 cm，后部高 110 cm，长 165 cm，宽 180 cm；材质选用聚乙烯 100 目以上纱网布，网布高度 110 cm 以下部分网为黑色，110 cm 以上部分为白色，网纱在前部与昆虫收集器之间紧密连接，并留有直径 3 cm4 cm 的收集孔；收集器分为上下两部分，上部与网体连通，下部用于盛放无水乙醇收集液且可替换。在布设马来氏网时，确保中部开口部分朝向样点区域，如需多个马来氏网，间隔应大于 500 m。收集瓶内应灌满无水乙醇，每 10 d15 d 取样一次，取样时将收集瓶拧下并迅速拧紧瓶盖，每次收集的标本均按号放入 75%乙醇溶液保存，供进一步鉴定。HJ 1344202311A.4浮游动物A.4.1采样点布设原则调查区域为抗虫转基因植物种植区的农田水体以及周边灌溉水、池塘、湖泊等自然水域。根据水域的面积和形态、浮游动物的生态分布特点等决定采样点数量（表 A.2）。采样点应有代表性，能反映整个水体浮游动物的基本情况。表 A.2采样点数量设置水域面积（km2）采样点数量（个）23253552057205071050100101510050015205002030A.4.2采样定量样品应在定性采样之前用采水器采集。每个采样点应采水样 1000 ml。分层采样时，可将各层水样分别定量取平均值，或将各层所采水样等量混匀后取 1000 ml 再定量，作为此点的定量样品。枝角类和桡足类动物的定量样品应在定性采样之前用采水器采集，每个采样点应采水样10000 ml50000 ml，再用 25 号浮游植物网过滤浓缩至 100 ml，用 37%40%（V/V）甲醛溶液固定，用量为水样体积的 5%。原生动物、轮虫和无节幼体定量样品，可采集 10000 ml50000 ml 水样混合后，除留一部分供活体观察不固定外，其余立即用鲁哥氏液固定，用量为水样体积的 1%1.5%（V/V）。如样品需较长时间保存，则需加入 37%40%（V/V）甲醛溶液，用量为水样体积的 4%（V/V）。A.4.3水样的沉淀和浓缩原生动物和轮虫样品固定后，静置沉淀 24 h。虹吸浓缩后的水量多少视原生动物和轮虫浓度大小而定，一般情况下可用透明度作参考，根据透明度确定水样浓缩体积见表 A.3。表 A.3根据透明度确定水样浓缩体积的方法透明度（cm）1 L 水样浓缩后的体积（ml）10030505010010050305050010020301000（不浓缩）201000（稀释）枝角类和桡足类动物常用过滤法浓缩水样。HJ 1344202312A.4.4计数依据调查对象、样品体积和具体情况，取水样进行种类鉴定、个体计数和室内分析。A.4.5浮游动物生物量的测定原生动物、轮虫可根据体积法求得生物量；枝角类和桡足类可用体长-体重回归方程求得体重（湿重），也可用电子天平直接称重。A.5土壤动物在抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域划分网格，按照 HJ 710.10 中规定的简单随机抽样法确定样方，每个调查对象不少于 3 个样方，每个样方不小于 5 m5 m，样方间距离不小于 10 m。每样方内按照随机或者均匀设置 5 个样点，样点需包含或紧邻被评价的植物。A.5.1大型土壤动物每个样点调查面积不小于 1 m1 m0.2 m（长宽深），利用铁铲等工具将被调查样点土块快速取出，通过目视手检法对大型土壤动物种类和数量鉴别统计。对于不能够准确鉴别的动物，应保存于 75%乙醇或防压标本盒中，在实验室中进一步鉴定。蚯蚓等环节动物是土壤质量与生态功能的指示类群，在调查中应当重点关注。A.5.2中型土壤动物每个样点调查面积不小于 0.2 m0.2 m（长宽）土壤，采用取土器（半径 2.5 cm）钻取 00.2 m土层，每样点三点取样，混匀后迅速带回实验室分离鉴定中、小型土壤动物，土壤样品的运输保存按照 GB/T 32722 执行。利用高温高梯度 Tullgren 干法设备（筛网网眼为 2 mm），将土壤动物（主要分离小节肢类土壤动物类群）从土壤样品中分离出来。收集温度：从 20 开始，每 12 h 升高 5，升到 40 为止，共持续 48 h。用 Torne 氏收集液（1000 ml 异丙醇，30 ml 冰醋酸，3 ml 福尔马林）收集，然后转移到 75%的乙醇中。A.5.3小型土壤动物土壤样品采集方法按照 A.5.2 进行。利用 Baermann 浅盘法，将筛盘（网眼为 2 mm）放入相应的浅盘中，在筛盘上放置一层滤纸，称取 20 g50 g 的样土（视土壤动物的密度而定），均匀铺在滤纸上，小心加水至浸没土壤，置于 20 室温条件下分离。12 h 时，可直接取浅盘上层水体，直接显微镜观察原生动物数量和种类。48 h 后，用筛盘（网眼为 25 m）对浅盘中的水进行过筛，冲洗，将收集的土壤动物（主要为线虫等类群）保存于 75%的乙醇。A.6两栖动物按照 HJ 710.6 中规定的方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内的两栖动物。A.6.1样线法根据两栖动物分布与生境因素的关系，如海拔梯度、植被类型、水域状态等设置样线。样线尽可能涵盖不同生态系统类型。调查应在太阳落山一小时后开展，每次调查应重复 3 d。HJ 1344202313在农田或农田与自然生态系统交接区，可采用长样线，长度 500 m1000 m 之间；在生境较为复杂的自然生态系统，可设置多条短样线，每条样线长度 20 m100 m 之间。每个调查样地的样线应在7 条以内，短样线可适当增加数量。样线的宽度根据视野情况而定，一般为 2 m6 m。调查时速度应保持在 2 km/h 左右，行进期间记录物种（成体、幼体、蝌蚪和卵）和个体数量，不宜拍照和采集。A.6.2样方法在调查样地内随机或均匀设置一定数量的样方，样方应尽可能涵盖不同的生境类型和环境梯度。样方一般设置为方形，大小可设置成 5 m5 m 或 10 m10 m。样方之间应间隔 100 m 以上。每个观测样地的样方数应在 7 个以上。依次翻开样方内的石块，检视石块下的个体（包括卵），记录样方内见到的所有两栖动物种类和个体数量。A.6.3人工庇护所法在调查区内随机设置 3 个 10 m10 m 的样方，样方之间应间隔 100 m 以上。在每个样方内，挑选树蛙常选择的产卵树 10 株，每株树捆绑固定 6 个竹筒（或 PVC 桶），2 个在地面，2 个离地面 70 cm，2 个离地面 150 cm，共布设 60 个竹筒（或 PVC 桶）。竹筒长 15 cm18 cm，内径 3 cm6 cm，竹筒内加入 5 cm10 cm 深的水。每 3 d 巡视检查一次，记录两栖动物的种类以及成体、亚成体、幼体、蝌蚪和卵的数量。连续进行 3 次。A.6.4人工覆盖物法根据统计分析的要求和两栖动物物种个体大小、种群数量等因素确定人工覆盖物的数目和尺寸。人工覆盖物的材料为木板或波浪状瓦片较好。尺寸一般为 30 cm20 cm 或以上。样地内应采用统一的覆盖物。人工覆盖物的排列方式一般设置成平行线、网格等形状。网格形状的排列方式可采用 5 个5 个覆盖物的样方，覆盖物之间的间距为 5 m。可在放置覆盖物的地方下挖 5 cm，形成足够的隐蔽空间，坑底铺放一些草叶，形成一个适宜的隐蔽环境。每天早晨 810 时查看一次。查看时迅速拿起覆盖物，捕获匿居其下的两栖动物，并临时放在塑料袋或广口瓶中以备测量、标记和采样。A.7底栖动物A.7.1调查样地的设置调查区域为抗虫转基因植物及对照植物种植区的农田水体以及周边灌溉水、池塘、湖泊等自然水域。根据调查水体（水田或者沟渠等）的形态特点、底质类型和底栖无脊椎动物的分布特征等因素，在调查水体内设置若干具有代表性的样线，使同一样线上的差异程度尽可能小，在同一样线上每隔一定距离设置一个采样点。A.7.2样品采集使用底泥采泥器采集泥样。采样时每个采样点累计采样面积 1/8 m21/3 m2。即使用 1/16 m2的彼得生采泥器或改良的彼得生采泥器（1/12 m2），采泥 24 次，采样厚度一般为 10 cm15 cm。A.7.2.1大型底栖动物参照 HJ 710.8 中规定的方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内的淡水底栖大型无脊椎动物。HJ 1344202314将获得的底泥样品置于 40 目筛中，在清水中轻轻摇荡，洗去样品中剩余的污泥，筛洗后挑出其中的杂物和植物枝条、叶片等（仔细检查并拣出掺杂在其中的动物），将筛上肉眼能看得见的全部样品倒入白瓷盘中进行分拣，同时利用解剖镜等工具进行物种分类，并记录大型底栖动物数量；如不能够及时分选鉴定，应将初步淘洗后的样品保存于 70%乙醇中，可参考相关工具书或在相关分类学家的指导下，对样品进行形态分类和物种鉴别。A.7.2.2小型底栖动物将获得的底泥层置于上层为 40 目、下层为 325 目的套筛中，在清水中轻轻摇荡，洗去样品中剩余的污泥。中间截留物用于小型底栖动物的分离，如不能够立即操作，将中间截留物保存于浓度为 5%的福尔马林溶液中。采用 ludox 离心分选法分离小型底栖动物：将中间截留物倒入离心管中，再加入4 倍体积的 ludox HS-40 凝胶（密度约为 1.2 g/ml），2000 rpm 离心约 5 min，完成后将离心管中上清液倒在 325 目的网筛上，用自来水冲洗干净。重复上述步骤三次。将网筛（包括截留物）放入含有 0.1%虎红溶液的染色缸中染色 1 h 后，自来水洗净。用吸管将染色后截留物转移到玻璃平皿中，于体视显微镜或解剖镜下对小型底栖动物鉴定并计数。A.8鱼类按照 HJ 710.7 中规定的方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内的内陆水域鱼类。A.8.1调查样地的设置根据待调查区域的水体底质、水生植物组成、水深、水体形态、水流等因素划分成若干小区，使同一小区内变异程度尽可能小。小区的面积和数量可根据调查水体的面积、形态和生境特征、工作条件、经费情况等因素确定。一般设置的小区数量不少于 3 个。A.8.2捕捞调查法根据调查水体的形态以及生境特征等因素，利用合适的网具进行捕捞，鉴定记录鱼类的种类和数量。对那些现场无法鉴定的物种，要尽可能采集完整的标本并做好记录，包括文字、影像和北斗定位系统记录，以备室内鉴定之用。应尽可能记录各物种所有能观察到的形态、生物学现状和生态环境信息等。在调查过程中注意收集标本及其他相关资料，并记录相关信息，保留作为凭证以备核查。A.9鸟类按照 HJ 710.4 中规定的方法，调查抗虫转基因植物及其受体植物（或非转基因对照植物）生长区域内的鸟类。应根据待调查区域内鸟类活动高峰期确定一天中的调查时间。调查时的天气应为晴天或多云天气，雨天或大风天气不能开展调查。一般在早晨日出后 3 小时内和傍晚日落前 3 小时内进行调查。需准备812 倍的双筒望远镜（用于行走时或在树林中调查近距离的鸟类）、2560 倍单筒望远镜（用于调查远距离且较长时间停留在某地的鸟类）、鸟类野外手册或鸟类图鉴等工具书、野外记录表、照相机、北斗卫星定位仪、温度计、必要的防护用品和应急药品等。HJ 1344202315A.9.1分区直数法根据地貌、地形或生境类型对整个调查区域进行分区，逐一统计各个分区中的鸟类种类和数量，得出调查区域内鸟类总种数及其个体数量。该方法适用于较小面积的抗虫转基因植物种植区的鸟类调查。A.9.2样线法根据生境类型和地形设置样线，各样线互不重叠，调查者沿着固定的线路行走，并记录样线两侧所见到的鸟类。每种生境类型的样线在 2 条以上，每条样线长度以 1 km3 km 为宜，若因地形限制，样线长度不应小于 1 km。调查时行进速度通常为 1.5 km/h3 km/h。根据对样线两侧调查记录范围的限定，样线法又分为不限宽度、固定宽度和可变宽度 3 种方法。不限宽度样线法即不考虑鸟类与样线的距离，固定宽度样线法即记录样线两侧固定距离内的鸟类，可变宽度样线法需记录鸟类与样线的垂直距离。该方法适用于大规模抗虫转基因植物种植区的鸟类调查。A.9.3样点法样点法是样线法的一种变形，即调查者行走速度为零的样线法。以固定距离设置调查样点，样点之间的距离应根据生境类型确定，一般在 0.2 km 以上，在每个样点调查 3 min10 min。根据对样点周围调查记录范围的界定，样点法又分为不限半径、固定半径和可变半径 3 种方法。不限半径样点法即调查时不考虑鸟类与样点的距离，固定半径样点法即记录样点周围固定距离内的鸟类，可变半径样点法需记录鸟类与样点的距离。样点法更适合在崎岖的山地或抗虫转基因植物种植片段化的生境中使用。A.9.4红外相机自动拍摄法红外感应自动照相机能拍摄到活动隐蔽的地面活动鸟类。安置红外相机前，应调查鸟类的活动区域和日常活动路线。尽量将相机安置在目标动物经常出没的通道上或其活动痕迹密集处。可采用分层抽样法或系统抽样法设置观测样点。分层抽样法中，每种生境类型设置 7 个以上样点（样点之间间距 0.5 km 以上）。系统抽样法中，在观测样